Técnicas de Análise de vesículas extracelulares utilizando citometria de fluxo

O objetivo geral deste procedimento é isolar e analisar a circulação de vesículas extracelulares no sangue por dois métodos diferentes. Para o método de detecção de vesículas extracelulares individuais. O plasma pobre em plaquetas ou PPP é primeiro isolado de uma amostra de sangue.

O PPP é então corado com os anticorpos conjugados com fluorocromo de interesse. Para o método de detecção baseado em esferas, as vesículas extracelulares são incubadas com esferas e, em seguida, as vesículas ligadas a esferas são coradas com os anticorpos conjugados com fluorocromo relevantes. Em última análise, o conteúdo de vesículas extracelulares circulantes pode ser determinado pela análise das amostras por citometria de fluxo.

A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como microscopia eletrônica ou separação de esferas magnéticas, é que ela é muito mais rápida e permite a avaliação da população total de escalonamento extracelular, em vez de ser limitada a subpopulações específicas. Geralmente, os indivíduos novos neste método terão dificuldades, pois o sucesso deste método requer uma adesão estrita às manobras demonstradas e aos parâmetros de configuração do citômetro Para produzir dados de alta qualidade com variação mínima do dia-a-dia, comece centrifugando amostras de sangue total para separar o plasma do revestimento de Buffy e dos glóbulos vermelhos. Em seguida, transfira alíquotas de 1,2 mililitro do sobrenadante de plasma para tubos de centrífuga de 1,5 mililitro, tomando cuidado para não perturbar as camadas inferiores contendo o revestimento leucocitário e os glóbulos vermelhos e, em seguida, centrifugue o sobrenadante novamente para remover quaisquer plaquetas e fragmentos de células grandes.

No final da centrifugação, transfira cuidadosamente todos, exceto os últimos 200 microlitros das amostras de PPP para novos tubos, tomando cuidado para não perturbar os pellets. Em seguida, misture o plasma para cima e para baixo várias vezes e transfira 320 microlitros de cada amostra para a linha superior de uma placa de 96 poços. Para corar as amostras, combine os anticorpos de interesse para cada um dos três painéis em tubos de filtro centrífugo individuais de 22 micrômetros e gire os anticorpos usando uma centrífuga de ângulo fixo de velocidade única.

Quando todo o anticorpo tiver passado pelo filtro, adicione a quantidade apropriada da mistura a cada poço da placa de 96 poços, conforme ilustrado na figura. Em seguida, use uma pipeta multicanal para misturar as amostras de PPP e, em seguida, transfira 100 microlitros de cada amostra para os anticorpos na linha dois. Em seguida, misture as amostras novamente, troque as pontas e transfira 100 microlitros de amostra para cada uma das próximas duas fileiras de anticorpos, conforme apropriado.

Para o experimento. Incube a placa a quatro graus Celsius após 30 minutos a 220 microlitros de PBS por poço para refilar de seis a oito dentro de um gabinete de segurança biológica. Em seguida, usando uma pipeta multicanal ajustável em largura, transfira o conteúdo de cada poço para o tubo de filtro centrífugo correspondente sem alterar as pontas.

Use 200 microlitros de PBS de uma das linhas de lavagem para enxaguar os poços dos quais as amostras acabaram de ser removidas. Em seguida, transfira a solução de enxágue para os mesmos filtros aos quais as amostras de PPP foram adicionadas anteriormente e feche os filtros centrífugos. Uma vez que todas as amostras de PPP manchadas tenham sido transferidas junto com suas soluções de enxágue, gire as amostras em uma centrífuga de rotor fixo.

Após a centrifugação, certifique-se de que nenhum líquido permaneça em cima dos filtros. Em seguida, ressuspenda os topos dos filtros em 300 microlitros de PBS e transfira o conteúdo ressuspenso para tubos pré-rotulados para análise de citometria de fluxo imediata. A lavagem das amostras coradas com filtros centrífugos melhora a separação entre o fundo e os sinais de marcadores positivos.

É importante notar, no entanto, que algumas das vesículas extracelulares menores, incluindo exossomos, podem ser perdidas pelas portas do filtro Para analisar as amostras, primeiro defina os parâmetros de tensão de dispersão direta e lateral para uma escala logarítmica e selecione os limites mais baixos permitidos pelo citômetro para cada parâmetro. Em seguida, enquanto executa um tubo de 22 micrômetros de ponto zero, o PBS filtrado ajusta essas tensões para os valores mais altos que excluem a maioria do ruído de fundo. Em seguida, execute um tubo contendo uma mistura de contas, um micrômetro e menor, e desenhe uma porta ao redor da população de contas em um gráfico de dispersão lateral para capturar todos os eventos sob as contas de um micrômetro.

Agora defina a taxa de fluxo dos citômetros para baixa e use as contas para ajustar o mostrador da taxa de fluxo no citômetro para a taxa de evento desejada. Em seguida, usando um tubo de partículas fluorescentes de arco-íris diluídas em PBS, adquira 5.000 eventos, registrando a intensidade média dos valores para a dispersão lateral direta e cada canal de cor. Quando todos os parâmetros estiverem definidos, execute cada amostra por exatamente um ou dois minutos Após a conclusão da primeira leitura de cada tubo, misture 20 microlitros de 10% MP 40 em cada amostra e releia os tubos pelo mesmo período de tempo para permitir a subtração dos eventos positivos detectados na amostra lisada por um período igual de tempo.

Para detectar as vesículas extracelulares por captura baseada em esferas, comece lavando esferas de poliestireno de seis micrômetros não revestidas duas vezes com meio RPMI, seguido de Resus em dois mililitros do mesmo. Em seguida, adicione 6.000 contas a cada novo tubo de fax ao tubo de controle negativo a 400 microlitros de mídia a todos os outros tubos a 200 microlitros de PPP ou vesículas extracelulares de ultracentrífuga, conforme apropriado, e 200 microlitros de mídia. Ajuste o volume final em cada tubo para 400 microlitros.

Com mais mídia. Incube os tubos durante a noite a quatro graus Celsius em um agitador. Na manhã seguinte, lave as contas com dois mililitros de mídia.

Aspire o sobrenadante e bloqueie qualquer ligação não específica com 400 microlitros de albumina de soro bovino a 5% em um shaker a quatro graus Celsius por três horas. Após três horas, lave as esferas em mais dois mililitros de meio e ressuspenda os pellets em 100 microlitros de meio fresco. Agora filtre os anticorpos e adicione o volume apropriado de coquetel de anticorpos filtrados a cada tubo e, após 30 minutos a quatro graus Celsius, lave as esferas em mais dois mililitros de meio.

Desta vez, ressuspenda os pellets em 400 microlitros de meio e analise imediatamente as amostras por citometria de fluxo, ajustando os parâmetros de dispersão interna direta para o limite mais baixo permitido pelo citômetro de fluxo, conforme demonstrado. Finalmente, gate a população de contas singlete e adquira 2000 eventos por amostra. Os métodos de detecção individuais e baseados em esferas podem ser usados para detectar a presença de vesículas extracelulares nas amostras PPP, conforme ilustrado por estes gráficos de pontos Para o ensaio de detecção individual, o controle lisado é usado para definir as portas para a amostra não listada correspondente.

A maioria dos eventos deve ocorrer dentro da porta da vesícula extracelular. Por exemplo, nesta figura, esses gráficos de biparâmetros mostraram a detecção dos marcadores, CD 1 0 8 A e CD 2 35 A, que são dois marcadores de glóbulos vermelhos conhecidos por coexistirem nas células. Como esperado, mais da metade dos eventos positivos nas vesículas extracelulares são positivos para ambos os marcadores, enquanto nestes por gráficos de parâmetros, a expressão de vesículas extracelulares de dois marcadores que são conhecidos por não coexistirem nas células exibem populações positivas separadas distintas usando o método de detecção baseado em contas.

Não existe separação entre as populações positivas e negativas e os eventos aparecem nos quadrantes duplos positivos, embora normalmente não sejam encontrados nos mesmos tipos de células devido ao fato de que ambos os tipos de vesículas extracelulares se ligam a uma única conta. Portanto, os dados deste método são melhor analisados usando histogramas sobrepostos aos dados de controle negativo, com uma aparente mudança na expressão do marcador observada nas amostras frisadas em comparação com os controles, uma vez dominados. Esta técnica pode ser usada para analisar 12 amostras de sangue com três painéis de anticorpos em três a quatro horas com o método de detecção individual ou em um dia e meio pelo método de esferas, se for realizado corretamente.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de ser consistente no tratamento de cada amostra, garantir que a taxa de fluxo do citômetro e as intensidades fluorescentes tenham sido ajustadas corretamente no início de cada experimento para corresponder às configurações experimentais do dia anterior, especialmente ao executar várias amostras em vários dias.