Name: Quantificando a motilidade de enxame de superfície bacteriana em placas de gradiente indutor (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-01-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 57 s
Description: Aprenda a quantificar a motilidade de enxame bacteriano em placas de gradiente indutor. Este método de alta vazão permite rastrear respostas microquimiotáticas de forma econômica e eficiente.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

O desenvolvimento dessa técnica foi apoiado pelos recursos do plano Nacional de P&D do Ministério da Ciência e Tecnologia (2018YF0902604), da National Natural Science Foundation of China's Research Fund for International Young Scientists (22050410270) e do Shenzhen Institutes of Advanced Technology External Funds (DWKF20190001). Gostaríamos de oferecer nossa sincera gratidão à Srta. Chen Xinyi por sua ajuda na revisão do documento e da gestão laboratorial.

1. Preparação de placas de enxame de gradiente
<ol><li>Preparação do meio enxame NOTA: Consulte a seção de discussão para uma breve comparação de diferentes viscosidades médias; Neste protocolo foi utilizada concentração de 0,7% (c/v) de ágar do meio enxame.<ol>
<li>Preparar caldo de lysogeny (LB) em pó com ágar em dois frascos cônicos; cada frasco contém 2 g de triptona, 2 g de cloreto de sódio, 1 g de extrato de levedura e 1,4 g de ágar. Adicione água duplamente destilada (ddH2O) e mexa a suspensão usando uma barra de mexida magnética. Ajuste o volume final para 200 mL adicionando ddH2O adicional.</li>
		<li>Autoclave a solução a 121 °C por 20 min. Use uma tampa permeável de ar ou uma mamadeira com uma ventilação. NOTA: O ágar dissolverá-se quando aquecido na autoclave.</li>
		<li>Quando a temperatura cair para 65 °C, misture a solução para garantir a homogeneidade e transfira o médio para uma incubadora de 65 °C ou banho de água para uso a curto prazo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparação do meio de enxame de camada inferior NOTA: O meio de camada inferior é a mistura de soluções de estoque de enxame médio e indutor. A formulação de placas de enxame de gradiente indutor é mostrada na Tabela 1.<ol>
<li>Prepare uma solução de estoque de resveratrol de 100 mM dissolvendo 114,12 mg de pó de resveratrol liofilizado em 5 mL de sulfóxido de dimetil (DMSO) e armazene a solução a -20 °C.</li>
		<li>Prepare uma solução de estoque arabinose de 20% (w/v) dissolvendo 6 g de pó arabinose em 30 mL de ddH2O; esperar por 10-15 min para permitir que o arabinose se dissolva; e armazenar a solução em temperatura ambiente.</li>
		<li>Retire o meio da incubadora de 65 °C e coloque-o em temperatura ambiente; deixe o enxame médio esfriar até que o frasco de Erlenmeyer esteja frio o suficiente para segurar (~50 °C). Não coloque o enxame médio à temperatura ambiente por longos períodos, pois isso causará a solidificação do ágar.</li>
		<li>Adicione o volume necessário da solução de calção do indutor ao meio de enxame a 50 °C (Tabela 1). Use uma pipeta para dispensar a solução indutora em vez de escorá-la. Gire suavemente para misturar o indutor com o meio enxame. NOTA: Este passo é para indutores que não podem ser autoclavados. Tenha cuidado para não introduzir bolhas no meio.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparação de placas de enxame de gradiente de camada dupla NOTA: O meio de camada superior é o meio LB contendo 0,7% (w/v) ágar.<ol>
<li>Rotule pratos de Petri 13 x 13 cm quadrados com nome e cepas indutores, e apoie os pratos sobre a borda das tampas (Figura 1B).</li>
		<li>Adicione 40 mL de camada inferior quente (50 °C) usando uma pipeta de 50 mL ou um tubo de centrífuga de 50 mL. NOTA: Alternativamente, para placas de Petri de 13 x 13 cm quadrados, 40 mL de camada inferior e meio de camada superior é adequado; para placas de Petri quadradas de 10 x 10 cm, camada inferior de 25 mL e meio de camada superior é adequado.</li>
		<li>Deixe que o meio de camada inferior cure descoberto por 1h dentro de um capô de fluxo laminar. Não perturbe as placas quadradas de Petri enquanto o meio se solidifica. NOTA: Ao curar a camada inferior, o meio enxame que não contém indutores deve ser mantido em uma incubadora de 65 °C ou banho de água.</li>
		<li>Uma vez que a camada inferior esteja completamente solidificada, remova as tampas e coloque as placas de Petri quadradas dentro de um capô de fluxo laminar.</li>
		<li>Adicione 40 mL de meio de camada superior quente (50 °C) usando uma pipeta de 50 mL ou tubo de centrífuga de 50 mL. NOTA: O meio de camada superior não contém indutores.</li>
		<li>Cure as placas de camada dupla no banco coberto e imperturbável por 1h. Armazene as placas preparadas a 4 °C por até 24 horas. NOTA: Tempos de cura mais longos reduziriam o teor de umidade e restringiriam a motilidade de enxame.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Crescimento de E. coli K12 e P. aeruginosa PAO1
<ol><li>Prepare 500 mL de meio LB adicionando 5 g de triptona, 5 g de NaCl e 2,5 g de extrato de levedura em ddH2O, e cubra a solução a 500 mL. Autoclave a solução em ciclo líquido por 20 min a 121 °C, e armazene-a a 4 °C.</li>
	<li>Prepare 100 mL de 1,5% (w/v) meio LB-ágar adicionando 1 g de triptona, 1 g de NaCl, 0,5 g de extrato de levedura e 1,5 g de ágar no ddH2O e cubra a solução a 100 mL. Autoclave a solução em ciclo líquido por 20 min a 121 °C. Transfira o meio para um banho de água de 50 °C para evitar que o ágar se solidifique.</li>
	<li>Quando o frasco médio LB-ágar estiver confortável de segurar, adicione 20 mL de meio LB-ágar em uma placa de Petri (10 cm de diâmetro) usando uma pipeta de 25 mL. Deixe a placa em temperatura ambiente durante a noite, e armazene a placa LB-ágar a 4 °C.</li>
	<li>Faça o balanço de culturas armazenadas a -80 °C, raia E. coli K12, E. coli K12-YdeH, P. aeruginosa PAO1, e P. aeruginosa PAO1-YdeH em placas LB-ágar Petri usando laços de inoculação descartáveis. Incubar as placas de Petri invertidas durante a noite a 37 °C.</li>
	<li>Escolha colônias individuais para diferentes cepas dos pratos petri, inocula cada colônia em 5 mL de meio LB, e incuba a cultura a 37 °C em um shaker orbital de laboratório definido a 220 rpm.</li>
	<li>Quando a densidade cultural atingir OD600nm ~1.0, remova a cultura do agitador e coloque-a em temperatura ambiente. Ajuste a densidade da cultura para OD600nm = 1.0, conforme descrito na etapa 3.2.1.</li>
</ol>3. Inoculação e incubação de placas de enxame de gradiente
<ol><li>Preparação de poços de inoculação NOTA: Modelos de capa de impressão 3D capazes de gerar poços separados por uma distância padrão podem ser usados em vez do método descrito abaixo (Figura Suplementar S1).<ol>
<li>Marque as posições do poço no papel A4 mostrado na Figura 1C. Coloque três concentrações de teste em uma placa de Petri quadrada com duas ou três réplicas.</li>
		<li>Coloque o papel A4 marcado sob uma placa de gradiente solidificada. Empurre o lado mais amplo de uma ponta de pipeta de 100 μL para a superfície média semisóida na posição marcada. Pressione a ponta da pipeta até atingir a parte inferior do meio de camada superior.</li>
		<li>Quando a ponta tocar a parte inferior, não aplique força vertical na ponta; gire suavemente a ponta para isolar o conteúdo do poço cilíndrico.</li>
		<li>Mova horizontalmente as pontas da pipeta ao longo de uma distância muito pequena para permitir o fluxo de ar para o lugar estreito reservado. Pressione a ponta com o dedo indicador para bloquear o fluxo de gás dentro da ponta enquanto segura a pipeta usando o polegar e o dedo médio.</li>
		<li>Puxe a ponta verticalmente, mantendo o bem conteúdo na ponta enquanto puxa-o para fora. NOTA: Se o conteúdo do poço escorregar, aplique um pouco mais de pressão com o dedo indicador para selar completamente a ponta.</li>
		<li>Repetição de passos 3.1.2 a 3.1.5 em cada posição marcada. Cubra a placa do enxame antes da inoculação.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Inoculação e incubação da placa de gradiente<ol>
<li>Ajuste a densidade da cultura de crescimento durante a noite para OD600nm = 1,0.</li>
		<li>Pipeta 80 μL da cultura de crescimento da noite para o dia em todos os poços. Não derrame a cultura bacteriana fora dos poços.</li>
		<li>Enrole as placas com filme de vedação. Para observação de longo prazo (3-5 dias), enrole as placas com fita de borracha de laboratório estéril. NOTA: A fita de borracha é menos provável de quebrar.</li>
		<li>Coloque um béquer cheio de ddH2O na incubadora para manter a umidade dentro da incubadora. Incubar as placas de enxame de gradiente a 37 °C. NOTA: Não incubar as placas do enxame de cabeça para baixo; isso fará com que a cultura bacteriana vaze dos poços.</li>
		<li>Imagem da placa do enxame imediatamente após a inoculação, registrando-a como o ponto de tempo de 0h .</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Imagem de superfície bacteriana swarming
<ol><li>Retire as placas do enxame, uma de cada vez, da incubadora a cada 12 horas, segurando a placa horizontalmente, e coloque-as no sistema de imagem em gel (veja a Tabela de Materiais). NOTA: Não deixe impressões digitais na superfície das placas; segure o lado da placa do enxame com luvas limpas.</li>
	<li>Selecione o modo de imagem em gel ; expor a placa enxame à luz branca; e ajustar a distância focal para dar a visão mais clara dos enxames. NOTA: Use a mesma distância focal para todas as placas em um determinado lote.</li>
	<li>Aumente o brilho dos enxames para observação clara, ajustando o tempo de exposição para 300 ms. Ajuste o limiar para minimizar a interferência da luz de fundo. NOTA: O limiar é ajustado na interface operacional do sistema de imagem gel. Aumentar os valores à esquerda para minimizar a interferência da luz de fundo; diminuir valores à direita para aumentar o brilho dos enxames. Neste protocolo, a região geralmente está entre 6.000 e 50.000.</li>
	<li>Salve o arquivo de imagem para análise suplementar. Regisso tempo de imagem, tipo indutor, orientação gradiente e cepas em um arquivo .txt .</li>
</ol>5. Quantifique a área do enxame usando o software ImageJ
<ol><li>Importe o arquivo de imagem adquirido usando o sistema de imagem em gel.</li>
	<li>Defina a barra de escala usando o software ImageJ e aplique-a a todas as imagens.<ol>
<li>Crie um segmento de linha marcando o comprimento da placa clicando na ferramenta de linha.</li>
		<li>Clique em Analisar | Defina escala para abrir a janela Escala de configuração .</li>
		<li>Digite o comprimento real na distância conhecida e unidade de comprimento. NOTA: Como foram utilizadas placas de Petri de 13 x 13 cm quadrados neste trabalho, o comprimento real é '130', e a unidade de comprimento é 'mm'.</li>
		<li>Verifique a caixa global .</li>
		<li>Insira uma barra de escala clicando em Analisar | Ferramentas | Barra de escala, digite Largura em mm, Altura em pixels, tamanho da fonte e selecione Cor, Fundo e Localização no menu suspenso. Alternativamente, escolha Texto Negrito, Texto de Ocultação, Fonte Serif e Sobreposição marcando as caixas de seleção. NOTA: A escolha desses parâmetros é determinada pelos usuários e pelas propriedades das imagens. Neste protocolo, largura em mm foi definida como 25, Altura em pixels para 20, tamanho da fonte para 80, e a barra de escala foi colocada no canto inferior direito selecionando Local | Mais à direita. Outros parâmetros podem ser escolhidos pelo usuário.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Clique em processá| Sombras para aumentar a nitidez da imagem, especialmente os limites (Figura Suplementar S2A). Clique em process | Lote para processar imagens. NOTA: O objetivo desta etapa é fornecer uma demarcação de limite mais precisa.<ol>
<li>Processe uma imagem como referência clicando em Process | Sombras | No sul.</li>
		<li>Clique em process | | de lote Macro para abrir a janela Processo de lote . Procure os seguintes comandos exibidos na janela: run ("Sul"); executar ("Salvar"); close();</li>
		<li>Digite o endereço da pasta das imagens originais e o endereço do arquivo de saída clicando em Processar na janela Processo de lote . NOTA: Recomenda-se exportar imagens com sombras para outra pasta e reter uma cópia das imagens originais.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Use a ferramenta Varinha (rastreamento) para selecionar enxames individualmente e ajustar a ferramenta tolerância ( duplo clique em Varinha (rastreamento) até que a linha gerada se encaixe corretamente no limite do enxame (Figura Suplementar S2B). NOTA: Primeiro, clique na ferramenta Varinha (rastreamento) e selecione um enxame em uma imagem. Se os limites não tiverem sido retratados corretamente, clique duas vezes na ferramenta Varinha (rastreamento) para abrir as janelas da Ferramenta varinha , onde a Tolerância pode ser ajustada.</li>
	<li>Clique em Analisar | Medida para exportar o valor da área.</li>
	<li>Repetição de passos 5.1.1-5.1.5 até que todos os enxames sejam medidos, salve os resultados em um arquivo .csv para análise posterior.</li>
</ol>

<ol><li>Morales-Soto, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation%2C+imaging%2C+and+quantification+of+bacterial+surface+motility+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Preparation, imaging, and quantification of bacterial surface motility assays.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (98), e52338(2015).</li>
<li>Kaiser, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+swarming%3A+a+re-examination+of+cell-movement+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Bacterial swarming: a re-examination of cell-movement patterns.</a> Current Biology. 17 (14), 561-570 (2007).</li>
<li>Mattingly, A. E., Kamatkar, N. G., Morales-Soto, N., Borlee, B. R., Shrout, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+environmental+factors+influence+the+importance+of+the+phosphodiesterase+DipA+upon+Pseudomonas+aeruginosa+swarming%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Multiple environmental factors influence the importance of the phosphodiesterase DipA upon Pseudomonas aeruginosa swarming.</a> Applied and Environmental Microbiology. 84 (7), 02847(2018).</li>
<li>Venieraki, A., Tsalgatidou, P. C., Georgakopoulos, D. G., Dimou, M., Katinakis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Swarming+motility+in+plant-associated+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Hellenic+Plant+Protection+Journal%22%5BJournal%5D)">Swarming motility in plant-associated bacteria.</a> Hellenic Plant Protection Journal. 9 (1), 16-27 (2016).</li>
<li>Jones, H. E., Park, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+medium+composition+on+the+growth+and+swarming+of+Proteus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The influence of medium composition on the growth and swarming of Proteus.</a> Journal of General Microbiology. 47 (3), 369-378 (1967).</li>
<li>Su, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+the+viscosity+of+healthy+and+diseased+human+mucins+on+the+motility+of+Helicobacter+pylori%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+reports%22%5BJournal%5D)">Influence of the viscosity of healthy and diseased human mucins on the motility of Helicobacter pylori.</a> Scientific reports. 8 (1), 9710(2018).</li>
<li>Kearns, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+field+guide+to+bacterial+swarming+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Microbiology%22%5BJournal%5D)">A field guide to bacterial swarming motility.</a> Nature Reviews. Microbiology. 8 (9), 634-644 (2010).</li>
<li>Funfhaus, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Swarming+motility+and+biofilm+formation+of+Paenibacillus+larvae%2C+the+etiological+agent+of+American+Foulbrood+of+honey+bees+%28Apis+mellifera%29%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Swarming motility and biofilm formation of Paenibacillus larvae, the etiological agent of American Foulbrood of honey bees (Apis mellifera).</a> Scientific Reports. 8 (1), 8840(2018).</li>
<li>Armbruster, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Testing+the+ability+of+compounds+to+induce+swarming%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Testing the ability of compounds to induce swarming.</a> Methods in Molecular Biology. 2021, 27-34 (2019).</li>
<li>Julkowska, D., Obuchowski, M., Holland, I. B., Seror, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+the+development+of+swarming+communities+of+Bacillus+subtilis+168+and+a+natural+wild+type%3A+critical+effects+of+surfactin+and+the+composition+of+the+medium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of the development of swarming communities of Bacillus subtilis 168 and a natural wild type: critical effects of surfactin and the composition of the medium.</a> Journal of Bacteriology. 187 (1), 65-76 (2005).</li>
<li>Ingham, C. J., Ben Jacob, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Swarming+and+complex+pattern+formation+in+Paenibacillus+vortex+studied+by+imaging+and+tracking+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Swarming and complex pattern formation in Paenibacillus vortex studied by imaging and tracking cells.</a> BMC Microbiology. 8, 36(2008).</li>
<li>Shimada, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dependence+of+local+cell+density+on+concentric+ring+colony+formation+by+bacterial+species+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Physical+Society+of+Japan%22%5BJournal%5D)">Dependence of local cell density on concentric ring colony formation by bacterial species Bacillus subtilis.</a> Journal of the Physical Society of Japan. 73 (4), 1082-1089 (2004).</li>
<li>Brahmachari, P. V., et al. Quorum sensing regulated swarming motility and migratory behavior in bacteria. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBrahmachari%2C+PV+%22Implication+of+quorum+sensing+system+in+biofilm+formation+and+virulence%22">Implication of quorum sensing system in biofilm formation and virulence</a>. Brahmachari, P. V., et al. , Springer. Singapore. 49-66 (2018).</li>
<li>Lindum, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-Acyl-L-homoserine+lactone+autoinducers+control+production+of+an+extracellular+lipopeptide+biosurfactant+required+for+swarming+motility+of+Serratia+liquefaciens+MG1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">N-Acyl-L-homoserine lactone autoinducers control production of an extracellular lipopeptide biosurfactant required for swarming motility of Serratia liquefaciens MG1.</a> Journal of Bacteriology. 180 (23), 6384-6388 (1998).</li>
<li>Wang, W. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+swarming+and+virulence+factor+expression+in+Proteus+mirabilis+by+resveratrol%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Inhibition of swarming and virulence factor expression in Proteus mirabilis by resveratrol.</a> Journal of Medical Microbiology. 55, Pt 10 1313-1321 (2006).</li>
<li>Zahringer, F., Massa, C., Schirmer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+enzymatic+production+of+the+bacterial+second+messenger+c-di-GMP+by+the+diguanylate+cyclase+YdeH+from+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Biochemistry+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Efficient enzymatic production of the bacterial second messenger c-di-GMP by the diguanylate cyclase YdeH from E. coli.</a> Applied Biochemistry and Biotechnology. 163 (1), 71-79 (2011).</li>
<li>Kuchma, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+di-GMP-mediated+repression+of+swarming+motility+by+Pseudomonas+aeruginosa+PA14+requires+the+MotAB+stator%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Cyclic di-GMP-mediated repression of swarming motility by Pseudomonas aeruginosa PA14 requires the MotAB stator.</a> Journal of Bacteriology. 197 (3), 420-430 (2015).</li>
<li>Heering, J., Alvarado, A., Ringgaard, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+cellular+differentiation+and+single+cell+imaging+of+Vibrio+parahaemolyticus+swimmer+and+swarmer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Induction of cellular differentiation and single cell imaging of Vibrio parahaemolyticus swimmer and swarmer cells.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (123), e55842(2017).</li>
<li>Bru, J. L., Siryaporn, A., Høyland-Kroghsbo, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-lapse+imaging+of+bacterial+swarms+and+the+collective+stress+response%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Time-lapse imaging of bacterial swarms and the collective stress response.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), e60915(2020).</li>
<li>Hölscher, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+spatial+segregation+in+surface+colonizing+microbial+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Monitoring spatial segregation in surface colonizing microbial populations.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (116), e54752(2016).</li>
<li>Yeung, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Swarming+of+Pseudomonas+aeruginosa+is+controlled+by+a+broad+spectrum+of+transcriptional+regulators%2C+including+MetR%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Swarming of Pseudomonas aeruginosa is controlled by a broad spectrum of transcriptional regulators, including MetR.</a> Journal of Bacteriology. 191 (18), 5592-5602 (2009).</li>
<li>Delprato, A. M., Samadani, A., Kudrolli, A., Tsimring, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Swarming+ring+patterns+in+bacterial+colonies+exposed+to+ultraviolet+radiation%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review+Letters%22%5BJournal%5D)">Swarming ring patterns in bacterial colonies exposed to ultraviolet radiation.</a> Physical Review Letters. 87 (15), 158102(2001).</li>
<li>Araujo Neto, L. A., Pereira, T. M., Silva, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+behavior%2C+growth%2C+and+swarming+formation+of+Escherichia+coli+and+Staphylococcus+aureus+in+culture+medium+modified+with+silver+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Pathogenesis%22%5BJournal%5D)">Evaluation of behavior, growth, and swarming formation of Escherichia coli and Staphylococcus aureus in culture medium modified with silver nanoparticles.</a> Microbial Pathogenesis. 149, 104480(2020).</li>
<li>Kearns, D. B., Losick, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Swarming+motility+in+undomesticated+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Swarming motility in undomesticated Bacillus subtilis.</a> Molecular Microbiology. 49 (3), 581-590 (2003).</li>
<li>Kearns, D. B., Chu, F., Rudner, R., Losick, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+governing+swarming+in+Bacillus+subtilis+and+evidence+for+a+phase+variation+mechanism+controlling+surface+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Genes governing swarming in Bacillus subtilis and evidence for a phase variation mechanism controlling surface motility.</a> Molecular Microbiology. 52 (2), 357-369 (2004).</li>
<li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordination+of+swarming+motility%2C+biosurfactant+synthesis%2C+and+biofilm+matrix+exopolysaccharide+production+in+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Coordination of swarming motility, biosurfactant synthesis, and biofilm matrix exopolysaccharide production in Pseudomonas aeruginosa.</a> Applied and Environmental Microbiology. 80 (21), 6724-6732 (2014).</li>
</ol>

Os autores não têm conflitos de interesse para divulgar.

A investigação da motilidade bacteriana em placas de gradiente semisólidas pode ser uma tarefa desafiadora18,19,20, pois envolve múltiplos fatores como viscosidade substrato, umidade e componentes médios. Entre esses fatores, a concentração de ágar desempenha um papel decisivo na determinação da reversão microbiana à motilidade da natação ou do enxame. À medida que a concentração de ágar aumenta de 0,3% (w/v) para 1% (c/v), a mo...

A motilidade bacteriana refere-se à migração coletiva de células bacterianas através da superfície de uma substância. Além das placas de ágar semisóidas especialmente preparadas em laboratório1, este fenótipo também é observado em alguns substratos macios, como tecidos animais2, superfícies hidratadas3 e raízes vegetais4. Embora uma superfície semisóida seja considerada uma das condições fundamentais para o enxame bacteriano, algumas espécies também requerem um meio rico em energia para apoiar sua motilidade em enxame5. A rotação flagela alimenta tanto a natação quanto a motilidade-natação infestada descreve a motilidade unicelular dentro de um ambiente líquido, enquanto o enxame é o movimento síncrona de uma população microbiana através de superfícies semisócidas.
A viscosidade substrato influencia a motilidade bacteriana; estudos de micróbios patogênicos, como Helicobacter pylori, mostraram que a motilidade do patógeno muda dependendo da viscosidade da camada de mucina, que é influenciada pela acidificação ambiental no hospedeiro humano6. Para replicar esses ambientes, estudos anteriores usando concentração de ágar acima de 0,3% (w/v) restringem a motilidade da natação bacteriana para efetuar uma mudança gradual no enxame de superfície. O uso da concentração de ágar acima de 1% (c/v) impede a motilidade de muitas espécies7. Os padrões da colônia formados na superfície são diversos, incluindo tapete sem características, olho de touro9, dendritos10 e vórtice11.
Embora a relevância desses padrões ainda não esteja clara, esses padrões parecem depender de pistas ambientais e químicas12. As pistas ambientais abrangem diferentes aspectos, incluindo temperatura, salinidade, luz e pH, enquanto as pistas químicas incluem a presença de moléculas sensoriais de quórum microbiano, subprodutos bioquímicos e nutrientes. O quórum de autoindutores que detectam moléculas de sinalização como a AHL (N-hexanoyl-L homoserina lactona) pode impactar o enxame de superfície, regulando a produção de surfactante13,14. Resveratrol, um composto de fitoalexina, poderia restringir a motilidade bacteriana 15.
No presente trabalho, investigamos o efeito das concentrações gradientes de resveratrol na cepa Escherichia coli K12 do tipo selvagem e investigamos a motilidade de enxame arabinose da espécie E. coli K12-YdeH e Pseudomonas aeruginosa PAO1-YdeH. A produção da enzima YdeH é induzida por arabinose através do promotor araBAD, resultando em perturbação c-di-GMP celular e afetando motilidade bacteriana 16,17. Este comportamento de enxame indutível é estudado usando placas de enxame de gradiente arabinose com cepas E. coli K12-YdeH e P. aeruginosa PAO1-YdeH.
As placas de enxame de gradiente são preparadas solidificando sucessivamente o meio de dupla camada (Figura 1B). A camada inferior compreende o meio adicionado com o indutor, derramado em um lado de uma placa de Petri apoiada. Após a solidificação da camada inferior, a placa de Petri é devolvida a uma superfície plana, onde a camada superior contendo o meio sem o indutor é adicionada do outro lado da placa. Depois que as placas de enxame são completamente solidificadas, os poços de retenção isometricamente organizados são produzidos por furos chatos nas placas do enxame seguindo um layout fixo (Figura 1C) ou imprimindo os poços usando um modelo impresso em 3D da tampa da placa contendo pinos durante o processo de cura média (Figura Suplementar S1). Um sistema de imagem em gel é usado para capturar as morfologias em diferentes pontos de tempo (Figura 2). A análise do enxame de superfície usando o software ImageJ (Figura Suplementar S2) fornece resultados quantitativos do processo de enxame de superfície (Figura 3).
Assim, propomos um método simples para testar a motilidade de enxame de superfície dentro de uma faixa de concentração de indutores. Este método pode ser usado para testar múltiplas respostas de concentração de outros indutores misturando o indutor no meio de camada inferior e pode ser aplicado a outras espécies motile (por exemplo, Bacillus subtilis, Salmonella enterica, Proteus mirabilis, Yersinia enterocolitica). Esta abordagem poderia fornecer resultados qualitativos e quantitativos confiáveis para a triagem de um único indutor químico, e placas separadas podem ser empregadas para avaliar mais indutores químicos.

<table><tbody><tr><td>Ágar</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V900500</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Ampicilina</td><td>Solarbio</td><td>A8180</td><td>25 g, &ge; 85% (GC)</td></tr><tr><td>Tubo de centrífuga</td><td>Corning</td><td>430790</td><td>15 mL</td></tr><tr><td>Frasco criogênico</td><td>Corning</td><td>430488</td><td>2 mL</td></tr><tr><td>Dimetil sulfóxido (DMSO)</td><td>Aladdin</td><td>D103272</td><td>AR, > 99% (GC)</td></tr><tr><td>L(+)-Arabinose</td><td>Aladdin</td><td>A106195</td><td>98% (GC), 500 g</td></tr><tr><td>Placas de Petri</td><td>Bkman</td><td>B-SLPYM90-15</td><td>Placas de Petri de plástico, circulares, 90 mm x 15 mm</td></tr><tr><td>Resveratrol</td><td>Aladdin</td><td>R107315</td><td>99% (GC), 25 g</td></tr><tr><td>Cloreto de sódio</td><td>Macklin</td><td>S805275</td><td>AR, 99,5% (GC), 500 g</td></tr><tr><td>Placas de Petri quadradas</td><td>Bkman</td><td>B-SLPYM130F</td><td>Placas de Petri de plástico, quadradas, 13 mm x 13 mm</td></tr><tr><td>Tryptone</td><td>Thermo Scientific Oxoid</td><td>LP0042</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Extrato de levedura</td><td>Thermo Scientific Oxoid</td><td>LP0021</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Equipamentos</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Incubadora bioquímica</td><td>Blue pard</td><td>LRH-70</td><td></td></tr><tr><td>Tanon 5200multi sistema de imagem</td><td>Tanon</td><td>5200CE</td><td></td></tr><tr><td>Água termostática banho</td><td>Jinghong</td><td>DK-S28</td><td></td></tr></tbody></table>

quantificando a motilidade de enxame de superfície bacteriana em placas de gradiente indutor

Quantifying Bacterial Surface Swarming Motility on Inducer Gradient Plates

A motilidade bacteriana é um fenótipo microbiológico comum que as comunidades bacterianas usam para migrar sobre superfícies semisóidas. Em investigações de motilidade induzida, a concentração específica de um indutor pode não ser capaz de relatar eventos ocorridos dentro da faixa de concentração ideal para obter as respostas desejadas de uma espécie. Placas semisóidas contendo múltiplas concentrações são comumente usadas para investigar a resposta dentro de uma faixa de concentração de indutor. No entanto, placas semisóidas separadas aumentam as variações no teor médio de viscosidade e umidade dentro de cada placa devido ao tempo de solidificação não uniforme.
Este artigo descreve um método de uma etapa para testar simultaneamente a motilidade de enxame de superfície em uma única placa de gradiente, onde os poços de teste organizados isometricamente permitem a aquisição simultânea de respostas multiconcentração. No presente trabalho, o enxame superficial de Escherichia coli K12 e Pseudomonas aeruginosa PAO1 foram avaliados em resposta a um gradiente de concentração de indutores como resveratrol e arabinose. Periodicamente, as morfologias do enxame eram imagens usando um sistema de imagem para capturar todo o processo de enxame de superfície.
A medição quantitativa das morfologias do enxame foi adquirida por meio do software ImageJ, fornecendo informações analisáveis da área do enxame. Este artigo apresenta um método simples de placa de enxame gradiente que fornece informações qualitativas e quantitativas sobre os efeitos dos indutores sobre o enxame superficial, que podem ser estendidos para estudar os efeitos de outros indutores em uma gama mais ampla de espécies bacterianas motile.

O fluxo de trabalho constituído pela preparação de placas de enxame de gradiente, inoculação e incubação é mostrado na Figura 1B. Para gerar placas de nado gradiente, o meio de camada inferior é derramado em pratos apoiados a ~4,3° do plano horizontal (Figura Suplementar S3), seguido por derramar o meio de camada superior após a camada inferior ser completamente solidificada. A composição do meio de camada dupla é mostrada na Tabela 1. Em seguida, a cultura ...

Aqui, descrevemos o uso de placas de gradiente indutor para avaliar a motilidade bacteriana, ao mesmo tempo em que obstruindo múltiplas respostas de concentração.

Quantificando a motilidade de enxame de superfície bacteriana em placas de gradiente indutor

Bacterial swarming motility is a common microbiological phenotype that bacterial communities use to migrate over semisolid surfaces. In investigations of ...

O protocolo rastreia simultaneamente respostas bacterianas a diferentes concentrações de indutores em um ágar semisólida. Isso é conseguido de forma econômica. Esta técnica de triagem de alto rendimento nega a necessidade de ágar com várias concentrações indutoras para observar as respostas microquimotacticas.A técnica foi projetada para triagem de medicamentos e também para observar as respostas do Micropatagen SD. Além disso, pode ser usado para estudar microresponsos a várias pistas bioquímicas no hospedeiro humano. Este método pode fornecer informações sobre quimiotaxis bacterianos.As bactérias responderão a várias concentrações de atrativos químicos conhecidos como quimitaxis positivos ou repelentes químicos conhecidos como quimiotaxis negativos. Uma configuração cuidadosamente preparada é essencial para evitar variações entre o ângulo de gel da camada inferior para evitar o problema de reprodubilidade. Para começar, rotule 13 por 13 centímetros quadrados de placas de Petri com manchas e nomes de indutores.Em seguida, apoie os pratos sobre a borda das tampas. Adicione a solução arabinose ao meio de camada inferior quente. Adicione 40 mililitros de meio de camada inferior quente.Deixe que o meio de camada inferior cure descoberto por uma hora dentro de um capô de fluxo laminar sem ser perturbado. Uma vez que a camada inferior esteja completamente solidificada, remova as tampas e coloque as placas de Petri dentro de um capô de fluxo laminar. Adicione 40 mililitros de meio de camada superior quente usando um filtro de pipeta motorizado.Cure as placas de camada dupla cobertas e imperturbáveis por uma hora, depois armazene-as a quatro graus Celsius por 24 horas. Coloque o papel A4 marcado sob uma placa de gradiente bem solidificada. Empurre o lado mais amplo de uma ponta de pipeta de 100 microliter para dentro da superfície média semisóida na posição marcada e pressione a ponta da pipeta até atingir a parte inferior do meio da camada superior.Quando a ponta tocar na parte inferior, pare de aplicar qualquer força vertical na ponta e gire suavemente a ponta para isolar o conteúdo do poço cilíndrico. Mova horizontalmente a ponta da pipeta a uma pequena distância para permitir o fluxo de ar para o lugar estreito reservado. Pressione a ponta com o dedo indicador para bloquear o fluxo de gás dentro da ponta.Puxe a ponta verticalmente, mantendo o bem conteúdo na ponta enquanto puxa-o para fora. Adicione 80 microliters da cultura de crescimento da noite para o dia em todos os poços. Tire as placas de enxame da incubadora uma de cada vez a cada 12 horas e coloque-as no sistema de imagem em gel.Selecione o modo de imagem em gel, exponha a placa do enxame à luz branca e ajuste a distância focal para obter uma visão clara dos enxames. Aumente o brilho dos enxames para observação precisa, ajustando o tempo de exposição a 300 milissegundos. Ajuste o limiar para minimizar a interferência da luz de fundo.Salve o arquivo de imagem para análise suplementar. Registo o tempo de imagem, o tipo de indutor, a orientação gradiente e as cepas em um arquivo txt. Clique em Process, em seguida, Sombras para melhorar a nitidez da imagem.Clique em Processo seguido de Batch para processar a imagem. Em seguida, processe uma imagem como referência clicando em Process, Shadows e South. Clique em Processar, Lote, Macro para abrir a janela Processo de lote.Procure os comandos exibidos na janela. Digite o endereço da pasta das imagens originais no endereço do arquivo de saída clicando em Processar na janela Processo de lote. Use a ferramenta de rastreamento de varinha para selecionar enxames individualmente e clique duas vezes na ferramenta de rastreamento de varinha para ajustar a tolerância até que a linha gerada se encaixe corretamente no limite do enxame.Clique em Analisar e, em seguida, Meça para exportar o valor da área. E.coli K12 YdeH foi testado em placas de gradiente arabinose usadas para demonstrar o processo de enxame de superfície com sobreposição ocorrendo entre poços adjacentes. Uma placa com três poços de teste permitiu a formação de limites não sobrepostos.P.aeruginosa PAO1 YdeH foi promovida com maior concentração arabinosa a partir da menor concentração, mas gradualmente restrita com maiores concentrações arabinosas. As cepas de tipo selvagem E.coli K12 testadas em placas gradientes de resveratrol dentro da faixa de concentração de microliter de zero a 400 microlitera mostraram uma restrição modesta da motilidade de enxame com crescente concentração de resveratrol. As áreas de enxame foram quantificadas pelo software ImageJ.A curva de enxame exibiu as múltiplas respostas de concentração. A parte mais crucial deste procedimento é a fabricação de uma placa de enxame de camada dupla com uma faixa de concentração específica de indutores. Este método permite que os pesquisadores investiguem a superfície induzida dentro de uma faixa de concentração específica e quantifiquem os efeitos de outros indutores e componentes no enxame.

quantifying-bacterial-surface-swarming-motility-on-inducer-gradient

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Este protocolo descreve o desenvolvimento de um dispositivo micro para investigar quimiotaxia bacteriana em gradientes de concentração estável de chemoeffectors.

Um dispositivo micro para Quantificar Quimiotaxia bacteriana em gradientes de concentração estável

Fonte: Heering, J., et al. Indução de diferenciação celular e imagem de célula única de células nadadoras e enxameadoras de Vibrio parahaemolyticus . J. Vis. Exp. (2017)Este vídeo demonstra a indução da diferenciação de células de enxame em Vibrio parahaemolyticus usando um meio de ágar especialmente preparado. Ao manipular pistas ambientais, como depleção de ferro, suplementação de cálcio e contato com a superfície, as bactérias são estimuladas a fazer a transição de sua forma de nadador para...

Indução da diferenciação de Vibrio parahaemolyticus em células de enxame

Fonte: Morales-Soto, N. et. al., Preparação, Imagem e Quantificação de Ensaios de Motilidade de Superfície Bacteriana. J. Vis. Exp. (2015)Este vídeo demonstra um ensaio de enxame usando bactérias que expressam proteína fluorescente verde para observar a motilidade da superfície em ágar macio. A imagem de lapso de tempo captura a expansão coordenada e a formação de gavinhas, destacando a motilidade da superfície bacteriana.

Ensaio de enxame para visualização da motilidade da superfície bacteriana

Fonte: Guo, S., et al. Quantificando a motilidade do enxame da superfície bacteriana em placas de gradiente indutor. J. Vis. Exp. (2022).Este vídeo demonstra o uso de uma placa de enxame de gradiente de camada dupla para estudar o comportamento do enxame bacteriano sob concentrações variadas de inibidores. Uma placa com um inibidor formador de gradiente na camada inferior é inoculada com bactérias e incubada. As imagens são capturadas em intervalos regulares para analisar o efeito da...

Avaliação do enxame bacteriano usando uma placa inibidora de gradiente

Fonte: Scheidweiler, D., et al. Combinando dispositivos fluídicos com microscopia e citometria de fluxo para estudar o transporte microbiano em meios porosos em escalas espaciais. J. Vis. Exp. (2020).Este vídeo demonstra o uso de um dispositivo microfluídico para quantificar a motilidade bacteriana por meio de uma matriz porosa composta por pilares dispostos aleatoriamente. Bactérias marcadas com fluorescência são introduzidas no dispositivo, imagens por microscopia enquanto se movem pela...

Avaliando a Motilidade Bacteriana Usando um Dispositivo Microfluídico

A motilidade de enxameação é influenciada por fatores físicos e ambientais. Descrevemos um protocolo de duas fases e diretrizes para contornar os desafios comumente associados à preparação do ensaio de enxame e à coleta de dados. Uma técnica de imagem macroscópica é empregada para obter informações detalhadas sobre o comportamento do enxame que não são fornecidas pelas técnicas de análise atuais.

Preparação, Imaging, e quantificação de Motilidade Ensaios superfície da bactéria

O papel da variedade (segregação espacial) em cenários evolutivas podem ser examinadas utilizando sistemas microbianos simples no laboratório que permitem o ajuste da distribuição espacial controlada. Ao modificar a densidade de células fundador, vários níveis de sortimento pode ser visualizada usando cepas de bactérias fluorescente etiquetado nos biofilmes de colónias de Bacillus subtilis.

Monitoramento Espacial Segregação na superfície Colonizar microbianas Populações

Este protocolo permite a microscopia de célula única do nadador Vibrio parahaemolyticus diferencialmente diferenciado e células swarmer. O mï¿½odo produz uma populaï¿½o de cï¿½ulas swarmer facilmente disponï¿½eis para a anï¿½ise de uma ï¿½ica cï¿½ula e abrange a preparaï¿½o de culturas de cï¿½ulas, induï¿½o de diferenciaï¿½o de swarmer, preparaï¿½o de amostra e anï¿½ise de imagem.

Indução de diferenciação celular e imagens de células<em&gt; Vibrio parahaemolyticus</em&gt; Células Swimmer e Swarmer

Detalhamos um método simples para produzir filmes de lapso de tempo de alta resolução de enxames pseudomonas aeruginosa que respondem a bacteriófagos (phage) e estresse antibiótico usando um scanner de documentos de leito. Este procedimento é um método rápido e simples de monitoramento da dinâmica do enxame e pode ser adaptado para estudar a motilidade e o crescimento de outras espécies bacterianas.

Imagem de lapso de tempo de enxames bacterianos e a resposta ao estresse coletivo

Muitas bactérias usam motilidade impulsionada por flagela para navegar em seu ambiente e colonizar ambientes favoráveis tanto individualmente quanto como coletivos. Demonstrado aqui é o uso de três métodos estabelecidos que exploram a motilidade como ferramenta de seleção para identificar componentes/caminhos que contribuem para a natação e a motilidade.

Investigando a Motilidade Impulsionada por Flagella em Escherichia coli aplicando três técnicas estabelecidas em uma série

Este protocolo apresenta um método rápido e eficiente para identificar fatores genéticos envolvidos em vários tipos de motilidades em Pseudomonas aeruginosa.

Método de alto rendimento para observação de fenótipos de motilidade em Pseudomonas aeruginosa

Aprenda a quantificar a motilidade de enxame bacteriano em placas de gradiente indutor. Este método de alta vazão permite rastrear respostas microquimiotáticas de forma econômica e eficiente.

Quantificando a motilidade de enxame de superfície bacteriana em placas de gradiente indutor

Explorar mais vídeos