Name: Técnicas de Análise de vesículas extracelulares utilizando citometria de fluxo (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: Aprenda a isolar e analisar vesículas extracelulares no sangue usando citometria de fluxo. Este método compara detecção individual e baseada em micropartículas para análise precisa de EVs circulantes.

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Os autores gostariam de agradecer a Dale Hirschkorn partir Systems Research Institute de sangue por sua ajuda com citômetro de fluxo configurações do instrumento. Este trabalho foi financiado pelo NIH concede HL095470 e U01 HL072268 e contratos DoD W81XWH-10-1-0023 e W81XWH-2-0028.

NOTA: Os seguintes protocolos foram realizados em conformidade com todas as diretrizes institucionais, nacionais e internacionais para o bem-estar humano. Todas as amostras de sujeitos humanos foram testados no âmbito de um Conselho de Revisão Institucional (IRB) protocolo -aprovado e com o consentimento informado dos sujeitos. 1. MÉTODO A: Método de Detecção Pessoa 1.1) Processamento de Amostra de Sangue / Isolamento de EVs <ol><li> Extrair o sangue do dador / paciente em duas 10 ml de tubos de vidro contendo 1,5 mL de solução ACD-A ou outro anticoagulante adequado e processo imediatamente (dentro de 30 min-max), utilizando o protocolo de centrifugação diferencial 2-passo seguinte. NOTA: Este protocolo irá produzir aproximadamente 10 ml de plasma pobre em plaquetas (PPP) a partir dos combinadas ~ 17 ml de sangue extraído. Se mais ou menos PPP é necessário, o número de tubos de sangue recolhida pode ser ajustada em conformidade. </li><li> Centrifugar as amostras a 1500 xg durante 10 min a RTpara separar o plasma de buffy coat e glóbulos vermelhos. Transferir alíquotas de 1,2 ml do sobrenadante do plasma para tubos de 1,5 ml de centrífuga, tendo o cuidado de não perturbar as camadas do fundo contendo o buffy coat e glóbulos vermelhos. </li><li> Girar a 13.000 xg durante 10 min à temperatura ambiente para remover plaquetas e fragmentos celulares grandes. Transferir cuidadosamente o PPP, deixando para trás 200 mL para evitar perturbar o sedimento e adicionar o PPP para um novo tubo. </li><li> Neste ponto, usar PPP imediatamente para análise ou transferência em alíquotas de 1,0 ml a 1,5 ml novos tubos de centrífuga e armazenar a -80 ° C por até dois anos, para posterior análise (consulte a Figura 1A para visão geral). </li><li> Se forem necessários VE purificados por experiências de transferência funcionais, 6 ml de PPP para um tubo de ultracentrífuga e adicionar 28 ml de salina tamponada com fosfato 0,2 micrometros de filtrado (PBS). Centrifugação durante 60 min a 100000 xg, à temperatura ambiente, usando uma ultracentrífuga equipado com um rotor de balde oscilante. Aspirar sobrenadante e ressuspender EV peldeixe em 1,5 ml de mídia. NOTA: Para obter mais alta reprodutibilidade, amostras de sangue devem ser tratados de forma tão consistente quanto possível, do doador ao doador. Qualquer variação no método de isolamento de EV poderia impactar significativamente o número e tipo de EVs detectadas. </li></ol> 1.2) A preparação de amostras para análise NOTA: A partir deste ponto, os passos explicar um protocolo de alto rendimento para a análise de 12 amostras por 14 marcadores em 3 painéis. No entanto, outras combinações de anticorpos podem ser usados ​​aqui; o protocolo pode ser adaptado para estudar outras populações EV substituindo os marcadores sugeridas por aqueles de interesse. <ol><li> Retirar amostras de 12 congelador (se armazenados a -80 ° C) e descongelação a 37 ° C. </li><li> Conteúdo da pipeta para cima e para baixo várias vezes para misturar. Remover 320 mL de cada amostra e adicionar ao topo da linha de uma placa de 96 poços. NOTA: A largura ajustável multi-bem pipeta é extremamente útil para este e muitos outros passos em todo o burroay, particularmente quando se analisam amostras múltiplas de uma só vez. </li></ol> 1,3) As amostras de coloração EV <ol><li> Antes da coloração, filtrar todos os anticorpos (Abs) para remover os agregados, o que pode causar sinais positivos. <ol><li> Anticorpos combinam para ser utilizado em cada um dos três painéis separados em tubos de filtro de 0,22 um e centrifugar centrífugos usando um ângulo fixo única centrífuga de velocidade (~ 750 x g) à temperatura ambiente durante 2 minutos, ou até que toda a mistura Ab tenha passado através do filtro e o líquido não anticorpo permanece na superfície do filtro. Loja Ab cocktails na geladeira por até duas semanas, mas re-filtro antes de cada utilização. </li></ol></li><li> Adicionar a quantidade apropriada de mistura Ab filtrou-se para cada poço na fila 2 (por exemplo, no painel de amostras I são coradas com 2 ul de cada Ac, então um total de 12 ul de Ab cocktail filtrado é adicionado por poço com a linha 2). Consultar a Figura 1B para um esboço da placa mapa sugerido. Repita estes dissos para as linhas abaixo se mais painéis são executados (aqui, adicionar 8? l / poço do cocktail Painel de acordo com a linha II 3 e 11 ^ l / poço do cocktail Painel de acordo com a linha III 4 referem-se a Lista de Materiais para a informação de painel específico). </li><li> Usando a pipeta multicanal, misturar as amostras de PPP na linha 1 para cima e para baixo e transferir 100 ul dos poços na linha 1 para os poços em linha 2. Mix cima e para baixo. Alterar dicas e repetição, transferindo 100 l da linha 1 para as linhas 3 e 4. Incubar a 4 ° C por 30 min. </li></ol> 1.4) As amostras de lavagem de MT <ol><li> Remova a placa de 96 poços a partir de 4 ° C e a transferência câmara de segurança biológica. Usando uma pipeta de canais múltiplos, adicionar 220 ul de PBS / poço para linhas 6-8 (para ser utilizado na limpeza / lavagem dos poços contendo manchado PPP). </li><li> Transferir o conteúdo de cada cavidade para tubos centrífugos de filtro pré-marcado, utilizando a pipeta multicanal largura-ajustável (Para 12 amostras, com três painéis de anticorpos, 12 x 3 = 36 tubos de filtroser necessária). Usando as mesmas pontas, remover 200 ul de PBS a partir das linhas de lavagem e adiciona-se aos poços correspondentes a partir do qual apenas PPP foi removido. </li><li> Misturar cima e para baixo para lavar os poços e transferir a solução de enxaguamento para os mesmos filtros para que o PPP foi adicionada previamente. Fechar topos de filtros centrífugas. Alterar dicas. </li><li> Repita este processo com as amostras manchadas restantes até que todas as amostras de PPP manchadas foram transferidos junto com suas soluções de lavagem de filtros centrífugos. </li><li> Transferir os filtros centrífugos para uma centrifugadora de rotor fixo e centrifugação a 850 xg durante 3 minutos à temperatura ambiente. NOTA: Certifique-se de que nenhum líquido permanece nos topos de filtro. Após centrifugação, o filtro deve parecer &quot;seca&quot; sem camada de fluido restante visível na parte superior. Embora seja improvável, determinadas amostras de PPP pode exigir um longo tempo de centrifugação para se mover de forma eficaz através do filtro. </li><li> Retire os tubos de filtro centrífugo e retornar à câmara de segurança biológica.Utilizando a pipeta multicanal, ressuspender as partes superiores dos filtros em 300 ul de PBS. Transferir o conteúdo em suspensão para tubos pré-marcado para análise FCM imediato. NOTA: É muito importante manter a força e número de depressões pipeta êmbolo consistentes entre as amostras para evitar variação de amostra para amostra. Isto deve idealmente ser feito usando uma pipeta eletrônica que foi programado para pipeta cima e para baixo um volume específico (por exemplo, 280 ul) um número exato de vezes (por exemplo, oito vezes) para cada amostra. </li></ol> 1.5) Setup Cytometer <ol><li> Abra o software FCM. Antes de experimentar a instalação, execute a calibração do aparelho diariamente e configuração usando esferas de Instalação instrumento (seguindo as instruções do fabricante). </li><li> Se as amostras EV foram coradas com mais do que um anticorpo e vários fluorocromos que devem ser medidos ao mesmo tempo, calcular valores de compensação, como segue: <ol><li> Adicione 2 gotas de esferas de compensação para prétubos (marcado com um tubo para cada anticorpo conjugado com fluorocromo) e adicionar a quantidade recomendada de anticorpos. Adicione 2 gotas de esferas de compensação negativas para outro tubo para usar como o controlo de compensação unstained. </li><li> Incubar a 4 ° C durante 30 minutos, lava-se com PBS e ressuspender em 400 ul de PBS. </li><li> Usando o citômetro de fluxo software incluído com o instrumento, execute cada tubo de compensação e ajustar tensões fluorescentes para colocar cada pico em aproximadamente 10 4 em uma escala log 5 décadas. Certifique-se que o pico de fluorescência é maior (mais brilhante) em seu próprio canal fluorescente em comparação com todos os outros canais, e ajustar as tensões dos parâmetros fluorescentes novamente se necessário. Execute cada tubo comp-coradas individualmente e capturar pelo menos 5.000 eventos por tubo. </li><li> Selecione a opção &quot;Experiment&quot;, guia, em seguida, selecione &quot;Compensação&quot;, em seguida, selecione &quot;o cálculo das compensações&quot; para aplicar os valores de remuneração para todas as amostras. </li></ol></li><li&gt; Definir a dispersão para a frente (FSC) e dispersão lateral (SSC) parâmetros de tensão a escala logarítmica e escolha os limites inferiores permitidas pelo citômetro (FSC = 200 e SSC = 200) para cada um. </li><li> Durante a execução de um tubo de 0,22 filtrada PBS, ajustar as voltagens do FSC e SSC para os maiores valores que excluem a maioria dos ruídos de fundo (ou seja, um pouco abaixo do limiar de tensão em que a taxa de eventos ultrapassa 5 eventos / seg). </li><li> Em seguida, executado um tubo contendo 0,2 mm - 1,0 mm os grânulos, diluídas em PBS, se necessário. Em uma trama FCS vs. SSC, desenhe um portão em torno da população de esferas para capturar eventos entre 0,2 m e 1,0 m. Em alternativa, em um histograma SSC-H, desenhe um portão para incluir todos os eventos menores do que os 1,0 mm esferas. </li><li> Ajustar a taxa de fluxo do citômetro de &quot;Lo&quot; (cerca de 8-12 l / min). Usando o tubo de esferas (ou outro tubo contendo uma concentração conhecida de contas) ajustar a taxa de fluxo de marcação no citómetro até a vésperant taxa atinge cerca de 200 eventos / seg. Ler todos os tubos de amostra com a mesma taxa de fluxo e utilizar a mesma concentração do grânulo em experiências futuras para assegurar que as taxas de fluxo permanecem consistentes entre corridas. </li><li> Executar um tubo de partículas fluorescentes do arco-íris, diluídos em PBS. Adquirir 5.000 eventos. Registre os valores da intensidade média do FSC, SSC, e cada canal de cor. Use esses valores para ajustar tensões em experimentos futuros para garantir que a intensidade de fluorescência de manter a coerência entre os experimentos. </li></ol> 1.6) A leitura das amostras <ol><li> Ajustar a taxa de fluxo do citômetro de &quot;Lo&quot; (cerca de 8-12 l / min) e executar cada amostra para exatamente 1 ou 2 min. </li><li> Após a primeira leitura, adicionar 20 ul de 10% de NP-40 a cada amostra, pipeta cima e para baixo, e voltar a ler para o mesmo período de tempo (1 ou 2 minutos) para permitir a subtracção de eventos positivos detectados em a amostra lise sobre um período de tempo igual. NOTA: É extremamente important que as amostras sejam misturadas utilizando uma pipeta, em vez de um vórtex. Em nossa experiência, vórtex pode causar auto-agregação de alguns anticorpos, levando a eventos positivos que imitam EV. </li><li> Uma vez que todas as amostras foram lidos, exportação de todos os arquivos .fcs em um arquivo separado para ser usado para análise utilizando o software de análise FCM. </li></ol> 1.7) Análise de Dados <ol><li> Abra o software de análise FCM. Importe todos os arquivos .fcs em um novo arquivo experimento. </li><li> Abra o beads-somente tubo. No FSC-A vs. SSC-A trama, desenhar uma porta em torno todos os tamanhos esferas entre 0,2 mm e 1,0 mm. Esta é a porta EV. Arraste para adicionar a todas as amostras. </li><li> Utilizando as amostras lisadas como controlos negativos, desenhar portas na extremidade de fundo de fluorescência em cada canal de fluorescência utilizado. Arraste portões fluorescentes no portão EV de cada amostra não-lisadas correspondente. NOTA: Neste ponto, ele também é útil para examinar duas parcelas bi-parâmetro fluorescentes. Formas de foguetes emo quadrante duplo positivo (ver Figura 8), particularmente se os marcadores são conhecidos a residir em tipos de células não relacionadas, podem ser indicativos de artefacto de agregação ou outros eventos que mimetizam a vesícula. </li><li> Para cada marcador fluorescente, subtrai-se o número de eventos na amostra lisadas a partir do número de eventos na amostra não-lisadas. Opcionalmente, dividir esse número pelo número total de EVs dentro do portão não-lise EV obter% valores positivos. </li></ol> 2. Método B: Método Beads 2.1) Processamento de Amostra de Sangue / Isolamento de EVs <ol><li> Consulte o método de processamento de sangue descrito no Método A (Seção 1.1). </li></ol> 2.2) A preparação de amostras para análise <ol><li> Se desejar, fracionar PPP ou EVs ultracentrifugado em exossomos e microvesículas. Adicionar 250 mL de PPP ou EVs ultracentrifugado para 0,22 filtros centrífugos e transferir para uma centrífuga de rotor fixo e rotação a 750 xg durante 2 min à temperatura ambiente. NOTA: Certifique-se de que nenhum líquido permanece nos topos de filtro. Após centrifugação, o filtro deve parecer &quot;seca&quot; sem camada de fluido restante visível na parte superior. Embora seja improvável, certas amostras podem requerer um tempo ligeiramente mais longo por centrifugação o fluido a mover-se de forma eficaz através do filtro. </li><li> Lave não revestidos 6 mm esferas de poliestireno (por exemplo, contas negativas ABC) 2x com meio RPMI e ressuspender em 2 ml. Adicionar 6000 grânulos para cada tubo de FACS. Para o tubo de controlo negativo, adicionar 400 ul de meio RPMI sozinho para os grânulos. Para todos os outros tubos, adicionar 200 mL de PPP ou EVs ultracentrifugado (ou suas fracções) e 200 mL de meio RPMI. </li><li> Ajustar o volume final de todos os tubos para 400 ul com meio e incubar durante a noite a 4 ° C num agitador. </li><li> Na manhã seguinte, lavar os grânulos com 2 ml de meio. Aspirar o sobrenadante. </li><li> Bloco com 5% de albumina sérica bovina (BSA) em meios (400 mL) durante 3 horas a 4 &amp;# 176; C em um shaker. </li><li> Lavar as pérolas com 2 ml de meio. Aspirar e ressuspender o sedimento em 100 ul de meio. </li></ol> 2.3) As amostras de coloração EV <ol><li> Filtro de todos os anticorpos. Usar os mesmos painéis de anticorpos utilizados no Método A, ou se desejado, criar uma combinação diferente de anticorpos, desde que as suas fluorocromos são compatíveis um com o outro. </li><li> Combine todos os anticorpos a ser utilizados num único painel para um tubo de centrífuga de filtro de 0,22 um. Centrifugar usando um ângulo fixo de centrífuga de velocidade única durante 2 minutos ou até toda a mistura Ab tenha passado através do filtro e nenhum líquido anticorpo permanece na superfície do filtro. </li><li> Adicionar o volume apropriado da mistura de anticorpos filtrada para todos os tubos e incubar durante 30 min a 4 ° C. </li><li> Lavar as pérolas com 2 ml de meio, ressuspender em 400 ul de meio e executar imediatamente (ou no mesmo dia) no citómetro de fluxo. </li></ol> 2.4) Cytometer Setup e Sample Reading<ol><li> Abra o software FCM. Antes de experimentar a instalação, execute a calibração do aparelho diariamente e configuração usando esferas de Instalação instrumento (seguindo as instruções do fabricante). </li><li> Se as amostras EV foram coradas com mais do que um anticorpo e vários fluorocromos que devem ser medidos ao mesmo tempo, calcular valores de compensação, como segue: <ol><li> Adicione 2 gotas de esferas de compensação para tubos pré-marcados (1 tubo para cada anticorpo conjugado com fluorocromo) e adicionar a quantidade recomendada de anticorpos. Adicione 2 gotas de esferas de compensação negativas para outro tubo para usar como o controlo de compensação unstained. Incubar a 4 ° C durante 30 minutos, lava-se com PBS e ressuspender em 400 ul de PBS. </li><li> Usando o software FCM, execute cada tubo de compensação e ajustar tensões fluorescentes para colocar cada pico em aproximadamente 10 4 em uma escala log 5 décadas. Certifique-se que o pico de fluorescência é maior (mais brilhante) em seu próprio canal fluorescente em comparação com todos os outros canais, eajustar os parâmetros de tensões fluorescentes novamente, se necessário. Execute cada tubo comp-coradas individualmente e capturar pelo menos 5.000 eventos por tubo. </li><li> Selecione a aba &quot;Experiment&quot;, depois &quot;Compensação&quot;, então &quot;o cálculo das compensações&quot; para aplicar os valores de remuneração para todas as amostras. </li></ol></li><li> Alterar o FSC e SSC parâmetros de tensão a escala logarítmica e escolha os limites inferiores permitidas pelo citômetro (FSC = 200 e SSC = 200) para cada. </li><li> Amostras de correr, portão sobre a população pérolas singlet e adquirir 2.000 eventos neste portão. Exportar arquivos .fcs. </li><li> Use um software de análise FCM para analisar .fcs arquivos. Portão em esferas singletos. Calcular a intensidade fluorescente média geométrica (IMF) para cada fluorocromo e comparar com o MFI do controlo negativo. </li></ol>

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<li>Nolte-’t Hoen, E. N. M., van der Vlist, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+and+qualitative+flow+cytometric+analysis+of+nanosized+cell-derived+membrane+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine%3A+Nanotechnology%2C+Biology%2C+And+Medicine%22%5BJournal%5D)">Quantitative and qualitative flow cytometric analysis of nanosized cell-derived membrane vesicles.</a> Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, And Medicine. 8 (5), 712-720 (2012).</li>
<li>Van der Vlist, E. J., Nolte-’t Hoen, E. N. M., Stoorvogel, W., Arkesteijn, G. J. A., Wauben, M. H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+labeling+of+nano-sized+vesicles+released+by+cells+and+subsequent+quantitative+and+qualitative+analysis+by+high-resolution+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Fluorescent labeling of nano-sized vesicles released by cells and subsequent quantitative and qualitative analysis by high-resolution flow cytometry.</a> Nature Protocols. 7 (7), 1311-1326 (2012).</li>
<li>Orozco, A. F., Lewis, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+analysis+of+circulating+microparticles+in+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A.+77+A%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric analysis of circulating microparticles in plasma.</a> Cytometry Part A. 77 A. 77A (6), 502-514 (2010).</li>
</ol>

Os autores não têm qualquer conflito de interesse de divulgar.

Dois diferentes protocolos para o isolamento, tratamento e análise de VE foram apresentados, utilizando quer uma individual de detecção ou de aproximação baseadas em esferas. Selecionando o método mais adequado para usar nem sempre é fácil e requer uma compreensão da amostra a ser testada, bem como as subpopulações de interesse individuais. Além disso, a sensibilidade do citómetro usado para a aquisição deve ser considerado quando se escolhe o método mais adequado. Muitas vezes não há melhor protocolo único de usar, em ...

Vesículas extracelular (VE) são pequenas, vesículas derivadas de membrana encontrados nos fluidos corporais que são altamente envolvido na comunicação célula-célula e ajudam a regular uma variada gama de processos biológicos. Análise de EVs usando citometria de fluxo (FCM) tem sido notoriamente difícil devido ao seu pequeno tamanho e falta de populações discretas positivas para os marcadores de interesse. Métodos de análise EV, enquanto melhorou consideravelmente na última década, ainda são um trabalho em andamento. Infelizmente, não há one-size-fits-all protocolo, e vários aspectos devem ser considerados para determinar o método mais adequado para usar. Apresentado aqui estão várias técnicas diferentes para o processamento de EVs e dois protocolos para a análise de EVs usando detecção individual ou uma abordagem baseada no talão. Os métodos descritos aqui vai ajudar com eliminando os agregados de anticorpos normalmente encontrados em preparações comerciais, aumentando a relação sinal-ruído, e portões configuração em um f racionalashion que minimiza a detecção de fluorescência de fundo. O primeiro protocolo utiliza um método individual de detecção que é especialmente adequado para a análise de um grande volume de amostras clínicas, enquanto que o segundo protocolo utiliza uma abordagem baseada no grânulo para capturar e detectar os VE e exossomas menores. VE, também conhecidos como micropartículas, são pequenas, vesículas derivadas de membrana encontrados nos fluidos corporais que estão envolvidos na comunicação célula-célula e ajudam a regular uma variada gama de processos biológicos 1. Através da expressão de vários marcadores de superfície e / ou a transferência directa de material biológico, VE é capaz de alterar a função das células receptoras para jogar ou activação ou supressão de funções na comunicação intercelular 2-4. VE, derivados de plaquetas Clinicamente são conhecidas por terem forte actividade anticoagulante 5, enquanto outros têm sido mostrados para contribuir para uma vasta gama de condições, de promoção do tumor metastasis 6 a proteger contra a doença 7. EVs podem ser classificados em categorias menores de vesículas derivadas de células, tais como exossomos e microvesículas (MVs), dependendo do seu tamanho e do mecanismo da geração 8. A nomenclatura de subpopulações de vesículas derivadas de células continua a ser um tema de debate em curso 8,9, no entanto, exossomos são geralmente descritos como pequena, 40 a 100 nm partículas derivadas da fusão endosomal com a membrana plasmática, enquanto MVs são maiores de 100 a 1.000 partículas nm formado por derramamento da membrana plasmática 10. Aqui, o termo geral &quot;EVs&quot; será usado para se referir a todos os tipos de vesículas extracelulares biológicos liberadas pelas células. Isolamento de VE de sangue total é um processo multi-passo e muitas variáveis ​​de processamento diferentes têm sido demonstrado que afectam o conteúdo EV, incluindo a temperatura e duração de armazenamento 11,12, anticoagulante / conservante utilizado e 13método de centrifugação usado 14. A necessidade de padronização dessas variáveis ​​levou a recomendações da Sociedade Internacional sobre Trombose e processamento de sangue e isolamento EV procedimentos Haemostasis Comité Científico e Normalização (ISTH SSC) para o bom 15,16, ainda não existe um consenso entre os pesquisadores sobre o protocolo ideal usar 12. A maioria concorda, no entanto, que as variáveis ​​pré-analíticas rigidamente controladas são cruciais para a dados precisos e reprodutíveis. A fim de analisar EVs, os pesquisadores têm utilizado vários métodos, incluindo microscopia eletrônica de transmissão 17, microscopia eletrônica de varredura 18,19, microscopia de força atômica, luz dinâmica de espalhamento 20,21 e western blot 22,23. Enquanto FCM é o método de escolha para muitos pesquisadores 9,24 - 26, devido às suas capacidades de alto rendimento, a análise de EVs usando FCM tem sidonotoriamente difícil devido ao seu tamanho e falta de populações positivas discretas 27-32. Em comparação com a análise de células, o tamanho pequeno das EVs resulta em 1) menos fluorescência emitida, devido ao menor número de antigénios por partícula e 2) viabilidade limitada de lavagem pós-mancha, a qual é necessária para reduzir a fluorescência de fundo. Desafios comuns entre os pesquisadores incluem sinais decorrentes de agregados de imunoglobulinas 27,28 e auto-agregação de anticorpos 29. Além disso, os tempos de processamento longos e procedimentos de lavagem / isolamento morosos utilizados por muitos dos protocolos actuais requerem 33,34 compromissos de tempo de vários dias para analisar um pequeno número de amostras, tornando-os menos do que ideal para aplicações de alto débito. Alguns pesquisadores renunciar a um passo de lavagem por completo, tornando tradicionalmente utilizados controles negativos FCM como uma fluorescência menos (FMO) e isotipos de anticorpos inútil para avaliar com precisão bacfluorescência kground 30. Nossos protocolos de enfrentar três problemas comuns que podem impedir a análise FCM adequada de EVs: Os sinais resultantes de agregados de anticorpos e outros não-vesículas, dificuldade em remover o anticorpo não ligado, e falta de populações positivos discerníveis. As técnicas descritas aqui irão auxiliar com eliminando os agregados de anticorpos normalmente encontradas em preparações comerciais, o aumento da razão sinal-para-ruído, e definindo portões de uma forma racional, que minimiza a detecção de fluorescência de fundo. Dois métodos diferentes de detecção são aqui apresentados: o primeiro protocolo utiliza um método de detecção individual que é especialmente bem adequado para a análise de um grande volume de amostras clínicas, enquanto que o segundo protocolo utiliza uma abordagem baseada em grânulos para capturar e detectar os VE e exossomas menores.

<table><tbody><tr><td>Citômetro de fluxo de bancada LSR II</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>3-laser (20 mW Coherent Sapphire 488 nm azul, 25 mW Coherent Vioflame 405 nm violeta, e 17 mW JDS Uniphase HeNe 633 nm vermelho)</td></tr><tr><td>Software FACS Diva&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>PC versão 6.0</td></tr><tr><td>Software FlowJo&nbsp;</td><td>Treestar US</td><td></td><td>Mac versão 9.6.1 ou PC versão 7.6.5</td></tr><tr><td>Sphero Rainbow partículas fluorescentes</td><td>BD Biosciences 556298</td><td></td><td>usado para ajustar todas as tensões de canal para manter a consistência da intensidade da fluorescência&nbsp;</td></tr><tr><td>Partículas fluorescentes Ultra Rainbow&nbsp;</td><td>Spherotech</td><td>URFP-10-5</td><td>usado além dos grânulos SSC Megamix-Plus para garantir a consistência do gating EV de lote para lote</td></tr><tr><td>Os grânulos Megmix-Plus SSC</td><td>Biocytex</td><td>7803</td><td>usado para ajustar as tensões FSC e SSC para manter a consistência entre as execuções. Também pode ser usado para monitorar a taxa de fluxo e ajustar a discagem da taxa de fluxo, a fim de garantir que a mesma taxa de fluxo seja usada em todas as execuções</td></tr><tr><td>Kit de contas anti-mouse AbC</td><td>Life Technologies</td><td>A-10344</td><td>usado para controles de compensação e contas AbC negativas usadas para o método baseado em contas</td></tr><tr><td>Nonidet P-40 Alternativa (NP-40) (CAS 9016-45-9)</td> <td>Santa Cruz&nbsp;</td><td>SC-281108</td><td>Usado no método de detecção individual apenas para lisar amostras após a leitura inicial para uso como controles negativos. O estoque pode ser diluído para 1:10 em PBS e armazenado na geladeira por até 1 mês.</td></tr><tr><td>Tubos BD TruCOUNT A</td><td>BD Biosciences</td><td>340334</td><td>usada sempre que concentrações absolutas de EV são necessárias</td></tr><tr><td>Ultrafree-MC, GV 0.22 &micro; m Unidades de Filtro Centrífugo</td><td>Millipore&nbsp;</td><td>UFC30GVNB</td><td>usado para lavagem pós-mancha Evs e/ou EVs fracionados com base no tamanho</td></tr><tr><td>Tubos de sangue total de vidro Vacutainer ACD-A</td><td>BD Biosciences</td><td>364606</td><td></td></tr><tr><td>Tubos Facs 12x75 poliestireno</td><td>BD Biosciences</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Reservatórios embalados individualmente&nbsp;</td>Pontas de pipeta <td>Phenix</td><td>RR-50-1s</td><td></td></tr><tr><td>Green-Pak - 10 &micro; l</td> Pontas de pipeta <td>Rainin</td><td>GP-L10S</td><td></td></tr><tr><td>Green-Pak -200 &micro; l&nbsp;</td>Pontas de pipeta <td>Rainin</td><td>GP-L250S</td><td></td></tr><tr><td>Green -Pak - 1.000 &micro; l&nbsp;</td><td>Pontas Rainin</td><td>GP-L1000S</td><td></td></tr><tr><td>Stable Stack L300 pré-esterilizadas</td><td>Rainin</td><td>SS-L300S</td><td></td></tr><tr><td>Pipet-Lite&nbsp;XLS 8 Canais LTS&nbsp; Ajustável&nbsp; Espaçador&nbsp;</td>Placas de cultura de tecidos <td>Rainin</td><td>LA8-300XLS</td> de 96 poços <td></td></tr><tr><td></td><td>E& K Scientific</td><td>EK-20180</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Mídia (sem Hepes)</td> <td>Instalação de Cultura de Células UCSF</td><td>CCFAE001</td><td>mídia usada para método de detecção baseado em esferas</td></tr><tr><td>Dulbeccos PBS D-PBS, CaMg-free, 0.2 &micro; m filtrado</td><td>UCSF Cell Culture Facility</td><td>CCFAL003</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifuge Tube, Thinwall, Ultra-Clear</td><td>BECKMAN COULTER INC</td><td></td><td></td></tr> 344058 <tr><td>PANEL I</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD3 PerCP-Cy5.5</td><td>Biolegend</td><td>344808</td><td>2 &micro; l</td></tr><tr><td>CD14 APC-Cy7</td><td>Biolegend</td><td>301820</td><td>2 &micro; l</td></tr><tr><td>CD16 V450</td><td>BD Biosciences</td><td>560474</td><td>2 &micro; l</td></tr><tr><td>CD28 FITC</td><td>biolegend</td><td>302906</td><td>2 &micro; l</td></tr><tr><td>CD152 APC</td><td>BD Biosciences</td><td>555855</td><td>2 &micro; l</td></tr><tr><td>CD19 A700</td><td>Biolegend</td><td>302226</td><td>2 &micro; l</td></tr><tr><td>PAINEL II</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD41a PerCP-Cy5.5</td><td>BD Biosciences</td><td>340930</td><td>2 &micro; l</td></tr><tr><td>CD62L APC</td><td>Biolegend</td><td>304810</td><td>2 &micro; l</td></tr><tr><td>CD108 PE&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>552830</td><td>2 &micro; l</td></tr><tr><td>CD235a FITC</td><td>biolegend</td><td>349104</td><td>2 &micro; l</td></tr><tr><td>PAINEL III</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD11b PE-Cy7</td><td>Biolegend</td><td>301322</td><td>2 &micro; l</td></tr><tr><td>CD62p APC</td><td>Biolegend</td><td>304910</td><td>2 &micro; l</td></tr><tr><td>CD66b PE&nbsp;</td><td>Biolegend</td><td>305106</td><td>2 e micro; l</td></tr><tr><td>CD15 FITC</td><td>exalpha</td><td>X1496M</td><td>5 &micro; l</td></tr><tr><td>CD9 PE</td><td>Biolegend</td><td>555372</td><td></td></tr><tr><td>CD63 APC</td><td>Biolegend</td><td>353008</td><td></td></tr><tr><td>APC-Cy7 Ms IgG2a, &kappa;</td><td>Biolenda</td><td>400230</td><td></td></tr></tbody></table>

técnicas de análise de vesículas extracelulares utilizando citometria de fluxo

Techniques for the Analysis of Extracellular Vesicles Using Flow Cytometry

Vesículas extracelular (VE) são pequenas, vesículas derivadas de membrana encontrados nos fluidos corporais que são altamente envolvido na comunicação célula-célula e ajudam a regular uma variada gama de processos biológicos. Análise de EVs usando citometria de fluxo (FCM) tem sido notoriamente difícil devido ao seu pequeno tamanho e falta de populações discretas positivas para os marcadores de interesse. Métodos de análise EV, enquanto melhorou consideravelmente na última década, ainda são um trabalho em andamento. Infelizmente, não há one-size-fits-all protocolo, e vários aspectos devem ser considerados para determinar o método mais adequado para usar. Apresentado aqui estão várias técnicas diferentes para o processamento de EVs e dois protocolos para a análise de EVs usando detecção individual ou uma abordagem baseada no talão. Os métodos descritos aqui vai ajudar com eliminando os agregados de anticorpos normalmente encontrados em preparações comerciais, aumentando a relação sinal-ruído, e portões configuração em um f racionalashion que minimiza a detecção de fluorescência de fundo. O primeiro protocolo utiliza um método individual de detecção que é especialmente adequado para a análise de um grande volume de amostras clínicas, enquanto que o segundo protocolo utiliza uma abordagem baseada no grânulo para capturar e detectar os VE e exossomas menores.

<html> A Figura 1 apresenta o esquema de tratamento global para o isolamento e detecção de veículos eléctricos, utilizando quer o método baseado em grânulo ou método de detecção individual. Detecção individual de EVs usando FCM funciona bem para a análise de EVs maiores, mas a maioria dos cytometers não são capazes de detectar individualmente partículas tão pequenas como exossomos. Uma abordagem baseada em grânulo permite VE pequenas para serem detectados, no entanto, existem desvantagens associadas com ...

Existem muitos métodos diferentes para a medição de vesículas extracelulares (SVE) utilizando citometria de fluxo (FCM). Vários aspectos devem ser considerados para determinar o método mais adequado para usar. Dois protocolos de VE de medição são apresentadas, usando detecção individual ou uma abordagem baseada no talão.

Técnicas de Análise de vesículas extracelulares utilizando citometria de fluxo

Extracellular Vesicles (EVs) are small, membrane-derived vesicles found in bodily fluids that are highly involved in cell-cell communication and help ...

O objetivo geral deste procedimento é isolar e analisar a circulação de vesículas extracelulares no sangue por dois métodos diferentes. Para o método de detecção de vesículas extracelulares individuais, o plasma pobre em plaquetas ou PPP é primeiramente isolado de uma amostra de sangue.O PPP é então corado com os anticorpos conjugados a fluorocromos de interesse. Para o método de detecção baseado em microesferas, as vesículas extracelulares são incubadas com microesferas, e então as vesículas ligadas às microesferas são coradas com os anticorpos relevantes conjugados a fluorocromos. Por fim, o conteúdo de vesículas extracelulares circulantes pode ser determinado pela análise das amostras por citometria de fluxo.A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como microscopia eletrônica ou separação por microesferas magnéticas, é que ela é muito mais rápida e permite a avaliação da população total de escal extracelular, em vez de se limitar a subpopulações específicas. Geralmente, indivíduos novos neste método terão dificuldades, pois o sucesso deste procedimento exige uma adesão rigorosa às manobras demonstradas e aos parâmetros de configuração do citômetro. Par

techniques-for-analysis-extracellular-vesicles-using-flow

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Este vídeo demonstra a imunocaptura de vesículas extracelulares usando conjugados de nanopartículas magnéticas de anticorpos de captura marcados com fluorescência. O processo envolve formação complexa, coloração com anticorpos de detecção marcados com fluorescência, separação magnética e análise de citometria de fluxo para caracterização antigênica.

Imunocaptura e citometria de fluxo de vesículas extracelulares para caracterização antigênica

Vírus ou vesículas extracelulares foram imunocapturados com nanopartículas magnéticas de 15 nm acopladas a anticorpos que reconhecem antígenos de superfície. Os vírions ou vesículas capturados foram marcados com anticorpos fluorescentes contra outros antígenos de superfície. Os complexos resultantes foram separados em alto campo magnético e analisados com citômetros de fluxo convencionais acionados por fluorescência.

Fluxo Virometry para analisar antigênica Spectra de viriões e Extracelular vesículas

Neste protocolo, descrevemos o fluxo de trabalho completo para isolamento rápido das vesículas extracelulares de sangue total humano e caracterização de marcadores específicos pela análise de controle de nanopartículas baseada em fluorescência. Os resultados apresentados mostram um elevado nível de reprodutibilidade e podem ser ajustados para sobrenadantes de cultura de células.

Caracterização de baseada em fluorescência rápida das vesículas extracelulares única no sangue humano, com análise de acompanhamento de nanopartículas

O protocolo descreve um método reprodutível, projetado para uso com sobrenadantes de cultura celular para detectar epítopos superficiais em pequenas vesículas extracelulares (EV). Ele utiliza a imunoprecipitação de EV específica usando grânulos juntamente com anticorpos que reconhecem o antígeno de superfície CD9, CD63 e CD81. O método é otimizado para análise de citometria de fluxo a jusante.

Fluxo Cytometric análise das vesículas extracelulares de célula-condicionado Media

A última geração de ferramentas de caracterização de EV é capaz de uma única análise de EV em vários parâmetros simultaneamente. A citometria de nanofluxo mede todas as partículas biológicas maiores que 45 nm sem marcação e identifica características específicas de subpopulações por uma variedade de técnicas de marcação fluorescente.

Caracterização da Proteína Transmembrana da Vesícula Extracelular Única por Citometria de Nanofluxo

Este protocolo fornece um método de isolamento rápido e específico para pequenas vesículas extracelulares, otimizando o tamanho do bico de pulverização de ar, a pressão do fluido da bainha, a pressão do fluxo da amostra, a tensão, o ganho e os parâmetros do limiar de disparo.

Otimização dos Parâmetros de Classificação por Citometria de Fluxo para Isolamento de Alto Rendimento e Purificação de Pequenas Vesículas Extracelulares

Aqui, descrevemos um protocolo simples que permite a avaliação in vitro da abundância de microRNAs marcados fluorescentemente para estudar a dinâmica do empacotamento de microRNA e exportação para vesículas extracelulares (EVs).

Rastreando a liberação de miRNA em vesículas extracelulares usando citometria de fluxo

Aqui, demonstramos o método de caracterização de vesículas extracelulares (EVs) coletadas de fluidos biológicos, como lágrimas e saliva, de seres humanos. O scanner usado neste método é capaz de detectar o fenótipo, tamanho e contagem total de partículas de EVs a partir de 1 μL da amostra.

Caracterização de Vesículas Extracelulares a partir de Fluidos Biológicos

Um método eficiente para obter altamente purificada viável frações meiótica de testículo do rato é descrito, que combina uma refinada célula dissociação protocolo com fluorescentes separação de células ativadas (FACS). Este método tira vantagem de diferenças no conteúdo de DNA nuclear e densidade de frações discretas meiótica.

Purificação de Citometria de Fluxo de células de camundongo meiótica

O sucesso no uso de corantes de rastreamento celulares para monitorar a função de células imunes e proliferação envolve várias etapas críticas. Descrevemos métodos para: 1) a obtenção de brilhante, uniforme, reprodutível etiqueta ing com corantes de membrana, 2) selecção de fluorocromos e condições de aquisição de dados, e 3) a escolha de um modelo para quantificar a proliferação de células com base na diluição de corante.

Optimizado coloração e Proliferação Métodos de Modelagem para Monitoramento Divisão Celular usando Corantes Rastreamento celulares

Aprenda a isolar e analisar vesículas extracelulares no sangue usando citometria de fluxo. Este método compara detecção individual e baseada em micropartículas para análise precisa de EVs circulantes.

Técnicas de Análise de vesículas extracelulares utilizando citometria de fluxo

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