Name: Transcraniana por corrente contínua estimulação (tDCS) em ratos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 54 s
Description: Aprenda a aplicar estimulação transcraniana por corrente contínua (tDCS) em camundongos usando eletrodos implantados. Este protocolo detalhado permite estudar efeitos biológicos em transtornos psiquiátricos com análise de parâmetros de estimulação.

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Agradecemos o Sr. Rodrigo de Souza para assistência na manutenção de colônias de rato. L.A.V.M é um pós-doutorado da CAPES. Este trabalho foi financiado pela subvenção PRONEX (FAPEMIG: APQ-00476-14).

Adulto masculino alojados individualmente (8-12 semanas) camundongos C57BL/6 foram utilizados neste experimento. Os animais receberam cuidados antes, durante e após procedimentos experimentais com alimentos e água ad libitum. Todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê de ética animal da Universidade Federal de Minas Gerais (protocolo número 59/2014).
1. colocação do eletrodo
<ol><li>
Sedativo e fixando o animal para o aparelho estereotáxica
	<ol>
<li>Esterilize todos os instrumentos cirúrgicos necessários. Romance Instrumentos cirúrgicos foram esterilizados por 3 minutos a 440 ° C. Cotonetes de algodão foram autoclavados a 20 psi (libras por polegada quadrada) a 121 ° C por 20 min.</li>
		<li>Ajuste o controlador térmico plataforma 37 ° c.</li>
		<li>Pesar o animal e calcular a dose adequada para a indução da anestesia. Use uma mistura de ketamina e xilazina, na dose de 100 mg/kg quetamina e 8 mg/kg xilazina, dada intraperitonealmente (tamanho de agulha, 31G). O animal deve dormir dentro de 2 a 3 min.</li>
		<li>Use um barbeador elétrico ou lâmina de barbear para depilar o local cirúrgico.</li>
		<li>Lugar do animal para o aparelho estereotáxica sobre o pré-aquecido a placa de aquecimento.</li>
		<li>Segure a cabeça do animal e inserir as barras de orelha de ponta em cada uma das orelhas do animal para corrigi-lo para a plataforma estereotáxica.</li>
		<li>Verifique se não há nenhum deslocamento cabeça lateral e pouco movimento vertical depois deslocando lentamente a cabeça do animal de posicionamento.</li>
		<li>Delicadamente, deslize a máscara de anestesia sobre o nariz do rato e fixá-lo apertando o parafuso.</li>
		<li>Defina o isoflurano a 1% com 1,0 L/min de O2.</li>
		<li>Aplica a pomada para os olhos do animal para evitar a secura da córnea durante a cirurgia.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Anexar o implante na cabeça do animal
	<ol>
<li>Use os cotonetes de algodão para preparar o local cirúrgico com três esfrega alternadas de iodo-povidona (ou clorexidina 2%) e 70% de etanol.</li>
		<li>Use um par de pinças para verificar a profundidade de anestesia levemente apertando os dedos do animal e verificar a perda do reflexo de retirada de pedal (pitada de dedo do pé) do animal.</li>
		<li>Fazer uma incisão de cerca de 3 mm posterior à linha de orelha do animal e parar na linha do olho. O local da incisão deve ter cerca de 1 cm de comprimento para ser grande o suficiente para receber o implante.</li>
		<li>Raspe suavemente o crânio com um raspador de osso para melhorar a colagem e a aderência do cimento. Fazer esta luz sozinho com a intenção de criar micro riscos.</li>
		<li>Posicione cuidadosamente cirúrgicos ganchos para manter o campo cirúrgico aberto e livre de obstruções, tais como pele e pelo, a pele frouxa.</li>
		<li>Use um cotonete estéril para secar o couro cabeludo do animal.</li>
		<li>Use um microscópio de dissecação para visualizar a parte superior do crânio do animal.</li>
		<li>Anexar uma agulha para o titular estereotáxica e localize o bregma. Posição da agulha diretamente acima da cabeça do animal, tocando ligeiramente o bregma.</li>
		<li>Zerar todas as coordenadas sobre o apalpador digital e em seguida levante a agulha.</li>
		<li>Fixe o implante tDCS sobre o titular estereotáxica. Posicionar o implante na cabeça do animal e abaixá-lo lentamente para a região de interesse usando as coordenadas estereotáxicos adequadas.</li>
		<li>Use uma agulha para espalhar 1 gota (aproximadamente 35 μL) de super cola na base do implante.</li>
		<li>Mova lentamente o titular para baixo até que toca o crânio. Certifique-se de que a base do implante está inteiramente em contato com a superfície.</li>
		<li>Prepare o cimento cirúrgico de acordo com as instruções do fabricante.</li>
		<li>Após o posicionamento preciso, aplicar 3 fina, nem camada de cimento em todo o crânio e para a parte inferior do implante. Aplique a gota por gota, usando um pincel de aplicação. Camadas devem formar uma estrutura em forma de colina para mais apoio estrutural do implante.</li>
		<li>Deixe a rosca do implante limpo de cimento para permitir uma conexão desobstruída, suave.</li>
		<li>Permitir que cada camada secar por aproximadamente 4 minutos.</li>
		<li>Quando seco, remova cuidadosamente o titular até que seja completamente separado do implante. Sempre use extremo cuidado ao manusear o implante, já que isso pode ser acidentalmente extraído do crânio do animal.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Terminar a cirurgia e cuidados pós-cirúrgicos
	<ol>
<li>Hidrate a pele do animal no local da incisão com um cotonete embebido em solução salina.</li>
		<li>Casaco de pele por cima da base do implante tDCS.</li>
		<li>Use um par de pinças para unir o tecido e fechar a incisão com uma gota de cola de tecido cirúrgico por 0,2 cm do tecido.</li>
		<li>Infiltrar-se 1-2% de lidocaína no local da incisão e subjacentes tecidos.</li>
		<li>Hidrate o mouse com 500 µ l de solução de lactato de Ringer por via subcutânea.</li>
		<li>Coloque o mouse em uma gaiola limpa, alojados em single de pré-aquecido (37 ° C).</li>
		<li>Coloque um pequeno prato com pelotas de alimentos molhados na gaiola para facilitar o acesso à comida nas horas seguintes.</li>
		<li>Registre peso pós-cirúrgica do animal.</li>
		<li>Dar o animal cetoprofeno (5 mg/kg) por via subcutânea após a cirurgia e nos próximos 2 dias.</li>
		<li>Acompanhar a recuperação do animal de perto pelo menos 1 semana. Avalie qualquer sinal de stress, tais como Piloereção, falta de higiene, locomoção reduzida, coçar ferida e inflamação do local cirúrgico.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. tDCS Setup e estimulação
<ol><li>
tDCS Setup (ver Figura 2) Nota. Certifique-se de que o estimulador tDCS está totalmente carregado.<ol>
<li>Conecte os cabos do ânodo e o cátodo ao estimulador tDCS e disponibilizá-los perto do local de estimulação. Anexe o eletrodo tipo pino para o titular estereotáxica.</li>
		<li>Definir a plataforma termal a 37 ° C.</li>
		<li>Ligue o medidor de fluxo de oxigênio no sistema de anestesia por inalação de 1 L/min.</li>
		<li>Posicione o mouse na câmara de indução da anestesia.</li>
		<li>Ligue o vaporizador de isoflurano para 3%. Permitir que o animal se submeter a efeitos de isoflurano durante 4 min.</li>
		<li>Enquanto o animal está na câmara de indução, use uma seringa estéril para preencher o eléctrodo de corpo com solução salina 0,9%.</li>
		<li>Remover o animal da câmara de indução e posicione seu peito sobre o eléctrodo de corpo.</li>
		<li>Delicadamente, deslize a máscara de anestesia sobre o nariz do rato e fixá-lo. Baixa a saída de isoflurano para 1,5%.</li>
		<li>Encher o implante e o eletrodo tipo pino com soro e cuidadosamente anexá-los.</li>
		<li>Ajuste o tempo de estimulação e intensidade de corrente.</li>
		<li>Verificar a qualidade de contato em tDCS estimulador. Contato ideal vai de 7 a 10, numa escala de 1 a 10.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Estimulação
	<ol>
<li>Começa a estimulação.</li>
		<li>Observar o atual de rampa por 30 s para o valor selecionado e mantendo-se firme pelo tempo estabelecido, então, no final da sessão de rampa para baixo novamente.</li>
		<li>Ative o botão de Souza para ratos controle.</li>
		<li>Observar o atual de rampa por 30 s ao valor selecionado e, em seguida, para baixo a 1 para o resto do período de estimulação com uma rampa final ao valor selecionado no final com uma rampa consecutivo para baixo.</li>
		<li>Uma vez concluída a sessão de estimulação, transferi cuidadosamente o animal a uma gaiola pré-aquecido (37 ° C) por 10 min. Nota. Os animais começam a despertar após 3 min.</li>
		<li>Desliga o sistema de anestesia por inalação.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Nos últimos anos, técnicas de neuroestimulação tem sido entrar em prática clínica como um procedimento promissor para tratar distúrbios neuropsiquiátricos23. Para reduzir a restrição imposta pela falta de conhecimento dos mecanismos de neuroestimulação, aqui apresentamos um modelo de mouse tDCS carregando um eletrodo que pode direcionar a regiões do cérebro. Desde que o eletrodo é cronicamente implantável, este modelo animal permite a investigação de efeitos biológicos de longa duração evocada por...

Estimulação transcraniana de corrente contínua (tDCS) é uma técnica não-invasiva, de baixo custo, terapêutica, que se centra na modulação neuronal através do uso de correntes contínuas de baixa intensidade1. Atualmente existem duas configurações (anodal e cathodal da) para tDCS. Enquanto que a estimulação anodal exerce um campo elétrico atual fraco demais para desencadear potenciais de ação, eletrofisiologia estudos têm demonstrado que este método produz alterações na plasticidade sináptica2. Por exemplo, a evidência mostra que tDCS induz os efeitos a longo prazo (LTP) de potenciação como pico maior amplitude dos potenciais pós-sinápticos excitatórios3,4 e modulação da excitabilidade cortical5.
Por outro lado, cathodal da estimulação induz a inibição, resultando em hiperpolarização de membrana6. Uma hipótese para este mecanismo é baseada nas observações fisiológicas onde tDCS é descrita para modular a frequência do potencial de ação e duração no corpo neuronal3. Notavelmente, este efeito não diretamente evocar potenciais de ação, que pode deslocar o limiar de despolarização e facilitar ou dificultar o disparo neuronal7. Estes efeitos de contraste tenham sido demonstradas anteriormente. Por exemplo, estimulação anodal e cathodal da produziu efeitos opostos em respostas condicionados registradas através de eletromiografia atividade em coelhos8. No entanto, estudos mostraram também que sessões de estimulação anodal prolongada podem diminuir a excitabilidade enquanto crescente cathodal da correntes pode levar a excitabilidade, apresentando auto contraste efeitos3.
Estímulos anodal e cathodal da agregam o uso de pares de eletrodo. Por exemplo, na estimulação anodal, "ativo" ou "ânodo" eletrodo é colocado sobre a região do cérebro a ser modulada, Considerando que o eletrodo "referência" ou "raios catódicos" situa-se sobre uma região onde o efeito da corrente é considerado insignificante9. Na cathodal da estimulação, disposição de eletrodo é invertida. A intensidade de estimulação para tDCS eficaz depende da intensidade de corrente e dimensões de eletrodo, que afectam o elétrico de campo diferente10. Em estudos mais publicados, a intensidade de corrente média é entre 0,10 a 2,0 mA e 0.1 mA para 0,8 mA para humanos e ratos, respectivamente de6,11. Embora o tamanho de eletrodo de 35cm2 é normalmente usado em seres humanos, não há nenhuma compreensão adequada sobre dimensões de eletrodo para roedores e uma investigação mais aprofundada é necessário6.
tDCS foi proposto em estudos clínicos com a tentativa de oferecer um tratamento alternativo ou complementar para vários distúrbios neurológicos e neuropsiquiátricos11 como epilepsia12, transtorno bipolar13, acidente vascular cerebral5 , major depressão14, a doença de Alzheimer15, esclerose múltipla16 e a doença de Parkinson17. Apesar da crescente interesse em tDCS e sua utilização em ensaios clínicos, detalhada celular e moleculares evocadas alterações no tecido cerebral, curto e efeitos duradouros, bem como os resultados comportamentais, estão ainda ser mais profundamente investigada18, 19. como uma abordagem humana direta para estudar exaustivamente tDCS não é viável, a utilização de um modelo animal tDCS pode oferecer insights valiosos sobre os eventos celulares e moleculares subjacentes os mecanismos terapêuticos das tDCS devido a acessibilidade para os tecido de cérebro do animal.
Evidência disponível é limitada em relação a modelos tDCS em camundongos. A maioria dos modelos relatados usado diferentes layouts responsável, eletrodo de dimensões e materiais. Por exemplo, Winkler et al . (2017) implantou o cabeça do eléctrodo (Ag/AgCl, 4 mm de diâmetro) preenchido com solução salina e fixa-lo ao crânio com acrílico de cimento e parafusos20. Diferente da nossa abordagem, eletrodo seu peito foi implantado (platina, 20 x 1.5 mm). Nasehi et al . (2017) usado um procedimento muito semelhante ao nosso, embora o eletrodo torácico foi feito de uma esponja embebida em solução salina (carbono preenchido, 9,5 cm2)21. Outro estudo implantou os dois eléctrodos na cabeça do animal, o que foi conseguido usando placas fixas e cobrindo a cabeça do animal com um hidrogel condutor22. Aqui, descrevemos um modelo do rato tDCS que utiliza um eletrodo cronicamente implantado por meio cirúrgico procedimentos e tDCS configuração simples (Figura 1).

<table><tbody><tr><td>Seringa BD Ultra-Fine 50U</td><td>BD</td><td>10033430026</td><td>Para injeção intraperitoneal.</td></tr><tr><td>Barbeador (Philips Multigroom)</td><td>Philips (Brasil)</td><td>QG3340/16</td><td>Para aparar o local cirúrgico.</td></tr><tr><td>Equipamento Cirúrgico</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Modelo 940 Instrumento Estereotáxico para Pequenos Animais com Console de Display Digital</td><td>KOPF</td><td>940</td><td>Para restrição e posicionamento cirúrgico de animais.</td></tr><tr><td>Modelo 922 Não-ruptura barras de orelha de ponta de 60 graus</td><td>KOPF</td><td>922</td><td>Para restrição cirúrgica animal e posicionamento.</td></tr><tr><td>Suporte de cânula</td><td>KOPF</td><td>1766-AP</td><td>Para posicionamento de implantes.</td></tr><tr><td>Microscópio binocular de zoom estéreo de precisão (III) no suporte de lança</td><td>WPI</td><td>PZMIII-BS</td><td>Para localização de bregma e posicionamento de implantes.</td></tr><tr><td>Sistema de Controle de Temperatura Modelo&nbsp;</td><td>KOPF</td><td>TCAT-2LV</td><td>Para controle térmico animal.</td></tr><tr><td>Fonte de Luz Fria</td><td>WPI</td><td>WA-12633</td><td>Para brilho focal</td></tr><tr><td>Sistema de anestesia de animais de laboratório de mesa com Scavenging</td><td>VetEquip</td><td>901820</td><td>Para administração e segurança de isoflurano.</td></tr><tr><td>Filtro de Adsorção de Carvão Ativado VaporGuard</td><td>VetEquip</td><td>931401</td><td>Medidas de segurança do sistema de entrega.&nbsp;</td></tr><tr>Suporte principal <td>KOPF</td><td>923-B</td> da <td>anestesia do gás do rato do rato</td> modelo 923-B <td>Para a limitação animal e a entrega de O2 e do isoflurano.</td></tr><tr><td>Regulador de oxigênio, E-cylinder&nbsp;</td><td>VetEquip</td><td>901305</td><td>para regulação e entrega de O2.</td></tr><tr><td>Mangueira de oxigênio - verde&nbsp;</td><td>VetEquip</td><td>931503</td><td>para administração de O2 e isoflurano.</td></tr><tr><td>Esterilizador infravermelho 800 &ordm; C</td><td>Marconi</td><td>MA1201</td><td>Para esterilização de instrumentos.</td></tr><tr><td>Instrumentos Cirúrgicos</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tesouras Finas - ToughCut</td><td>Fine Science Tools</td><td>14058-11</td><td>Para incisão.</td></tr><tr><td>Ganchos cirúrgicos</td><td>INJEX</td><td>1636</td><td>fabricados internamente - Usados para limpar o local cirúrgico da pele e do pelo.</td></tr><tr><td>Pinças ou fórceps padrão</td> <td>-</td><td></td> <td>Para agarrar a pele.</td></tr><tr><td>Consumíveis Cirúrgicos</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vetbond</td><td>3M</td><td>SC-361931</td><td>Para fechamento de incisão.</td></tr><tr><td>KIT de Cimento e Catalisador (Duralay)</td><td>Reliance</td><td>2OZ</td><td>Para fixação de implantes.</td></tr><tr><td>Cotonetes Estéreis (Autoclavados)</td><td>JnJ</td><td>75U</td><td>Para antissepsia do local cirúrgico.&nbsp;</td></tr><tr><td>Placa de 24 poços (placa de cultura de tecidos)</td> <td>SARSTEDT</td><td>831.836</td><td>Para preparação de cimento.</td></tr><tr><td>Aplicação Pincel</td><td>parkell</td><td>S286</td><td>Para mistura e aplicação de cimento.</td></tr><tr><td><forte>Farmacêutica</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xilazina (ANASEDAN 2%)</td><td>Ceva Farmacêutica (Brasil)</td><td>P10160</td><td>Para indução anestésica.</td></tr><tr><td>Cetamina (DOPALEN 10%)</td><td>Ceva Farmacêutica (Brasil)</td><td>P30101</td><td>Para indução anestésica.</td></tr><tr><td>Isoflurano (100%)</td><td>Crist&aacute; lia (Brasil)</td><td>100ML</td><td>Para manutenção da anestesia.</td></tr><tr><td>Lidocaína (XYLESTESIN 5%)</td><td>Cristal</td> <td>Pharma-Para</td> <td>cuidados pós-cirúrgicos.</td></tr><tr><td>Cetoprofeno (PROFENID 100 mg)</td><td>Sanofi Aventis</td><td>20ML</td><td>Para cuidados pós-cirúrgicos.</td></tr><tr><td>Solução de Lactato de Ringer</td><td>SANOBIOL LAB</td><td>7898153652145</td><td>Para cuidados pós-cirúrgicos.</td></tr><tr><td>TobraDex (Dexametasona 1 mg/g)</td><td>Alcon</td><td>631</td><td>Para lubrificação e proteção ocular.&nbsp;</td></tr><tr><td><forte>Estimulação</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Animal Estimulador Transcraniano</td><td>Soterix Medical</td><td>2100</td><td>Para a geração atual.</td></tr><tr><td>Suporte de eletrodo tipo pino (Base de suporte cilíndrico)</td><td>Suporte de eletrodo Soterix Medical</td><td>2100</td><td>(Implante).</td></tr><tr><td>Eletrodo tipo pino (Ag/AgCl)</td><td>Soterix Medical</td><td>2100</td><td>Para entrega de corrente (eletrodo).&nbsp;</td></tr><tr><td>Tampa de eletrodo tipo pino</td><td>Soterix Medical</td><td>2100</td><td>Para proteção de implantes.</td></tr><tr><td>Corpo de Eletrodo (Revestido Ag/AgCl)</td><td>Soterix Medical</td><td>2100</td><td>Para entrega de corrente (eletrodo).&nbsp;</td></tr><tr><td>Solução salina (0,9%)</td><td>FarmaX</td><td>7896902206441</td><td>Meio condutor para entrega de corrente.</td></tr><tr><td>Pinças ou fórceps padrão</td> <td>-</td><td></td> <td>Para configuração de ETCC.</td></tr><tr><td>Reação em cadeia da polimerase em tempo real</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BioRad CFX96 Sistema em tempo real</td><td>BioRad</td><td>C1000</td><td>para qPCR</td></tr><tr><td>SsoAdvancedTM Universal SYBR Green Supermix (5 X 1mL)</td><td>BioRad</td><td>1725271</td><td>Para placas</td></tr><tr><td>de PCR de casca dura qPCR PCT COM 50 p/ CFX96</td><td>BioRad</td><td>HSP9601</td><td>Para qPCR</td></tr><tr><td>Microseal "B" selo pct c/ 100</td><td>BioRad</td><td>MSB1001</td><td>para qPCR</td></tr></tbody></table>

transcraniana por corrente contínua estimulação (tdcs) em ratos

Transcranial Direct Current Stimulation (tDCS) in Mice

Estimulação transcraniana de corrente contínua (tDCS) é uma técnica de neuromodulação não-invasiva, proposta como um tratamento alternativo ou complementar para várias doenças neuropsiquiátricas. Os efeitos biológicos das tDCS não são totalmente compreendidos, que em parte é explicado devido à dificuldade na obtenção de tecido do cérebro humano. Este protocolo descreve um modelo do rato tDCS que utiliza um eletrodo implantado cronicamente permitindo o estudo dos efeitos biológicos duradouro das tDCS. Neste modelo experimental, tDCS altera a expressão do gene cortical e oferece uma contribuição proeminente para o entendimento da justificativa para seu uso terapêutico.

O protocolo cirúrgico apresentou estabilidade a longo prazo do implante pelo menos um mês, sem sinais inflamatórios no local estimulado, nem qualquer outro efeito indesejado. Todos os animais sobreviveram as sessões de procedimento e tDCS cirúrgicas (n = 8). Neste experimento, tDCS implantes foram posicionados sobre os córtices M1 e M2 (+1,0 mm ântero-posterior e lateral de 0.0 mm para bregma). Uma semana depois, tDCS (n = 3-4) e sham (n = 3) ratos foram estimulados por cinco dias consecu...

Estimulação transcraniana de corrente contínua (tDCS) é uma técnica terapêutica proposta para tratar doenças psiquiátricas. Um modelo animal é essencial para entender as alterações biológicas específicas evocadas por tDCS. Este protocolo descreve um modelo do rato tDCS que utiliza um eletrodo implantado cronicamente.

Transcraniana por corrente contínua estimulação (tDCS) em ratos

Transcranial direct current stimulation (tDCS) is a non-invasive neuromodulation technique proposed as an alternative or complementary treatment for ...

O Procedimento Alvar Gaaud é aplicar estimulação de corrente direta transcraniana em camundongos. Isso foi conseguido gerando correntes intensas baixas a partir de um gerador de corrente direta, e enviando-o diretamente para o animal através de eletrodos. O TDCS tem sido investigado como uma alternativa terapêutica não medicamentosa para os principais transtornos psiquiátricos em humanos, como depressão, esquizofrenia, doença de Alzheimer, AHDH e autismo.Além disso, o TDCS é uma técnica única devido ao seu baixo custo, facilidade de uso e perfil não invasivo. No entanto, os efeitos biológicos da TDCS não são inteiramente compreendidos, e não há consenso quanto aos parâmetros de estimulação, como intensidade atual, duração e telha das áreas cerebrais. Dessa forma, o uso de ordens mínimas é essencial para um estudo minucioso desses mecanismos, o que levará a uma melhor compreensão da eficácia clínica do TDCS através da aquisição e análise de dados comportamentais celulares e moleculares.Atualmente existem duas configurações de eletrodos para tDCS, chamadas de estimulação anodal e catódal. Na estimulação anodal, as correntes são entregues diretamente na cabeça do animal, através do corpo do animal, e no cátodo posicionado no tórax do animal. Enquanto na estimulação catódal a corrente entra através do tórax do animal, viaja até sua cabeça e para o cátodo.Em ambas as situações, um gerador de corrente controla a intensidade atual e a duração da estimulação. Ao produzir uma qualidade de contato e inferir feedback. Existem muitas configurações diferentes para posicionamento ativo.Com isso, todo o eixo tridimensional deve ser levado em consideração. Neste protocolo, um eletrodo de cabeça foi implantado um milímetro em bregma enraizado, na linha lateral para o meio do crânio, e o eletrodo corporal foi posicionado no peito do animal. Devido a uma simulação de curto período, foi recomendado o uso de uma ação rápida e anestesia de curto prazo, como isoflurane vaporizado.Este procedimento é composto por duas etapas críticas. Colocação de eletrodos e estimulação de corrente direta transcraniana. Os instrumentos cirúrgicos foram esterilizados com pré-manutenção a 440 graus Celsius.Cotonetes de algodão foram autoclaved a 20 libras por polegada quadrada a 121 graus Celsius por 20 minutos. Gire o controlador da plataforma térmica para 37 graus Celsius. Pese o animal e calcule a dose apropriada para indução de anestesia.Use uma mistura de cetamina e xilazina a uma dose de 100 miligramas por quilograma de cetamina, e 8 miligramas por quilograma de xilazina. Tamanho da agulha 31G. O animal deve dormir dentro de 2 a 3 minutos.Use um barbeador elétrico ou uma navalha para raspar o local cirúrgico. Coloque o animal sobre o aparelho estereotaxo sobre a placa de aquecimento pré-aquecida. Segure a cabeça do animal e insira as barras de ouvido de ponta em cada uma das orelhas do animal, para fixá-la na plataforma sterotaxic.Verifique se não há mudança lateral da cabeça, e pouco movimento vertical, deslocando lentamente a cabeça do animal. Deslize suavemente a máscara de anestesia sobre o nariz do mouse e fixe no lugar apertando o parafuso. Aplique pomada nos olhos do animal para evitar a secagem da córnea durante a cirurgia.Use um cotonete para preparar o local cirúrgico com três esfoliantes alternados de iodo povidone, ou 2% de clorohexidina e 70% de ethinol. Use um par de pinças para verificar a anestesia adotada apertando levemente os dedos dos dedos dos dedos do animal, e verificando as leis do reflexo geral de pedrelação de pedo animal. Faça uma incisão cerca de três milímetros posterior à linha de ouvido do animal, e pare na linha dos olhos.O local da incisão deve ter aproximadamente um centímetro de comprimento para ser grande o suficiente para receber o implante. Raspe suavemente o crânio com um raspador ósseo para melhorar a aderência da cola e do cimento. Isso deve ser feito com a intenção de criar micro-arranhões.Posicione cuidadosamente os ganchos cirúrgicos na pele solta para manter um campo cirúrgico aberto e libertá-lo de obstruções, como a pele de uma pele. Use um cotonete estéril para secar suavemente o couro cabeludo do animal. Use um microscópio de dissecção para visualizar a parte superior do crânio do animal.Coloque uma agulha no suporte sterotaxic e localize o bregma. Posicione a agulha diretamente acima da cabeça do animal está tocando levemente o bregma. Use o bregma como referência para ajustar as coordenadas da área de interesse.Fixar o implante no suporte estereotaxista. Posicione o implante sobre a cabeça do animal e abaixe-o lentamente sobre a região de interesse. Use uma agulha para espalhar uma gota, aproximadamente 35 microliters, de supercola no espaço do implante.Mova lentamente o suporte para baixo até tocar o crânio. Certifique-se de que o espaço do implante está totalmente em contato com a superfície. Prepare o cimento cirúrgico de acordo com as instruções do fabricante.Após um posicionamento preciso, aplique três camadas finas e uniformes de cimento através do crânio, e na porção inferior do implante. Aplique gota por gota usando uma escova de aplicação. As camadas devem formar estrutura em forma de U para maior suporte estrutural do implante.Deixe o fio do parafuso do implante limpo de cimento para permitir uma conexão lisa e desobstruída. Deixe cada camada secar por aproximadamente quatro minutos. Após a secagem, retire cuidadosamente o suporte até que esteja completamente desconectado do implante.Tenha sempre extrema cautela ao manusear o implante, pois pode ser acidentalmente destruído do crânio do animal. Hidrate a pele do animal e o local da incisão com um cotonete encharcado de soro fisiológico. Corte a pele sobre a base do implante.Use um par de pinças para unir o tecido, e feche a incisão com uma gota de cola cirúrgica de tecido por ponto de 2 centímetros de tecido. Infiltrar-se de 1 a 2% de lidocaína no local da incisão e nos tecidos subjacentes. Hidrate o animal com 500 microliters de lactato ringer simultaneamente.Coloque o mouse em uma gaiola de casa limpa de 37 graus Celsius pré-aquecida. Construa um pequeno prato de pelotas de comida molhada na gaiola, para fácil acesso à comida nas horas seguintes. Registre o peso pós-cirúrgico do animal.O animal deve ser administrado com cetoprofeno. 5 miligramas por quilograma simultaneamente após a cirurgia e nos próximos dois dias. Certifique-se de que o estimulador tDCS está totalmente carregado.Conecte os cabos de ânodo e cátodo ao estimulador tDCS e disponibilize-os perto do local da simulação. Conecte o eletrodo tipo pino ao suporte sterotaxic. Coloque a plataforma térmica em 37 graus Celsius.Ligue o medidor de oxigênio no sistema de anestesia de inalação para 1 litro por minuto. Coloque o rato na câmara de indução da anestesia. Ligue o vaporizador isoflurane a 3% Permitir que o animal soure efeitos isoflurane por quatro minutos.Enquanto o animal estiver na câmara de indução, use uma seringa estéril para encher o eletrodo corporal com solução salina de 0,9%. Retire o animal da câmara de indução e posicione seu peito sobre o eletrodo corporal. Deslize suavemente a máscara de anestesia sobre o nariz do mouse e fixe no lugar.Abaixe a saída isoflurane para 1,5% Encha o implante e o eletrodo tipo pino com soro fisiológico. Anexá-los cuidadosamente. Ajuste o tempo de estimulação e a intensidade atual de acordo com o protocolo.Verifique a qualidade de contato no sistema tDCS mais tarde. Comece a estimulação. Observe a corrente subindo por 20 segundos para o valor selecionado.E mantendo-se firme para o tempo estabelecido. Então, no final da seção subindo novamente. Ative o botão canela para controlar.Observe a corrente subindo por 20 segundos para o valor selecionado. E depois para baixo um para o resto do período de estimulação, com uma rampa final para o valor selecionado, no final, com uma rampa consecutiva para baixo. Uma das seções de estimulação está completa, transfira cuidadosamente o animal para uma gaiola pré-aquecida de 37 graus Celsius por 10 minutos.Este protocolo usa tDCS para estimular o córtex cerebral do mouse um milímetro antes do bregma. Este gráfico mostra a expressão estatisticamenteizada e genética após o protocolo de estimulação do TDCS. Usando uma intensidade de corrente de 0,35 miliamperes durante 10 minutos por dia.O implante tCDS apresentou auto-viável do primeiro ao quinto dia sem diferença significativa entre os dias em qualidade de contato. Há uma variedade de protocolos de estimulação de TCDS em cérebros modelo. Os protocolos devem ser escolhidos de acordo com as particularidades do seu experimento.Área de estimulação, intensidade atual, duração da sessão e posicionamento de eletrodos. Neste protocolo em particular, visamos modular o córtex motor através do nosso tDCS conhecido com a corrente de 350 microamperes por 10 minutos. Depois de assistir a este vídeo, você poderá executar tDCS em ratos.Quando alguém pratica cirurgia pode levar até quatro minutos por animal. É essencial levar em consideração as orientações de cuidado animal ao utilizar os camundongos durante a operação e acompanhar os cuidados pós-cirúrgicos aos animais para que os animais permaneçam saudáveis durante o estudo. Também recomendamos esperar de cinco a sete dias após a colocação do implante para realizar os experimentos, uma vez que a resposta fisiológica do animal ao trauma pode interferir nos desfechos biológicos.

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JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

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