Geração de espessura completa tridimensional Pele Equivalente e Automated Ferimento

O objetivo geral deste procedimento é construir um equivalente tridimensional de pele de espessura total, que se assemelhe à pele natural e gerar feridas precisas e reprodutíveis sob condições estéreis usando um dispositivo de ferimento automatizado. Isso é feito pela incorporação de fibroblastos dérmicos humanos primários em um hidrogel de colágeno. Em seguida, os queratinócitos epidérmicos humanos primários são assentados na parte superior do hidrogel revestido com fibronectina.

Em seguida, o modelo é cultivado em condições submersas e, em seguida, sob uma interface ar-líquido, forma-se um equivalente tridimensional de pele de espessura total, composto por um componente dérmico e uma epiderme multicamadas. Finalmente, uma ferida padronizada é gerada em um ambiente estéril. Em última análise, a coloração imuno-histoquímica e a microscopia são usadas para avaliar a estrutura histológica do equivalente de pele de espessura total ferida.

A principal vantagem dessa técnica dos métodos existentes, como modelos animais, por exemplo, é que o equivalente de espessura total da pele é composto por células humanas primárias. Assim, juntamente com o dispositivo de ferimento automatizado, podemos gerar feridas padronizadas, de modo que o dispositivo de ferimento automatizado pode fornecer informações sobre os processos de cicatrização de feridas na pele em ambiente humanizado. Também pode ser aplicado aos nossos sistemas, como engenharia de tecidos ósseos.

Este método pode ajudar a responder a questões-chave da cicatrização de feridas, como processos biológicos, reparo da pele subjacente e a interferência celular entre o componente epidérmico e dérmico. Para começar, dissolva o colágeno com 0,1% de ácido acético até uma concentração final de seis miligramas por mililitro. Prepare a solução de neutralização em gel misturando 232,5 mililitros de dois X dmm, 7,5 mililitros de FCS, 7,5, mililitros de três molares hees e 2,5 mililitros de cinco miligramas por mililitro.

sulfato de condroitina coloca inserções nos poços de uma placa de 24 poços, destaca fibroblastos dérmicos humanos ou HDFS e centrifuga as suspensões celulares por cinco minutos. A 270 G, contar as células e centrifugar um Eloqua de 1 200 000 HDF durante cinco minutos. A 270 G, remova o snat e use quatro mililitros de solução de neutralização de gel resfriado para ressuspender cuidadosamente o HDF sem causar bolhas de ar.

Em seguida, ressuspenda a solução com oito mililitros de solução de colágeno. Em seguida, use uma pipeta de várias etapas e adicione 500 microlitros de mistura de células de colágeno a cada inserção. Na placa de 24 poços, incube os géis por 20 minutos a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono para permitir que os géis se solidifiquem.

Em seguida, use dois mililitros de DMM mais 10% FCS por poço. Para submergir os géis, incube os géis por 24 horas. Use água ultrapura para dissolver a proteína fibronectina humana até uma concentração final de 50 microgramas por mililitro.

Depois de incubar os géis equivalentes dérmicos por 24 horas, remova o meio. Use 25 microlitros de solução de fibronectina para cobrir cada equivalente dérmico e incube os géis por 30 minutos. Enquanto isso, ressuspenda a epiderme humana, queratinócitos ou HKS com kgm dois mais 5% FCS para uma concentração final de 1 milhão de células por litro de semente, 100.000 heeks em cima de cada gel.

Em seguida, incube géis por 45 minutos para permitir que as células adiram usando kgm dois prontos mais 5% FCS submersos nas células e continue a incubação. Após incubação por dois a três dias, substitua o meio por 2% FCS seguido de substituição do meio sem FCS, dois a três dias depois. Dia sete, remova completamente o meio.

Use uma pinça estéril para colocar cada inserto em um poço de uma placa de seis poços. Em seguida, adicione 1,5 mililitros de meio de transporte aéreo por poço. Tomando cuidado para não molhar a superfície do FTSC.

Troque o meio a cada dois ou três dias por mais 14 dias. Prepare o dispositivo de ferimento automatizado usando etanol a 70% e luz ultravioleta para desinfetar a área de trabalho usando uma pinça estéril. Coloque os equivalentes de pele em áreas designadas da placa de suporte de amostra da autoclave.

Coloque uma placa de suporte de amostra no soquete abaixo da cabeça de perfuração. Use o software de controle para definir os parâmetros de ferimento da seguinte forma. Velocidade de rotação 15.000 RPM de penetração, 1,5 milímetros.

Propulsão 100 hertz. Transfira os parâmetros de ferimento para o dispositivo de ferimento automatizado. Inicie o procedimento de ferimento quando terminar.

Remova a placa de suporte de amostra do soquete e use uma pinça estéril para transferir o FTSE ferido de volta para o inserto usado para cultura. Incubar o FTSE ferido até a avaliação experimental. Use os modelos para sua análise histológica a qualquer momento.

Os isolados HDFS e HKS foram caracterizados por coloração imuno-histoquímica antes de serem usados para FTSE. Os HDF são positivos para menton, um marcador para fibroblastos HEK primário altamente expressam a proteína de diferenciação precoce CITOQUERATINA 14, mas quase nenhuma proteína de diferenciação tardia de queratinócitos CITOQUERATINA 10. Os FTSE foram cultivados por sete dias em condições de meio submerso, seguidos por 14 dias na interface ar-líquido.

Durante esse processo, o FTSC se contrai significativamente em 21 dias. Os HEK estão proliferando alterando o nível médio de tal forma que a superfície dos modelos fique exposta ao ar. E ao aumentar a concentração de cálcio, os HKS são estimulados a se diferenciar em uma epiderme multicelular composta por várias camadas celulares vitais de queratinócitos.

Em diferentes estados de diferenciação D e córtria córtrica. Comparando a coloração de hematina e eosina do FTSE com a pele humana nativa, torna-se óbvio que o FTSE imita a arquitetura histológica da pele. O HDF no hidrogel de colágeno um pode ser corado com anticorpos primários contra a vimentina.

Além disso, os queratinócitos formam uma camada epidérmica composta por células positivas para citoqueratina 14 e o marcador de diferenciação tardia. A CITOQUERATINA 10 é expressa nas camadas superbasais. Além disso, o St.Stratum cornium é positivo para RIN após seu desenvolvimento.

Essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da dermatologia explorarem a cicatrização de feridas cutâneas e uma configuração in vitro padronizada que imita de perto a pele humana.