Name: Análise das Alterações Gene expressão no Rat Hippocampus Após Estimulação Cerebral Profunda do Anterior Thalamic Nucleus (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 46 s
Description: Aprenda a realizar estimulação cerebral profunda do núcleo talâmico anterior em ratos Wistar e analisar alterações na expressão gênica do hipocampo. Este método permite investigar mecanismos moleculares subjacentes aos efeitos terapêuticos da ECP.

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Declaração de Ética: NOTA: Todos os procedimentos descritos neste manuscrito estão em conformidade com as diretrizes do NIH para Pesquisa Animal (Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório) e são aprovados pelo Comitê IACUC Escola de Medicina de Harvard. Preparação 1. Pré-cirúrgica <ol><li> Certifique-se de que todos os instrumentos cirúrgicos são esterilizados por autoclave ou seja pela limpeza com a solução e / ou etanol anti-séptico, conforme necessário. Sempre que possível, use o material descartável estéril como bisturis, agulhas e seringas. </li><li> Cobrir a bancada de trabalho com campos cirúrgicos e garantir que não é uma eliminação de resíduos perigosos disponível. </li><li> Pesa-se o rato e calcular a dose de anestesia. Utilize uma mistura de cetamina / xilazina (cetamina 75 mg / kg de xilazina e 10 mg / kg) para anestesiar os ratos. NOTA: entre 200-250 g é o peso ideal para a fixação adequada do animal na moldura estereotáxica, bem como para direccionamento preciso da ATN. Isoflurane também pode ser utilizado como o agente de anestesia. </li><li> A montagem e dois eléctrodos estéreis seguras (esterilizado em autoclave ou com óxido de etileno) sobre o suporte do eléctrodo (Figura 2) de um quadro estereotáctico e cirúrgico com o auxílio de um microscópio (ampliação de 10-40X), inspeccionar as pontas do eléctrodo para adequada alinhamento. Prenda os dois eletrodos de 3,0 milímetros de distância. NOTA: Tenha cuidado para não danificar a ponta do eletrodo por tocar em superfícies duras. </li></ol> 2. DBS Cirurgia <ol><li> Injectar a ketamina / xilazina misturar intraperitoneal para o animal e confirmar que o animal chegou a um plano cirúrgico de anestesia (marcando para o reflexo toe-pitada, freqüência respiratória e profundidade e regularidade da respiração). Remover os pêlos da região do couro cabeludo, que vai ser objecto de incisão e desinfectar o couro cabeludo com 3 esfrega alternadas de cada betadine e álcool ou soro fisiológico estéril. Seguros e posicionar o animal no fram estereotáxicae. </li><li> Use circulam almofadas de água quente para manter a temperatura do corpo do animal em um nível ideal. Aplique lubrificante ocular para os olhos do animal para proteger contra o ressecamento. </li><li> Use as seguintes coordenadas estereotáxica para direccionar a ATN (Anterior núcleo talâmico): anterioposterior -1,6 mm, 1,5 mm e mediolateral dorsoventral 5,2 milímetros 1. NOTA: As coordenadas estereotáxicas são baseadas no Paxinos e Watson (6 th edition) atlas cerebral de rato 36. </li><li> Realizar uma incisão no escalpe sagital para revelar o crânio. Utilizando um par de afastadores proteger o couro cabeludo incisão para expor o crânio. Use soro fisiológico estéril para lavar a incisão. Se a incisão é muito úmido, use cotonetes estéreis para secar. Localize o bregma e marcar com um marcador preto. Para orientar a posição dos furos de rebarba, tornar mais duas marcas em aproximadamente 1,5 mm mediolaterally em ambos os lados da sutura sagital e 1,6 mm posterior ao coronai sutura. </li><li> Use uma broca de mão para fazer os furos Burr. Certifique-se a ponta do orifício de trepanação é estéril, esterilizando-o com etanol. Segure a furadeira em cerca de um ângulo de 45 ° para a superfície do crânio quando a perfuração. Alterna com freqüência entre os dois orifícios da rebarba para evitar o calor excessivo no local de qualquer orifício de trepanação. </li><li> Continuar até perfuração da dura-máter está exposta. Usando uma agulha com a ponta dobrada lembrando a forma de um &#39;L&#39;, remova quaisquer pedaços de osso que possa dificultar a inserção do eletrodo. Tome cuidado para não danificar a dura e / ou tecido cerebral subjacente ao remover fragmentos de ossos utilizando a agulha torta. NOTA: Usando uma agulha embotada ou pinça sem corte finas também é uma opção. </li><li> Fixar o conjunto de eléctrodo duplo para a pega rotativa da moldura estereotáxica e fixar a pega a um ângulo de 90 °. Usando os ajustes no quadro estereotáxico, posicione o eletrodo à esquerda exatamente acima do bregma. </li><li> Usando o aparelho de somajustes táticos para posicionamento mediolateral, mover precisamente o eléctrodo de 1,5 mm a esquerda do lado esquerdo da bregma de tal modo que agora existem dois eléctrodos perfeitamente alinhadas ao longo da sutura coronária mas espaçadas em 1,5 milímetros mediolaterally do bregma. </li><li> Usando os ajustes estereotaxia anterioposterior, mova os eletrodos 1,6 milímetros posterior à sutura coronal. </li><li> Use os ajustes dorsoventrais para diminuir os eletrodos para primeiro verificar se os furos burr foram feitas no local certo de tal modo que os eletrodos podem ser inseridos com facilidade, sem tocar as arestas dos furos Burr. Se assim for, inserir os eléctrodos a uma profundidade de 5,2 mm a partir da superfície do crânio. </li><li> Conecte-se os eletrodos através leva a um estimulador fixado em 130 Hz, 2,5 V e 90 ms pulsewidth 1. </li><li> Proporcionar alta frequência de estimulação durante uma hora (ou durante um período de tempo desejado conforme a configuração experimental). Durante o curso da estimulação, p lembrar assegurarprofundidade anestésica roper regularmente, verificando a ausência de retirada da pata em resposta a uma pitada dedo do pé. Suplemento anestesia com aproximadamente metade da dose inicial utilizada para induzir a anestesia. Evitar a contaminação de suas luvas estéreis durante a verificação da profundidade anestésica e alterá-las se necessário. Realizar estimulação unilateral ou bilateral com base nas necessidades experimentais de um. Incluir controles, como a baixa freqüência de estimulação (por ex., 10 Hz) e animais não estimuladas (inserindo eletrodos sem estimulação subsequente). </li><li> Após a estimulação estiver pronto, retire os eletrodos com cuidado e suturar a incisão com 3-0 ou com grampos cirúrgicos estéreis. </li><li> Administrar buprenorfina (0,05 mg / kg) por via subcutânea, a analgesia. Monitorar o animal até que ele retorne à atividade normal e, em seguida, devolvê-lo à instalação de alojamento. </li><li> Depois de um período de tempo definido com base no design experimental (por exemplo: 0, 3, 6 ou 12 horas após a cirurgia DBS), Eutanásia do animal com anestesia overdose. Depois de confirmar a ausência de sinais vitais, decapitar o animal. </li><li> Dissecar o cérebro, primeiro removendo a pele com uma tesoura. Cortar o osso ao longo da sutura sagital usando tesouras de dissecação. Faça mais duas incisões (cerca de um centímetro cada) através do osso em ambos os lados laterais. Usando fórceps, levantar a peça cortada parcialmente de osso a partir do topo do crânio para expor o cérebro. </li><li> Usando uma tesoura fina ou fórceps, desalojar o cérebro do crânio e transferir para uma placa de Petri com PBS frio no gelo. NOTA: Tome cuidado para evitar danos ao cérebro ao fazer as incisões através do osso. </li></ol> 3. Hippocampus Isolation NOTA: Faça todos os passos subsequentes nesta seção no gelo. <ol><li> Coloque o cérebro em uma matriz de acrílico cérebro pré-resfriado em gelo. Usando uma lâmina de barbear, cortar o cérebro coronally em cerca de 7-8 mm do anterior mais-edge do cérebro. Faça um segundo corte coronal e posterior ao primeiro corte de tal forma que uma fatia do cérebro cerca de 5 mm de espessura pode ser removido. </li><li> Transferir a fatia de cérebro para uma placa de Petri com PBS gelado. Usando lâmina de barbear, cortar as duas seções hemisféricas e tomar o cuidado de observar qual hemisfério corresponde aos lados esquerdo e direito, respectivamente. Isto é especialmente importante durante a execução de estímulos unilaterais. </li><li> Usando uma pinça fina e tesouras remover o hipocampo cuidadosamente. </li><li> O Flash congelar o tecido do hipocampo em gelo seco e armazenar em freezer -20 ° C até que esteja pronto para as etapas de extração de RNA subsequentes. NOTA: Para o armazenamento a longo prazo, é aconselhável armazenar amostras de tecido em um congelador a -80 ° C. </li></ol> 4. Extração de RNA e PCR quantitativa <ol><li> Certifique-se que o tecido permanece congelado em gelo seco até que esteja pronto para a homogeneização. </li><li> NOTA: Execute esta etapa no capô. <ol><li> Adicionar 1 ml de reagente Tri para Hippocampal tecido num tubo de centrífuga de 1,5 ml, e homogeneizar por pipetagem primeira várias vezes até que o tecido está dividido em peças mais pequenas. Além disso homogeneizar o tecido passando através de uma seringa com uma agulha de 25 G até que não há tecido ininterrupta visível. Execute as etapas de homogeneização no gelo. </li><li> Após a homogeneização do tecido, permite a suspensão de células em repouso à temperatura ambiente durante 5 min para permitir a lise celular. NOTA: Findo este período a suspensão celular pode ser rapidamente congeladas e armazenadas em -70 ° C até posterior processamento. </li></ol></li><li> Adicionar 0,2 ml de clorofórmio e misturar em vortex durante 20 segundos e deixar a solução restante à temperatura ambiente durante 15 min. </li><li> Centrifuga-se as amostras a 12.000 xg durante 15 min a 4 ° C. Após a centrifugação, remover os tubos com cuidado, sem perturbar as três camadas separadas que serão visíveis. NOTA: A fase inferior (vermelho) contém proteínas, fase nublado meio contém DNA eo topo fase clara contém RN / D. </li><li> Transferir a fase superior clara (ARN) em 1,5 ml de um novo tubo de centrífuga (tipicamente 500 ul da fase contendo ARN é obtido). Para este adicionar 0,5 ml isopropanol e misture por vórtex. Para este adicionar 2-3 ul de glicogénio (20 mg / ml) como o veículo para o RNA. Deixar a amostra para descansar sobre a mesa à temperatura ambiente durante 10 min. </li><li> Centrifuga-se a amostra a 12.000 xg durante 1 hora a 4 ° C. Certifique-se de que o sedimento de ARN é visível na parte inferior do tubo. </li><li> Descartar o sobrenadante e lavar o sedimento de ARN por adição de 1 ml de etanol a 75% (feito com água livre de nuclease). Inverta a amostra várias vezes até que o sedimento que se desprende da parte inferior do tubo e flutua na solução. Centrifuga-se a solução a 12000 xg durante 10 min a 4 ° C. NOTA: O sedimento em etanol a 75% pode ser armazenado a -20 ° C até serem medidas adicionais. </li><li> Permitir que o sedimento de ARN para ar seco, deixando os tubos abertos para 5 min à temperatura ambiente. Tome precauções para evitar over secagem do sedimento como esta pode afectar a sua dissolução em água no passo subsequente. </li></ol> 5. Remover DNA a partir da preparação RNA <ol><li> Adicionar 9 mL de água livre de nuclease ao sedimento RNA e certifique-se o pellet é dissolvido antes de prosseguir em vortex suavemente o tubo. Para este adicionar 1 ml de Tampão de 10x ADNase I e 1 ul de ADNase recombinante (a partir de ADNase I kit), misturar sacudindo suavemente os tubos, giram brevemente os tubos e incubar a 37 ° C em banho-maria durante 30 min. </li><li> Adicionar 2 mL de reagente de inactivação de DNase (a partir de ADNase I kit) para a amostra e incubar à temperatura ambiente durante 2 min e misturar frequentemente sacudindo suavemente o tubo. Centrifugar a 12.000 xg durante 10 min e transferência aproximadamente 10 ul de sobrenadante límpido para um novo tubo de centrífuga de 1,5 ml. </li><li> Medir a concentração de ARN utilizando um espectrofotómetro ou NanoDrop. </li></ol> 6. Fazendo ADNc a partir de ARN <ol><li> Adicionar th volume necessárioem contém 1 mg de RNA e levar o volume total de 8 mL por adição de água livre de nuclease. Para isso, adicione 1 mL 10 mM dNTP misturar e 1 ml de hexâmeros aleatórios do Kit sobrescrito First Strand Synthesis. Misturar suavemente e incuba-se a 65 ° C durante 5 min em qualquer um banho de água ou em um termociclador pré-programado. </li><li> Fazer uma pré-mistura contendo os seguintes reagentes: 2 ul de Tampão 10 x RT, 4 mL de 25 M de MgCl2, 2 ul de DTT 0,1 M e 1 uL de RNAse FORA (40 U / ul). NOTA: Os volumes indicados são por reação, o usuário precisaria escalar de acordo com sua necessidades experimentais. </li><li> Após a remoção da amostra contendo ARN de 65 ° C, ajustar o tubo à temperatura ambiente durante um minuto. Adicionar a solução de pré-mistura 9 ul e incubar à temperatura ambiente durante 2 min. Adicionar 1 ml de enzima transcriptase reversa Superscript II (50 U / ul) e, em seguida incubar à temperatura ambiente durante 10 min. </li><li> Incubar as amostras a 42 ° C durante 50min para a transcrição inversa ocorra. </li><li> Incubar as amostras a 70 ° C durante 15 minutos para terminar a reacção. </li><li> Coloque as amostras em gelo e brevemente adicionar 1 ul ARNaseH (2 U / ul) e incubar a 37 ° C durante 20 min. </li><li> Resumidamente centrifugar os tubos a 3000 xg de girar o líquido condensado. NOTA: Este é o ADNc que será utilizada para a PCR quantitativa. cDNA pode ser armazenado no congelador a -20 ° C até que a configuração de PCR. cDNA também pode ser diluído com água isenta de nuclease antes de prosseguir para a PCR. </li></ol> 7. PCR quantitativa <ol><li> Faça uma mistura mestre contendo os seguintes reagentes (volumes indicados são por reacção): 6,3 l de 2x Sybr Mix Verde, 0,6 l de Adiante Primer (10 mM), 0,6 l de primer reverso (10 mM) e 0,5 mL de água livre de nuclease . NOTA: Projeto Primer foi feito usando o &#39;Escolha Primers &quot;opção em página sequência de nucleotídeos do NCBI para o gene de interesse. </li><li> Adicionar 10 ul mastermix a cada poço de uma placa de PCR de 96 bem. Adicionar 2,5 uL de ADNc feitas anteriormente para o poço que contém o mastermix. Certifique-se de criar reações de PCR em triplicado para cada amostra. </li><li> Depois de se completar a adição de mastermix e ADNc, cobrir a placa de PCR, utilizando uma folha adesiva óptica para vedar os poços. Girar a placa brevemente durante 5 min a 500 xg numa centrifugadora de bancada para resolver tudo o líquido para o fundo do poço. </li><li> Carregue a placa de PCR numa máquina de RT-PCR pré-programado. Use os parâmetros de PCR previstas na Tabela 1. </li><li> A análise dos dados: Use os valores C t da saída qPCR para outros cálculos. Junto com o gene teste, criado reações de PCR para os genes de controlo interno, 18S rRNA (para garantir a igualdade de entrada) e β-actina (controle negativo). Calcule mudanças vezes com base no método de ΔΔCt 37. </li></ol>

Os autores não têm divulgações.

Após o trabalho de Marco por Benabid et al. Em usar estimulação cerebral profunda para tratar a doença de Parkinson e tremor essencial, a técnica cirúrgica DBS foi investigado com muito interesse ao longo da última década para tratar vários distúrbios neurológicos 6,10,43. DBS estudos que visam várias regiões neuro-anatômica dos circuitos cerebrais são atualmente realizados por vários grupos para abordar as principais doenças neuronais e estão em várias fases de ensaios clínicos. A estimulação do núc...

A história por trás do desenvolvimento de estimulação profunda do cérebro como uma técnica neurocirúrgica remonta à década de 1870, quando a possibilidade de estimular eletricamente o circuito cerebral foi explorada 2. O uso da estimulação de alta frequência crônica como tratamento para distúrbios neuronais começou na década de 1960 3. Mais tarde, na década de 1990, com o advento de eléctrodos de implantação crónica de DBS 4-6, o número de distúrbios neuronais que foram tratados por DBS continuou a aumentar. A estimulação cerebral profunda foi usado pela primeira vez nos Estados Unidos como um tratamento para o tremor essencial 6. Hoje, a cirurgia é amplamente utilizado para tratar desordens neuronais que estão actualmente tratável por intervenção farmacológica. DBS é actualmente utilizado para o tratamento de perturbações do movimento da doença de Parkinson e distonia 7-9. Demência de tipo Alzheimer, doença, epilepsia, dor e doenças neuropsiquiátricas tal depressão de Huntington, OCD, Tourette7; s síndrome e vício são algumas das condições passíveis de tratamento por DBS 10-12. Enquanto a cirurgia DBS é aprovado pela FDA para o tratamento da doença de Parkinson, a distonia e tremor essencial, a utilização de DBS para o tratamento de outras condições mencionadas acima estão em vários estágios de laboratório e estudos clínicos que oferecem a promessa muito doentes 13,14. Clinicamente, a cirurgia de DBS é realizada em duas fases. A primeira etapa envolve a posicionar os eléctrodos cirurgicamente DBS na localização anatómica alvejado usando uma combinação de posicionamento radiológico, CT, MRI, bem como leituras microeléctrodos para maior precisão. A segunda fase envolve a implantação de um gerador de impulsos no peito do paciente e a instalação de extensões do couro cabeludo para o gerador de impulsos. Com base na condição neurológica, vários esquemas de programação para o gerador de impulsos foram padronizados e irá ser utilizado para entregar a tensão desejada. A final, voltagem é atingida de forma gradual, de modo a receber a melhor resposta clínica com o mínimo de tensão 15. No entanto, nos nossos estudos, ao contrário dos implantes DBS crónicas utilizado clinicamente, por uma questão de simplicidade, que recorreram a estudar um tempo de estimulação de alta frequência (durante 1 hora) nos modelos animais. Parte da pesquisa do nosso grupo concentra-se em investigar o uso da cirurgia DBS para a epilepsia refratária ao tratamento. Abordagens cirúrgicas estereotáxica, com auxílio de estimulação de alta frequência tem sido explorado por muitos outros como uma opção eficaz para tratar a epilepsia clinicamente refratária, que constitui cerca de 30% de todas as incidências de epilepsia 10,16,17. Estimulação cerebelar direccionamento da superfície cortical bem como os núcleos profundos do cerebelo têm sido utilizados no passado como alvos para o tratamento de epilepsia 10,18,19. Além disso, a estimulação hipocampo também foi tentado, mas com resultados mistos 20,21. Alguns dos outros investigadaMetas DBS para a epilepsia incluem o córtex cerebral, tálamo, núcleo subtalâmico e nervo vago 8. No entanto, após os resultados de vários estudos nos últimos anos, o núcleo talâmico anterior (ATN) emergiu como o alvo mais comum DBS para o tratamento da epilepsia 10,22. Com base nos conhecimentos sobre circuitos neuroanatomical e resultados de modelos animais, vários estudos têm-se centrado sobre o efeito terapêutico de estimulação cerebral profunda da ATN no tratamento de epilepsia 23-26. A ATN é parte do circuito límbico e está localizado na região do cérebro que afeta a frequência de crises. Estudos por Hamani et al., Testaram a eficácia da NTA-DBS em um modelo de epilepsia induzida por pilocarpina e descobriu que a estimulação bilateral ATN latências para convulsões induzidas por pilocarpina e estado de mal epiléptico 24 prolongada. Além disso, a alta estimulação da ATN frequência foi encontrada para reduzir a freqüência de crises em um modelo de pentilenotetrazol (PTZ) de epilepsy 25,27-29. Lee et al., Relataram uma redução média da frequência de crises por cerca de 75% em cima da estimulação cerebral profunda crônica da ATN no tratamento da epilepsia refratária parcial 30. Um recente estudo clínico sobre a epilepsia refratária ao tratamento tem mostrado resultados promissores após a cirurgia DBS visando o núcleo talâmico anterior (ATN) 22. Um ensaio clínico multicêntrico, randomizado, com 110 pacientes submetidos a DBS bilateral da ATN para o tratamento de epilepsia refratária (trial SANTE) indicaram uma queda na frequência de crises por cerca de 40% 31. Os resultados deste estudo também sugeriu em um efeito anti-epiléptico ideal atrasado observado em 2-3 meses após a cirurgia. Estudos adicionais por Toda et al., Corroborado com estes resultados, onde eles demonstraram neurogênese acontecendo em um momento pós tarde DBS (dias 3-5) em modelos animais 1. Além disso, Encinas et al., Relataram neurogène hipocamposis no giro denteado do rato adulto, após a estimulação da ATN 32 de alta freqüência. Estudos anteriores 33-35 relataram declínio neurogênese em certos casos de epilepsia, como a epilepsia crônica do lobo temporal e uma associação com déficits de aprendizagem, perda de memória e espontâneas convulsões motoras recorrentes. Além disso, houve uma redução nos factores de células estaminais progenitoras neurais, tais como o FGF2 e de IGF-1 no hipocampo cronicamente epiléptico em modelos animais 33. Considerando isso, estratégias de intervenção, tais como DBS que mostram um aumento da neurogênese no giro dentado são caminhos interessantes para a pesquisa. Estes resultados têm nos encorajado a explorar mais profundamente o mecanismo subjacente tratamento neurogênese pós-DBS para a epilepsia. Temos como alvo a ATN tanto unilateral (dados não publicados), bem como a nível bilateral (em resultados representativos) e neurotrofina elevado visto (BDNF) expressão no giro dentado de ratos. Nosso current hipótese é que a expressão de BDNF inicia uma cascata de expressão do gene que culmina na neurogénese que traduz o efeito anti-epiléptico de cirurgia de DBS. Neste artigo, apresentamos os nossos métodos de cirurgia DBS visando a ATN em ratos, seguido de análise de expressão gênica como uma abordagem atraente para estudar o mecanismo subjacente aos benefícios do DBS.

<table><tbody><tr>Cirurgia <td></td><td></td><td></td><td>de Estimulação Cerebral</td></tr><tr><td>Profunda Quadro Estereotáxico</td><td>Kopf Instruments</td><td>Modelo 900</td><td></td></tr><tr><td>Broca&nbsp;</td><td>Dremmel</td><td>7700, bisturi de 7,2 V</td><td></td></tr><tr><td></td><td>BD</td><td>372610</td><td></td></tr><tr><td>Cetamina</td><td>Patterson Veterinária</td><td>07-803-6637</td><td>Anexo III Substância Controlada, aquisição, uso e armazenamento de acordo com as regras institucionais</td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Patterson Veterinary</td><td>07-808-1947</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorphine</td><td>Patterson Veterinary</td><td>07-850-2280</td><td>Anexo III Substância Controlada, aquisição, uso e armazenamento de acordo com as regras institucionais</td></tr><tr><td>Grampos cirúrgicos</td><td>ConMed Corporation</td><td>8035</td><td></td></tr><tr><td>Suturas (3-0)&nbsp;</td><td>Harvard Apparatus</td><td>72-3333</td><td></td></tr><tr><td>Seringa (1 ml, 29 1/2 G)</td><td>BD</td><td>329464</td><td>Estéril, uso para administração de anestesia por via intraperitoneal</td></tr><tr><td>Seringa (3 ml, 25 G)</td><td>BD</td><td>309570</td><td>Estéril, uso para administração de analgesia por via subcutânea</td></tr><tr><td>Agulhas</td><td>BD</td><td>305761</td><td>Estéril, uso para limpar pedaços de ossos quebrados dos orifícios de rebarbas</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Fisher Uso científico</td><td>S25309B</td><td>para esterilização geral&nbsp;</td></tr><tr><td>Lubrificante para os Olhos</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-898-350</td><td></td></tr><tr><td>Estimulador</td><td>Medtronic</td><td>Modelo 3628</td><td></td></tr><tr><td>Eletrodos DBS</td><td>Rhodes Medical Instruments, CA</td><td>SNEX100x-100 mm</td><td>Os eletrodos são de platina, concêntricos e bipolares</td></tr><tr><td>Betadine (Povidona-Iodo)&nbsp;</td><td>PDI</td><td>S23125</td><td>Swabsticks de uso único, use para esterilizar o couro cabeludo antes de fazer a incisão&nbsp;</td></tr><tr><td>&nbsp; Isolamento do tecido do Cérebro e Isolamento</td><td></td><td></td><td></td>do Tecido do Hipocampo</tr><tr><td>Microscopia Eletrônica</td> de<td>Matriz Cerebral de Roedores Acrílicos</td><td>Ciências 175-300 www.emsdiasum.com</td><td></td></tr><tr><td>Lâmina de Barbear</td><td>V W R</td><td>55411-050</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura de Guilhotina</td><td>Clauss</td><td>18039</td><td>Para decapitação, certifique-se de que estas tesouras são mantidas em condições limpas e de funcionamento</td></tr><tr><td>Tesoura</td><td>Codman Classic</td><td>34-4098</td><td>Use para remover o cérebro do crânio</td></tr><tr><td>Fórceps</td><td>Microscopia Eletrônica Ciências</td><td>72957-06</td><td>Use para remover o cérebro do crânio e para manuseio durante a dissecção</td></tr><tr><td>Tampolado com fosfato Salino&nbsp;</td><td>Boston Bioproducts</td><td>BM-220</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Extração de RNA e preparação de</td><td></td><td></td><td></td>cDNA</tr><tr><td>Tri Reagent</td><td>Sigma</td><td>T9424</td><td>Sempre use em uma capela de exaustão e use óculos de proteção durante o manuseio; evite contato com a pele</td></tr><tr><td>Seringa (3 ml, 25 G)</td><td>BD</td><td>309570</td><td>Use para homogeneização de tecidos</td></tr><tr><td>Clorofórmio</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1145-1</td><td>Sempre use em uma capela de exaustão e use óculos de proteção durante o manuseio; evite contato com </td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A416-1</td><td></td></tr><tr><td>Glicogênio</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0561</td><td></td></tr><tr><td>Dnase I Kit</td><td>Ambion</td><td>AM1906</td><td></td></tr><tr><td>Superscript First Strand Synthesis Kit</td><td>Invitrogen</td><td>11904-018</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrífuga de Mesa</td><td>Eppendorf</td><td>5415D</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; PCR quantitativo</td><td> &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kit de PCR Verde SYBR</td><td>Qiagen</td><td>204143</td><td></td></tr><tr><td>Oligos</td><td>Invitrogen</td><td>10668051</td><td></td></tr><tr><td>Placas de PCR (96 poços)</td> Folhas adesivas <td>ópticas Denville</td><td>Scientific C18080-10</td><td></td></tr> Água <tr><td>livre de nuclease</td><td></td> Thermo Scientific <td></td> AB1170 Thermo Scientific SH30538-02 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> Real <td></td></tr><tr><td> Máquina de PCR de tempo</td><td>aplicada Biosystems</td><td>7500</td><td></td></tr></tbody></table>

análise das alterações gene expressão no rat hippocampus após estimulação cerebral profunda do anterior thalamic nucleus

Analysis of Gene Expression Changes in the Rat Hippocampus After Deep Brain Stimulation of the Anterior Thalamic Nucleus

A estimulação cerebral profunda (DBS) cirurgia, tendo como alvo várias regiões do cérebro, como os gânglios basais, tálamo e regiões subtalâmico, é um tratamento eficaz para vários distúrbios de movimento que não conseguiram responder à medicação. Os progressos recentes no campo da cirurgia DBS começou a alargar a aplicação desta técnica cirúrgica para outras condições tão diversas como obesidade mórbida, depressão e transtorno obsessivo compulsivo. Apesar dessas indicações em expansão, pouco se sabe sobre os mecanismos fisiológicos subjacentes que facilitam os efeitos benéficos da cirurgia DBS. Uma abordagem a esta questão é a realização de análise de expressão gênica em neurônios que recebem a estimulação elétrica. Estudos anteriores demonstraram que a neurogénese no giro dentado de ratos é induzida em DBS segmentação do núcleo anterior do tálamo 1. Cirurgia DBS visando a ATN é amplamente utilizado para o tratamento da epilepsia refratária. É, portanto, de muito interest para nós para explorar as mudanças de transcrição induzidos ao estimular eletricamente o ATN. Neste artigo, são apresentadas as nossas metodologias para estereotaxicamente-guiada cirurgia DBS visando a ATN em ratos Wistar machos adultos. Discutimos também as etapas subseqüentes para dissecção dos tecidos, o isolamento do RNA, a preparação de cDNA e RT-PCR quantitativo para medir as mudanças de expressão gênica. Este método pode ser aplicado e modificado para estimular os gânglios da base e em outras regiões do cérebro normalmente clinicamente alvo. O estudo de expressão gênica descrito aqui assume uma abordagem gene alvo candidato para descobrir jogadores moleculares que poderiam ser direcionando o mecanismo para DBS.

As Figuras 1A e 1B mostram a expressão relativa de BDNF e GABRD em relação ao controlo do gene da β-actina. BDNF, uma neurotrofina é freqüentemente associada com efeitos neuroprotetores em muitas doenças neuronais 38-41. Por isso, é interessante analisar o perfil de BDNF expressão em resposta à estimulação da ATN que rende benefícios terapêuticos para doentes epilépticos. Na Figura 1A, que mostra o perfil de expressão gênica de BDNF entre os pontos temporais ...

O mecanismo subjacente aos efeitos terapêuticos da cirurgia de Estimulação Cerebral Profunda (DBS) precisa de investigação. Os métodos apresentados neste manuscrito descrevem uma abordagem experimental para examinar os eventos celulares desencadeados pela ECP, analisando o perfil de expressão gênica de genes candidatos que podem facilitar a neurogênese pós-cirurgia de ECP.

Análise das Alterações Gene expressão no Rat Hippocampus Após Estimulação Cerebral Profunda do Anterior Thalamic Nucleus

Deep brain stimulation (DBS) surgery, targeting various regions of the brain such as the basal ganglia, thalamus, and subthalamic regions, is an effective ...

O objetivo geral deste procedimento é realizar a estimulação cerebral profunda do núcleo anterior do tálamo e estudar as alterações na expressão gênica no hipocampo de ratos. Isso é realizado primeiramente anestesiando o animal. Em seguida, o animal é preparado para a cirurgia.Uma incisão é feita no couro cabeludo e o crânio é exposto. Em seguida, na posição correta em relação ao bgma, são feitos os orifícios de trepanação. Os eletrodos de estimulação cerebral profunda são inseridos e a estimulação é realizada.Por fim, o animal é eutanasiado e o cérebro é dissecado. Para remover o hipocampo, o tecido é processado para extração de RNA e é realizada a preparação de cDNA e PCR quantitativo. Em última análise, os resultados demonstram que a estimulação cerebral profunda influencia a expressão gênica no hipocampo de ratos.Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na cirurgia de estimulação cerebral profunda, como quais são os mecanismos moleculares subjacentes ao efeito terapêutico dessa cirurgia? As implicações dessa técnica estendem-se ao tratamento não apenas da epilepsia, mas também de outras condições neuronais, como a doença de Parkinson, a doença de Alzheimer e a distonia. Como a estimulação cerebral profunda está surgindo como uma abordagem cirúrgica para tratar muitos distúrbios neuronais, para se preparar para a cirurgia, utilize campos cirúrgicos para cobrir a bancada de trabalho e certifique-se de que haja um descarte adequado para resíduos biológicos.Pese o rato e calcule a dose de anestesia de acordo com o protocolo descrito no texto. Monte e fixe dois eletrodos no suporte de eletrodos de um estereotáxico e, com um microscópio, inspecione as pontas dos eletrodos para verificar o alinhamento adequado. Fixe os eletrodos a três milímetros de distância um do outro, tomando cuidado para não tocar as pontas dos eletrodos em superfícies duras. Injete a cetamina e o xilazina.Administre intraperitonealmente ao animal e confirme que o animal atingiu um plano cirúrgico de anestesia verificando o reflexo de pinçamento do dedo do pé, a frequência respiratória e a profundidade e regularidade da respiração. Fixe e posicione o animal no estereotáxico. Aplique lubrificante ocular nos olhos do animal para protegê-los contra ressecamento excessivo e desinfete o couro cabeludo com três fricções alternadas, cada uma com Betadine e álcool ou solução salina estéril.Coloque o animal sobre uma placa aquecida com água circulante ou use lâmpadas de aquecimento para manter a temperatura corporal do animal em um nível ideal. Com base no atlas cerebral de ratos de Paxinos e Watson, utilize as seguintes coordenadas estereotáxicas para direcionar ao núcleo talâmico anterior ou um ponto NT ântero-posterior negativo 1,6 milímetros, médio-lateral 1,5 milímetros e dorsoventral 5,2 milímetros.Em seguida, faça uma incisão no couro cabeludo na direção sagital para expor o crânio. Usando um par de afastadores, fixe o couro cabeludo incisado para expor o crânio. Em seguida, com cotonetes estéreis embebidos em etanol, limpe a região incisada para expor claramente as suturas. Localize o bgma e use uma caneta preta para marcar a posição que orientará a localização dos orifícios de trepanação.Faça mais duas marcas a aproximadamente 1,5 milímetros lateralmente em ambos os lados da sutura sagital e 1,6 milímetros posteriormente à sutura coronal. Para fazer os dois orifícios de trepanação, use etanol para desinfetar a ponta da broca.Usando uma broca mantida em um ângulo de 45 graus, faça os orifícios de trepanação alternando frequentemente entre os dois orifícios para evitar calor excessivo no centro de qualquer um deles. Continue a perfuração até que a dura-máter seja exposta. Usando uma agulha com a ponta dobrada em formato de L, remova quaisquer fragmentos ósseos soltos que possam obstruir a inserção do eletrodo.Tenha cuidado para evitar danos à dura-máter subjacente e ou ao tecido cerebral ao remover fragmentos ósseos. Fixe o conjunto de eletrodos duplos ao cabo rotativo do estereotáxico e fixe o cabo em um ângulo de 90 graus. Usando os ajustes no estereotáxico, posicione o eletrodo esquerdo exatamente acima do bgma.Usando os ajustes estereotáxicos para o meio. O posicionamento lateral moveu com precisão o eletrodo esquerdo 1,5 milímetros para o lado esquerdo do bgma, de modo que agora há dois eletrodos perfeitamente alinhados ao longo da sutura coronal, mas separados. 1,5 milímetros medialmente em direção ao lado lateral do bgma.Em seguida, com os ajustes estereotáxicos ântero-posteriores, mova os eletrodos 1,6 milímetros posteriormente à sutura coronal. Depois, com os ajustes dorsoventrais, abaixe os eletrodos para verificar primeiramente se os orifícios de trepanação foram feitos na localização correta, de modo que os eletrodos possam ser inseridos com facilidade, sem tocar nas bordas irregulares dos orifícios. Caso afirmativo, insira os eletrodos a uma profundidade de 5,2 milímetros a partir da superfície do crânio.Conecte os eletrodos por meio de cabos a um estimulador ajustado em 130 hertz, 2,5 volts e largura de pulso de 90 microssegundos. Aplique a estimulação de alta frequência por um período de tempo desejado. Realize estimulação unilateral ou bilateral.Após a estimulação, remova cuidadosamente os eletrodos e, com três pontos de sutura zero ou grampos cirúrgicos estéreis, feche a incisão, administre buprenorfina por via subcutânea e monitore o animal até que retorne à atividade normal, e então devolva-o à instalação de alojamento. Coloque o cérebro sobre uma matriz acrílica pré-resfriada em gelo utilizando uma lâmina de barbear. Corte o cérebro coronalmente a aproximadamente sete a oito milímetros da borda mais anterior do cérebro.Realize um segundo corte logo acima e posteriormente ao primeiro corte, de modo que uma fatia cerebral com aproximadamente cinco milímetros de espessura possa ser removida. Transfira a fatia cerebral para uma placa de Petri com PBS gelado utilizando uma lâmina de barbear, separe as duas seções hemisféricas e tenha cuidado para anotar qual seção corresponde aos lados esquerdo e direito, respectivamente. Usando pinça fina e tesoura, remova cuidadosamente o hipocampo, congele o tecido em gelo seco e armazene a −20 graus Celsius até o momento de realizar os passos subsequentes de RNA, realizados de acordo com o protocolo descrito aqui, que mostra os níveis relativos de expressão de BDNF em comparação com o gene controle beta-actina nos pontos de tempo indicados.Estímulo pós-DBS. A superexpressão do BDNF é observada imediatamente após a cirurgia de DBS, juntamente com o pico de expressão três horas após o estímulo. Essa observação sugere que uma expressão aumentada de BDNF e a neuroproteção resultante poderiam contribuir para o benefício terapêutico da DBS em pacientes epilépticos.Este painel ilustra a expressão do receptor de GABA, G-A-B-R-D, que mostra expressão aumentada nos animais estimulados em comparação com os controles não estimulados três horas após a EED. Considerando que agonistas do GABA são utilizados como supressores eficazes de convulsões, é interessante observar o aumento da expressão de G-A-B-R-D após a EED, implicando um possível papel do GABA no efeito anti-epiléptico da EED. Após este procedimento.Outros métodos, como o western blot, imunoprecipitação de cromatina e muitos outros ensaios moleculares biológicos padrão, podem ser realizados. Isso ajuda a responder perguntas relacionadas a alterações na expressão proteica, modificações pós-traducionais, ocupação de fatores de transcrição em regiões promotoras específicas de genes, entre outras. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como realizar cirurgia de estimulação cerebral profunda em ratos.Isole o tecido hipocampal e analise-o quanto a alterações na expressão gênica.

analysis-gene-expression-changes-rat-hippocampus-after-deep-brain

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Fonte: Casquero-Veiga, M. et al. Tomografia por emissão de pósitrons in vivo para revelar padrões de atividade induzidos por estimulação cerebral profunda em ratos. J. Vis. Exp. (2022).Este vídeo demonstra os efeitos metabólicos da estimulação cerebral profunda (DBS) usando imagens FDG-PET em um modelo de rato. Ele descreve as etapas envolvidas na administração de FDG, aplicação de DBS e imagens de PET/CT para mapear regiões cerebrais com atividade metabólica aumentada ou suprimida.

Avaliação da neuromodulação metabólica induzida por estimulação cerebral profunda aguda em ratos usando FDG-PET in vivo

Fonte: Selvakumar, T., et al., Análise de alterações na expressão gênica no hipocampo de ratos após estimulação cerebral profunda do núcleo talâmico anterior. J. Vis. Exp. (2015)Este vídeo demonstra o procedimento de implantação de eletrodos no cérebro de ratos para aplicar estimulação cerebral profunda (DBS), que modula a atividade neuronal e melhora a comunicação com o hipocampo, apoiando a sobrevivência neuronal e a neurogênese.

Efeitos da estimulação cerebral profunda na atividade neuronal do hipocampo em um modelo de rato

Este vídeo demonstra a detecção da síntese de RNA do receptor de serotonina usando sondas de oligonucleotídeos no tecido cerebral de ratos afetado pela síndrome da serotonina. O protocolo inclui pré-tratamento de tecido, hibridização por sonda e detecção enzimática para visualizar e quantificar a expressão do RNA do receptor de serotonina ao microscópio.

Hibridização in situ usando sondas de oligonucleotídeos para estudar a expressão de RNA em seções cerebrais de ratos

Nós descrevemos como usar microdissecção a laser de captura (LCM) para obtenção das populações enriquecidas de neurônios do hipocampo ou neurônios individuais a partir de cortes congelados do cérebro do rato feridos para posterior análise de expressão de genes usando quantitativa PCR em tempo real e / ou do genoma inteiro microarrays.

Laser Microdissecção Captura de Populações enriquecida de neurônios ou neurônios individuais para análise de expressão gênica após a lesão cerebral traumática

Este protocolo descreve um método padrão para simultânea ressonância magnética funcional e estimulação cerebral profunda no roedor. O uso combinado dessas ferramentas experimentais permite a exploração de actividade a jusante global em resposta à estimulação elétrica em praticamente qualquer alvo cérebro.

Estimulação Cerebral Profunda com fMRI simultâneo em Roedores

Um método para implantar eletrodos no núcleo subtalâmico (STN) de ratos é descrito. A melhor localização do STN foi obtida usando um sistema de microregistro. Além disso, é apresentada uma configuração de estimulação caracterizada por conexões duradouras entre a cabeça do animal e o estimulador.

Microeletrodos guiada implantação de eletrodos no subtalâmica Núcleo de Ratos por longo prazo Estimulação Profunda do Cérebro

A estimulação cerebral profunda (DBS) é uma opção de tratamento eficaz para a doença de Parkinson. Estabelecemos um desenho de estudo para rastrear novos paradigmas de estimulação em ratos. O protocolo descreve o uso do teste da escada e do teste do cilindro para avaliação do resultado motor em ratos hemiparkinsonianos tratados com DBS.

Uma nova abordagem para avaliar o resultado Motor de profunda do cérebro dos efeitos de estimulação no Rato Hemiparkinsonian: Escadaria e cilindro de ensaio

Aplicamos estimulação magnética transcraniana repetitiva (EMTr) no hemisfério unilateral do cérebro de ratos, colocando uma bobina de 25 mm em forma de 8 1 cm lateral ao vértice da linha biauricular e angulando a bobina em 45°. Um sistema interno de resfriamento de água foi usado para rTMS por mais de 20 min.

Estimulação Magnética Transcraniana repetitiva para o Hemisfério unilateral do cérebro de rato

Este protocolo mostra como configurar um método confiável de HFS em camundongos. Neurônios em todo giro denteado do hipocampo são estimulados eletricamente por HFS diretamente e indiretamente em vivo. Atividade neuronal e sinalização molecular são examinados por c-fos e coloração imunofluorescente Notch1, respectivamente; neurogênese é quantificada pela bromodeoxyuridine para ensaio de rotulagem.

Um método invasivo para a ativação do giro denteado do Mouse pela estimulação de alta frequência

Estimulação transcraniana de corrente contínua (tDCS) é uma técnica terapêutica proposta para tratar doenças psiquiátricas. Um modelo animal é essencial para entender as alterações biológicas específicas evocadas por tDCS. Este protocolo descreve um modelo do rato tDCS que utiliza um eletrodo implantado cronicamente.

Transcraniana por corrente contínua estimulação (tDCS) em ratos

Descrevemos um método experimental pré-clínico para avaliar a neuromodulação metabólica induzida por estimulação cerebral profunda aguda com FDG-PET in vivo. Este manuscrito inclui todas as etapas experimentais, desde a cirurgia estereotáxica até a aplicação do tratamento de estimulação e a aquisição, processamento e análise de imagens PET.

In vivo Tomografia por emissão de pósitrons para revelar padrões de atividade induzidos pela estimulação cerebral profunda em ratos

Aprenda a realizar estimulação cerebral profunda do núcleo talâmico anterior em ratos Wistar e analisar alterações na expressão gênica do hipocampo. Este método permite investigar mecanismos moleculares subjacentes aos efeitos terapêuticos da ECP.

Análise das Alterações Gene expressão no Rat Hippocampus Após Estimulação Cerebral Profunda do Anterior Thalamic Nucleus

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