Técnicas de Análise de vesículas extracelulares utilizando citometria de fluxo

O objetivo geral deste procedimento é isolar e analisar a circulação de vesículas extracelulares no sangue por dois métodos diferentes. Para o método de detecção de vesículas extracelulares individuais, o plasma pobre em plaquetas ou PPP é primeiramente isolado de uma amostra de sangue.

O PPP é então corado com os anticorpos conjugados a fluorocromos de interesse. Para o método de detecção baseado em microesferas, as vesículas extracelulares são incubadas com microesferas, e então as vesículas ligadas às microesferas são coradas com os anticorpos relevantes conjugados a fluorocromos. Por fim, o conteúdo de vesículas extracelulares circulantes pode ser determinado pela análise das amostras por citometria de fluxo.

A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como microscopia eletrônica ou separação por microesferas magnéticas, é que ela é muito mais rápida e permite a avaliação da população total de escal extracelular, em vez de se limitar a subpopulações específicas. Geralmente, indivíduos novos neste método terão dificuldades, pois o sucesso deste procedimento exige uma adesão rigorosa às manobras demonstradas e aos parâmetros de configuração do citômetro. Para obter dados de alta qualidade com variação mínima de um dia para outro, comece centrifugando amostras de sangue total para separar o plasma da camada de buffy coat e das hemácias. Em seguida, transfira alíquotas de 1,2 mililitro do sobrenadante plasmático para tubos de centrífuga de 1,5 mililitro, tomando cuidado para não perturbar as camadas inferiores que contêm o buffy coat e as hemácias; depois, centrifugue novamente o sobrenadante para remover quaisquer plaquetas e grandes fragmentos celulares.

No final da centrifugação, transfira cuidadosamente todo o sobrenadante, exceto os últimos 200 microlitros das amostras de PPP, para tubos novos, tomando cuidado para não perturbar os pellets. Em seguida, misture o plasma para cima e para baixo várias vezes e transfira 320 microlitros de cada amostra para a linha superior de uma placa de 96 poços. Para corar as amostras, combine os anticorpos de interesse para cada um dos três painéis em tubos individuais de filtro centrífugo de 0,22 micrômetros e centrifugue os anticorpos usando uma centrífuga de ângulo fixo e velocidade única.

Quando todo o anticorpo tiver passado pelo filtro, adicione a quantidade apropriada da mistura a cada poço da placa de 96 poços conforme ilustrado na figura. Em seguida, use uma pipeta multicanal para misturar as amostras de PPP e, depois, transfira 100 microlitros de cada amostra para os anticorpos da segunda linha. Em seguida, misture novamente as amostras, troque as ponteiras e transfira 100 microlitros de amostra para cada uma das próximas duas linhas de anticorpos conforme apropriado.

Para o experimento. Incube a placa a quatro graus Celsius após 30 minutos com 220 microlitros de PBS por poço nas linhas seis a oito dentro de uma cabine de segurança biológica. Em seguida, utilizando uma pipeta multicanal com largura ajustável, transfira o conteúdo de cada poço para o respectivo tubo de filtro centrífugo sem trocar as ponteiras.

Utilize 200 microlitros de PBS de uma das linhas de lavagem para enxaguar as placas das quais as amostras foram recém-removidas. Em seguida, transfira a solução de enxágue para os mesmos filtros aos quais as amostras de PPP foram previamente adicionadas e feche os filtros centrífugos. Depois que todas as amostras de PPP coradas tiverem sido transferidas juntamente com suas soluções de enxágue, centrifugue as amostras em uma centrífuga com rotor fixo.

Após a centrifugação, certifique-se de que nenhum líquido permaneça sobre os filtros. Em seguida, re-suspenda as partes superiores dos filtros em 300 microlitros de PBS e transfira o conteúdo re-suspenso para tubos pré-rotulados para análise imediata por citometria de fluxo. A lavagem das amostras coradas utilizando filtros centrífugos melhora a separação entre os sinais de marcador positivo e o fundo.

É importante observar, no entanto, que algumas das vesículas extracelulares menores, incluindo exossomos, podem ser perdidas através dos poros do filtro. Para analisar as amostras, primeiro configure os parâmetros de voltagem de dispersão direta e dispersão lateral na escala logarítmica e selecione os limiares mais baixos permitidos pelo citômetro para cada parâmetro. Em seguida, enquanto executa um tubo contendo PBS filtrado com partículas de zero vírgula vinte e dois micrômetros, ajuste essas voltagens aos valores mais altos que excluam a maior parte do ruído de fundo. Depois, execute um tubo contendo uma mistura de microesferas, de um micrômetro e menores, e desenhe uma porta ao redor da população de microesferas em um gráfico de dispersão direta versus dispersão lateral para capturar todos os eventos abaixo das microesferas de um micrômetro.

Agora, ajuste a taxa de fluxo do citômetro para baixa e use as microesferas para regular o botão de taxa de fluxo do citômetro até a taxa de eventos desejada. Em seguida, utilizando um tubo de partículas fluorescentes multicoloridas diluídas em PBS, adquira 5.000 eventos, registrando a intensidade média dos valores de dispersão para frente, dispersão lateral e cada canal de cor. Quando todos os parâmetros estiverem definidos, execute cada amostra por exatamente um ou dois minutos. Após a primeira leitura de cada tubo ser concluída, adicione 20 microlitros de MP 40 a 10% em cada amostra e releia os tubos pelo mesmo período de tempo, permitindo a subtração dos eventos positivos detectados na amostra lisada ao longo de um intervalo igual.

Para detectar as vesículas extracelulares por captura baseada em microesferas, comece lavando duas vezes microesferas de poliestireno não revestidas de seis micrômetros com meio RPMI, seguido de ressuspendê-las em dois mililitros do mesmo meio. Em seguida, adicione 6.000 microesferas a cada novo tubo de ensaio, ao tubo controle negativo 400 microlitros de meio, a todos os outros tubos 200 microlitros de PPP ou vesículas extracelulares ultracentrifugadas conforme apropriado, e 200 microlitros de meio. Ajuste o volume final em cada tubo para 400 microlitros.

Com mais meio. Incube os tubos durante a noite a quatro graus Celsius em agitador. Na manhã seguinte, lave as esferas com dois mililitros de meio.

Aspire o sobrenatante e bloqueie qualquer ligação inespecífica com 400 microlitros de albúmina sérica bovina a 5%, colocando em agitador a quatro graus Celsius por três horas. Após três horas, lave as microesferas com mais dois mililitros de meio e reconstitua os pellets em 100 microlitros de meio fresco. Agora filtre os anticorpos e adicione o volume apropriado do coquetel de anticorpos filtrado a cada tubo; após 30 minutos a quatro graus Celsius, lave as microesferas com mais dois mililitros de meio.

Neste momento, ressuspenda os pellets em 400 microlitros de meio e analise imediatamente as amostras por citometria de fluxo, ajustando os parâmetros de dispersão direta interna ao limite mais baixo permitido pelo citômetro de fluxo, conforme acabou de ser demonstrado. Por fim, delimite a população de microesferas singletas e adquira 2000 eventos por amostra. Tanto os métodos de detecção individuais quanto os baseados em microesferas podem ser utilizados para detectar a presença de vesículas extracelulares nas amostras de PPP, conforme ilustrado por esses gráficos de dispersão. No ensaio de detecção individual, o controle lisado é utilizado para definir as janelas de seleção para a amostra correspondente não listada.

A maioria dos eventos deve estar dentro do limite das vesículas extracelulares. Por exemplo, nestes gráficos de dois parâmetros, observou-se a detecção dos marcadores CD108A e CD235A, dois marcadores de hemácias conhecidos por coexistirem em células. Como esperado, mais da metade dos eventos positivos nas vesículas extracelulares é positiva para ambos os marcadores, enquanto nestes gráficos de dois parâmetros, a expressão nas vesículas extracelulares de dois marcadores sabidamente não coexistentes em células exibe populações positivas distintas e separadas, utilizando o método de detecção baseado em microesferas.

Não existe separação entre as populações positivas e negativas, e os eventos aparecem nos quadrantes duplo-positivos, mesmo que normalmente não sejam encontrados nos mesmos tipos celulares, devido ao fato de que ambos os tipos de vesículas extracelulares se ligarão a uma única esfera. Portanto, os dados obtidos com este método são melhor analisados usando histogramas sobrepostos aos dados do controle negativo, observando-se um deslocamento aparente na expressão do marcador nas amostras com esferas em comparação aos controles, uma vez dominado o procedimento. Após dominar esta técnica, é possível analisar 12 amostras de sangue com três painéis de anticorpos em três a quatro horas com o método de detecção individual ou em um dia e meio com o método de esferas, se realizado corretamente.

Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de manter a consistência no tratamento de cada amostra, garantindo que a taxa de fluxo do citômetro e as intensidades fluorescentes tenham sido ajustadas corretamente no início de cada experimento para corresponder às configurações experimentais do dia anterior, especialmente ao analisar múltiplas amostras em diferentes dias.