Preparação, Imaging, e quantificação de Motilidade Ensaios superfície da bactéria
7 de abril de 2015
A motilidade de enxameação é influenciada por fatores físicos e ambientais. Descrevemos um protocolo de duas fases e diretrizes para contornar os desafios comumente associados à preparação do ensaio de enxame e à coleta de dados. Uma técnica de imagem macroscópica é empregada para obter informações detalhadas sobre o comportamento do enxame que não são fornecidas pelas técnicas de análise atuais.
O objetivo geral deste procedimento é visualizar e quantificar a motilidade da superfície bacteriana chamada enxameação de maneira padrão e reprodutível. Isso é feito primeiro preparando e curando as placas de motilidade da superfície. O segundo passo é inocular as placas de ensaio de motilidade superficial com bactérias e incubar essas placas em um ambiente controlado.
Em seguida, os padrões de crescimento bacteriano nos ensaios de placa são visualizados em tempo real. A etapa final do procedimento é processar as imagens para quantificação. Em última análise, este procedimento fornece um protocolo padronizado para a preparação do ensaio da placa de motilidade da superfície para gerar informações dinâmicas quantitativas, como taxa de expansão do enxame ou distribuição de densidade de bioproduto para bactérias modais de superfície.
Muitos grupos realizam ensaios de motilidade de superfície. A principal vantagem dessa técnica é que fornecemos um protocolo sistemático que minimiza as múltiplas variáveis que podem levar à inconsistência. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da motilidade da superfície bacteriana, como a forma como as bactérias colonizam diferentes tipos de superfícies.
Embora este método possa fornecer informações sobre a motilidade do enxame de pseudomonas com algumas modificações, ele também pode ser aplicado para estudar outras bactérias modais de superfície. Geralmente, os indivíduos novos neste método terão dificuldades porque pequenas mudanças no protocolo ou no ambiente de laboratório podem influenciar muito os resultados do ensaio de enxame. Demonstrando o procedimento estará Morgan, um estudante de pós-graduação do meu laboratório.
Para iniciar o protocolo, prepare uma mistura agrícola combinando 200 mililitros de FAB menos meio de enxame de sulfato de amônio, 0,9 gramas de ágar nobre e 0,2 gramas de ácidos caino em uma garrafa de 500 mililitros. Use uma placa de agitação para misturar bem a mídia. Em seguida, esterilize a mídia em uma autoclave ajustada a 121,1 graus Celsius por 22 minutos com uma opção de ventilação rápida.
Imediatamente após a esterilização, aperte a tampa do frasco de mídia para evitar a evaporação da água. Coloque a mídia em uma placa de agitação magnética e resfrie o DEA a 50 graus Celsius em um ambiente de temperatura ambiente com agitação ativa. Se o ágar for usado em um momento experimental posterior, ele pode ser mantido aquecido em banho-maria a 60 graus Celsius ou em uma incubadora por 15 horas sem agitação ativa.
Quando o meio atingir aproximadamente 50 graus Celsius a dois mililitros de glicose esterilizada por filtro, usando técnicas estéreis padrão, misture bem com a barra de agitação magnética para evitar a formação de bolhas no meio. Em um exaustor, use uma pipeta sorológica estéril para alíquota de 7,5 mililitros do edia em placas de Petri individuais de 60 milímetros. Se uma área de superfície de enxame maior for desejada, alíquota de 25 litros de edia em placas de Petri de 100 milímetros.
Deixe todos os pratos desempilhados e verifique o exaustor com um nível de alvo para garantir uma superfície horizontal uniforme para o ágar solidificar. Para placas de 60 milímetros, reserve as tampas dos pratos e cure o ágar descoberto no capô por 30 minutos. Pratos maiores de 100 milímetros exigirão um tempo de cura mais longo.
A umidade, o fluxo de ar e a temperatura de um determinado laboratório podem exigir o teste do tempo de cura para a enxameação ideal de sua bactéria. Após a secagem, os APLs devem ser imediatamente inoculados com células que foram pré-cultivadas separadamente para a fase de crescimento desejada. Para começar, escolha uma colônia de bactérias isolada de uma placa LB fresca e inocule em seis mililitros de cultura. Mídia.
Incube a cultura durante a noite a 37 graus Celsius com agitação horizontal. No dia seguinte, inocular de um a cinco microlitros da cultura durante a noite sobre as placas de ágar de enxame secas, cutucando a superfície do ágar com um palito de dente estéril ou agulha de inoculação de arame, dependendo da cepa da bactéria, transferir as placas de ensaio de enxame para uma incubadora com uma temperatura definida para 30 graus Celsius, 37 graus Celsius, ou 42 graus Celsius. Inverta as placas de modo que o excesso de umidade se condense na tampa da placa e não no ágar, equilibre as bactérias em temperaturas específicas da cepa por duas ou quatro horas antes da imagem de lapso de tempo.
Em seguida, transfira as placas para a unidade de imagem in vivo de modo que as bactérias na superfície agrícola fiquem voltadas para baixo em direção à câmera invertida da unidade. Encha todas as tampas das placas de Petri com uma pequena quantidade de água. Em seguida, coloque cada tampa com o lado da água voltado para cima em cima das placas AER invertidas.
Dentro da unidade de imagem, vede o gabinete de imagem para manter um nível de umidade constante, ajuste as configurações de imagem da unidade de imagem e inicie a imagem de lapso de tempo da atividade de enxameação. Após a imagem em tempo real, a dinâmica de enxame das bactérias pode ser analisada usando análise de imagem padrão, como a Imagem J, em um experimento de motilidade de superfície. A análise do teor de umidade do ágar imediatamente antes da inoculação é crucial para obter resultados bem-sucedidos de enxameação.
Idealmente, as placas AER facilitarão um local de inoculação apertado e aumentarão a atividade de enxameação bacteriana, enquanto as placas secas suprimirão a motilidade da superfície, além do teor de umidade, a presença ou ausência de aditivos de mídia também pode afetar a atividade de enxame de bactérias em função da temperatura de incubação, utilizando cepas de bactérias, expressando luminescência ou proteínas fluorescentes. A dinâmica de competição entre duas espécies diferentes de bactérias pode ser capturada em um vídeo de lapso de tempo. Além disso, mudanças na densidade celular local e na taxa de biossíntese de lipídios promotores de mobilidade dentro do enxame de bactérias também podem ser verificadas e quantificadas com microscopia fluorescente com lapso de tempo.
Seguindo este procedimento. Outros métodos, como a microscopia confocal, podem ser empregados para responder a perguntas sobre o comportamento celular individual para gerar uma análise detalhada, microscópica e microscópica da motilidade da superfície bacteriana. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como realizar um ensaio de enxame padrão e reprodutível e obter uma análise abrangente da motilidade da superfície bacteriana preparando, curando e inoculando ensaios de motilidade da superfície e processando e analisando o resultado em padrões de crescimento bacteriano.
Visão Geral
Este artigo apresenta um protocolo padronizado para visualizar e quantificar a motilidade por enxameamento bacteriano. Ele aborda desafios comuns no preparo de ensaios de enxameamento e na coleta de dados, utilizando uma técnica de imagem macroscópica para análise detalhada.
Componentes Principais do Estudo
Área de Ciência
- Microbiologia
- Motilidade Bacteriana
- Técnicas de Imagem
Antecedentes
- A motilidade coletiva é influenciada por diversos fatores físicos e ambientais.
- Protocolos padronizados são essenciais para a reprodutibilidade em experimentos.
- As técnicas atuais de análise podem carecer de informações detalhadas sobre o comportamento do enxame.
- Compreender a colonização bacteriana em superfícies é crucial para diversas aplicações.
Objetivo do Estudo
- Fornecer um protocolo sistemático para ensaios de motilidade superficial.
- Minimizar as variáveis que levam a resultados inconsistentes.
- Gerar dados quantitativos sobre as taxas de expansão do enxame e a densidade do bioproduto.
Métodos Utilizados
- Preparação de placas de motilidade superficial com meios específicos.
- Inoculação das placas com bactérias e incubação controlada.
- Imageamento em tempo real dos padrões de crescimento bacteriano.
- Processamento de imagens para quantificação da dinâmica de enxameamento.
Resultados Principais
- Demonstrou um método reprodutível para avaliar a motilidade bacteriana na superfície.
- Identificou fatores-chave que afetam o comportamento de enxameamento, como o teor de umidade.
- Forneceram insights sobre a dinâmica da competição bacteriana.
- Permitiu uma análise detalhada do comportamento bacteriano utilizando imagens com lapso de tempo.
Conclusões
- O protocolo padronizado aumenta a confiabilidade dos ensaios de enxameamento.
- Pode ser adaptado para diversas cepas bacterianas e condições.
- Este método contribui para uma melhor compreensão da motilidade e colonização bacterianas.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Os ensaios de motilidade bacteriana na superfície enfrentam desafios de reprodutibilidade devido à sensibilidade à concentração de ágar, conteúdo de umidade e variáveis ambientais, o que complica a validação de alvos na descoberta de antimicrobianos. Este protocolo padroniza a preparação e a quantificação do ensaio de enxameamento, permitindo triagem fenotípica confiável e redução de riscos mecanicistas de alvos relacionados à motilidade. Ao fornecer saídas dinâmicas quantitativas, como a taxa de expansão do enxameamento e a densidade do bioproduto, ele oferece suporte à confiança preditiva em fluxos de trabalho iniciais de descoberta.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêuticos
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas relacionadas aos mecanismos de colonização bacteriana e aderência à superfície.
- Valor Operacional: Reduz a ambiguidade mecanicista ao isolar a motilidade como um indicador fenotípico para validação de alvos.
- Valor Preditivo: Apoia a triagem de portfólios por meio da avaliação quantitativa da dinâmica de enxameamento sob diferentes perturbações genéticas ou químicas.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Valor Científico: Prepara sistemas biológicos validados para triagem de compostos em etapas subsequentes, garantindo fenótipos de enxame reprodutíveis.
- Valor Operacional: Padroniza a preparação de ágar, inoculação e condições de imageamento para minimizar a variabilidade entre ensaios.
- Escalabilidade: Permite fluxos de trabalho de imageamento com captura contínua e quantificação compatíveis com plataformas de triagem de alto conteúdo.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Continuidade Translacional: Conecta observações de motilidade in vitro a modelos pré-clínicos de formação de biofilme e colonização do hospedeiro.
- Alinhamento de Biomarcadores: Permite o rastreamento de repórteres fluorescentes ou luminiscentes para correlacionar motilidade com a expressão de fatores de virulência.
- Avanço Ajustado ao Risco: Fornece limiares quantitativos para decisões de avançar ou não avançar na validação de alvos anti-virulência.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se insere no continuum de descoberta que vai do teste de hipóteses sobre alvos até a identificação de compostos iniciais, especialmente para programas anti-infecciosos que visam fatores de virulência ou colonização.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses sobre genes ou compostos que afetam a motilidade superficial como um traço associado à virulência.
- Triagem: Garante prontidão do ensaio por meio da padronização na preparação de meios e controles ambientais para avaliação confiável de compostos.
- Análises: Gera leituras dinâmicas quantitativas, como taxa de expansão radial e distribuição da intensidade de fluorescência, para análise comparativa.
- Pesquisa Translacional: Relaciona fenótipos de motilidade com relevância pré-clínica em modelos de infecção persistente e colonização.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma reutilizável de imageamento e quantificação para múltiplas linhagens bacterianas e condições experimentais.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva ao reduzir falsos negativos decorrentes da irreprodutibilidade do ensaio em telas baseadas em motilidade.
- Valor Operacional: Aprimora a padronização e reprodutibilidade entre laboratórios por meio de protocolos definidos de cura, inoculação e aquisição de imagens.
- Valor Estratégico: Melhora a eficiência do capital ao permitir a eliminação precoce de alvos envolvidos na adesão à superfície e na iniciação de biofilmes.
- Impacto sobre o Portfólio: Facilita a priorização ajustada ao risco de candidatos a anti-virulência com base na eficácia da inibição da motilidade.
Considerações sobre a Implementação
- Exige experiência em técnicas microbiológicas e preparação estéril de meios.
- Depende de condições ambientais controladas (umidade, temperatura, fluxo de ar) para a solidificação ideal do ágar.
- Necessita padronização do volume de inoculação e do tempo de incubação entre usuários e locais.
- Requer adaptação da concentração de ágar (0,4%-0,8% p/v) com base na sensibilidade ao enxameamento da linhagem bacteriana.
- Limitado pela necessidade de infraestrutura para imagens com lapso de tempo e proficiência em análise de imagens (por exemplo, ImageJ) para quantificação.
