Análise das Alterações Gene expressão no Rat Hippocampus Após Estimulação Cerebral Profunda do Anterior Thalamic Nucleus

O mecanismo subjacente aos efeitos terapêuticos da cirurgia de Estimulação Cerebral Profunda (DBS) precisa de investigação. Os métodos apresentados neste manuscrito descrevem uma abordagem experimental para examinar os eventos celulares desencadeados pela ECP, analisando o perfil de expressão gênica de genes candidatos que podem facilitar a neurogênese pós-cirurgia de ECP.

O objetivo geral deste procedimento é realizar a estimulação cerebral profunda do núcleo talâmico anterior e estudar as alterações na expressão gênica no hipocampo de ratos. Isso é feito primeiro anestesiando o animal. Em seguida, o animal é preparado para a cirurgia.

Uma incisão é feita no couro cabeludo e o crânio é exposto. Em seguida, na posição correta em relação ao bgma, os orifícios da broca são feitos. Os eletrodos DBS são inseridos e a estimulação é realizada.

Finalmente, o animal é sacrificado e o cérebro é dissecado. Para remover o hipocampo, o tecido é processado para extração de RNA e preparação de CDNA e QPCR são realizados. Em última análise, os resultados demonstram que a estimulação cerebral profunda influencia a expressão gênica no hipocampo de ratos.

Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave na cirurgia de estimulação cerebral profunda, como quais são os mecanismos moleculares subjacentes ao efeito terapêutico da cirurgia de estimulação cerebral profunda? As implicações dessa técnica se estendem à terapia não apenas da epilepsia, mas também de outras condições neuronais, como doença de Parkinson, doença de Alzheimer e distonia. Porque o DPS está emergindo como uma abordagem cirúrgica para tratar muitos distúrbios neuronais Para se preparar para a cirurgia, use almofadas cirúrgicas para cobrir a bancada e garantir que haja um descarte de resíduos de risco biológico disponível.

Pese o rato e calcule a dose da anestesia de acordo com a montagem do protocolo de texto e prenda dois eletrodos no suporte do eletrodo de uma estrutura cirúrgica estereotáxica e, com um microscópio, inspecione as pontas do eletrodo quanto ao alinhamento adequado. Prenda os eletrodos a três milímetros de distância, tomando cuidado para não tocar na ponta do eletrodo em superfícies duras. Injete a xilazina cetamina.

Misture intraperitoneal ao animal e confirme se o animal atingiu um plano cirúrgico de anestesia, verificando o reflexo de pinça do dedo do pé, a frequência respiratória e a profundidade e regularidade da respiração. Prenda e posicione o animal na estrutura estereotáxica. Aplique lubrificante ocular nos olhos do animal para proteger do ressecamento excessivo e desinfete o couro cabeludo com três esfoliantes alternados, cada um com Betadine e álcool ou soro fisiológico estéril.

Coloque o animal em uma almofada de água morna circulante ou use lâmpadas de aquecimento para manter a temperatura corporal do animal em um nível ideal. Com base no atlas cerebral de ratos Paxos e Watson, use as seguintes coordenadas estereotáxicas para direcionar o núcleo talâmico anterior ou um NT anterior posterior negativo 1,6 milímetros. Medial lateral 1,5 milímetros e dorso ventral 5,2 milímetros.

Em seguida, faça uma incisão no couro cabeludo sagital para revelar o crânio Usando um par de afastadores, prenda o couro cabeludo inciso para expor o crânio. Em seguida, com cotonetes estéreis embebidos em etanol, limpe a região incisada para expor as suturas com clareza. Localize o bgma e use um marcador preto para comercializar para orientar a posição dos orifícios de broca.

Faça mais duas marcas em aproximadamente 1,5 milímetros. Média lateralmente em ambos os lados da sutura sagital e 1,6 milímetros posterior à sutura coronal. Agora, para fazer os dois furos, use etanol para desinfetar a ponta da broca.

Usando uma broca mantida em um ângulo de 45 graus, faça os furos das brocas alternando frequentemente entre os dois furos para evitar calor excessivo no centro de qualquer furo. Continue perfurando até que a dura-máter fique exposta. Usando uma agulha com a ponta dobrada em forma de L, remova quaisquer pedaços de osso quebrados que obstruam a inserção do eletrodo.

Tome cuidado para evitar danificar a dura-máter subjacente e/ou o tecido cerebral ao remover fragmentos ósseos. Fixe o conjunto de eletrodo duplo na alça giratória da estrutura estereotáxica e fixe a alça em um ângulo de 90 graus. Usando os ajustes no quadro estereotáxico, posicione o eletrodo esquerdo exatamente acima do bgma.

Usando os ajustes estereotáxicos para mídia. O posicionamento lateral moveu com precisão o eletrodo esquerdo 1,5 milímetros para o lado esquerdo do bgma, de modo que agora existem dois eletrodos perfeitamente alinhados ao longo da sutura coronal, mas espaçados. Meio de 1,5 milímetros lateralmente a partir do BGMA.

Em seguida, com os ajustes estereotáxicos ântero-posteriores, mova os eletrodos 1,6 milímetros para trás da sutura coronal. Em seguida, com os ajustes ventrais dorsais, abaixe os eletrodos para verificar primeiro se os orifícios das brocas foram feitos no local correto, de modo que os eletrodos possam ser inseridos com facilidade sem tocar nas bordas ásperas dos orifícios das brocas. Em caso afirmativo, insira os eletrodos a uma profundidade de 5,2 milímetros da superfície do crânio.

Conecte os eletrodos por meio de eletrodos a um estimulador ajustado para 130 hertz, 2.5 volts e largura de pulso de 90 microssegundos. Forneça estimulação de alta frequência por um período de tempo desejado. Realização de estimulação unilateral ou bilateral.

Após a estimulação, remova cuidadosamente os eletrodos e, com três suturas zero ou grampos cirúrgicos estéreis, suture a incisão, administre buprenorfina por via subcutânea e monitore o animal até que ele retorne à atividade normal e, em seguida, devolva-o ao alojamento. Coloque o cérebro em uma matriz cerebral de acrílico pré-frio no gelo usando uma lâmina de barbear. Corte a corly cerebral a aproximadamente sete a oito milímetros da borda mais anterior do cérebro.

Faça um segundo corte corly e posteriormente ao primeiro corte para que uma fatia de cérebro de aproximadamente cinco milímetros de espessura possa ser removida. Transfira a fatia do cérebro para uma placa de Petri com PBS gelado usando uma lâmina de barbear, corte as duas seções hemisféricas e observe qual seção corresponde aos lados esquerdo e direito, respectivamente. Usando pinças finas e tesouras, remova cuidadosamente o flash do hipocampo, congele o tecido em gelo seco e armazene a 20 graus Celsius negativos até que esteja pronto para as etapas subsequentes de RNA realizadas de acordo com o protocolo de texto mostrado aqui são os níveis relativos de expressão de BDNF em comparação com o gene de controle beta actina nos pontos de tempo indicados.

Estimulação pós-DBS. A regulação positiva do BDNF é observada imediatamente após a cirurgia de DBS, juntamente com o pico de expressão três horas após a estimulação. Essa observação sugere que uma expressão aprimorada de BDNF e a neuroproteção resultante podem contribuir para o benefício terapêutico do DBS para pacientes epilépticos.

Este painel ilustra a expressão do receptor GABA, G-A-B-R-D, que mostra expressão aumentada nos animais estimulados em comparação com controles não estimulados três horas após o DBS. Considerando que os agonistas do GABA são usados como supressores de convulsões eficazes, é interessante observar a expressão aumentada de G-A-B-R-D após DBS, implicando um possível papel para o GABA e o efeito antiepiléptico do DBS. Seguindo este procedimento.

Outros métodos como bloqueio ocidental, imunoprecipitação de cromatina e muitos outros ensaios biológicos moleculares padrão podem ser realizados. Isso ajuda a responder a perguntas relacionadas a mudanças na expressão de proteínas, modificações pós-traducionais, ocupação do fator de transcrição em regiões promotoras de genes específicas, etc. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como realizar a cirurgia de estimulação cerebral profunda em ratos.

Isole o tecido do hipocampo e analise-o quanto a alterações na expressão gênica.