Name: Geração de espessura completa tridimensional Pele Equivalente e Automated Ferimento (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 35 s
Description: Aprenda a construir um equivalente dérmico completo tridimensional que imita a pele natural usando fibroblastos e queratinócitos humanos primários. Este método automatizado permite gerar feridas padronizadas em ambiente estéril para estudos de biologia cutânea e cicatrização.

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Os autores agradecem ao Fraunhofer ISC pela colaboração na construção do dispositivo automatizado de ferimentos. O projeto foi fundado pelo projeto interno da Fraunhofer "Märkte von Übermorgen" (SkinHeal).

NOTA: O protocolo é concebido para a produção de 24 equivalentes de pele de espessura completa. Human fibroblastos dérmicos e queratinócitos epidérmicos foram isolados a partir de biópsias de pele de acordo com um protocolo publicado anteriormente. 21,22 Foi obtido consentimento informado de antemão e que o estudo foi aprovado pelo comitê de ética institucional em pesquisa humana dos Julius-Maximilians-Universidade Würzburg (votar 182 / 10). 1. Produção de componente dérmico <ol><li> Dissolve-se o colagénio com ácido acético a 0,1% para uma concentração final de 6 mg / ml. Para a solução de neutralização do gel, misturar 232,5 mL 2x DMEM, 7,5 ml de soro fetal de vitelo, 7,5 ml de 3 M de HEPES, 2,5 ml de sulfato de condroitina (5 mg / ml). Mantenha solução neutralização gel e solução de colágeno no gelo. Calcule 500 mL de gel por insert / pele equivalente. NOTA: Como a solução de neutralização gel será misturado com duas partes de solução de colágeno prepare dupla quantidade de colágeno. </li><li> Coloque 24 inserções em uma placa de 24 poços. </li><li> Ressuspender fibroblastos dérmicos humanos (HDF) em 10 ml de DMEM, centrifuga-se durante 5 min a 270 xg e contar as células. Extrai-se a quantidade necessária de HDF (5 x 10 4 culas por 500 ul de gel de colagénio) e centrifuga-se as células durante 5 min a 270 x g. </li><li> Remover o sobrenadante e ressuspender cuidadosamente o HDF em 4 ml de solução arrefecida de neutralização de gel, sem a produção de bolhas de ar. A partir deste passo certifique-se de trabalhar tão rápido quanto possível para evitar a solidificação prematura de géis de colagénio. </li><li> Ressuspender a solução com 8 ml de solução de colagénio. </li><li> Leve o colágeno-cell-mistura com um de vários passos-pipeta e preencher rapidamente 500 mL de mistura em cada inserção. Incubar os géis durante 20 minutos numa incubadora (37 ° C, 5% CO 2) cristalizar os géis. </li><li> Submergir os géis em 2 ml de Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM) + 10% de soro fetal de vitelo (FCS) por poçoe incubar-lo durante 24 horas numa incubadora (37 ° C, 5% CO 2). </li></ol> 2. A adição de queratinócitos epidérmicos humanos (HEK) <ol><li> Remova o meio após 24 horas. Dissolver proteína fibronectina humana com água ultrapura até uma concentração final de 50 ug / ml. Cobrir cada equivalente dérmico com 25 ml de solução de fibronectina. Incubar os géis durante 30 minutos numa incubadora (37 ° C, 5% CO 2). </li><li> Entretanto, ressuspender o hek em 10 ml de KGM-2 e definir a concentração de células para 1 x 10 6 células / ml com KGM-2 pronto + 5% FCS. Semente de 1 x 10 5 células HEK em cada gel. Incubar géis durante 45 minutos na incubadora (37 ° C, 5% CO 2) para permitir que as células a aderirem. </li><li> Submerse os géis com KGM-2 pronto + FCS a 5% e cultura los na incubadora (37 ° C, 5% CO 2). </li></ol> 3. Cultura do pleno Equivalentes da espessura da pele (FTSE) <ol><li> FTSE Cultura para 6-7 diasem concentração decrescente de FCS (5%, 2%, e 0% de FCS). Mudar a forma a cada 2-3 dias com a próxima menor concentração FCS. Para isso, remover completamente o meio e adicionar 1,6 ml de meio fresco. </li><li> No dia 7, remova o meio completamente. NOTA: Não toque na superfície do FTSE com a ponta da pipeta ao fazê-lo. </li><li> Coloque todos os inserir em um poço de uma placa de 6 bem com uma pinça estéril. Adicionar 1,5 ml de meio de transporte aéreo por poço, certifique-se para não molhar a superfície FTSE. Mudar meio cada 2-3 dias durante mais 14 dias. NOTA: O nível de enchimento do meio é até o menisco do FTSE. </li></ol> 4. Análise Histológica <ol><li> Fixação e parafina-incorporação do FTSE <ol><li> Remover o meio de cultura, transferir insertos em placas de 24 poços frescas e fixar tecidos por adição de 1,6 ml de paraformaldeído a 4% a cada poço e incuba-se os tecidos durante 2 h à TA. Cuidado! Paraformaldehyd é tóxico, manipular sob coifa. TransferênciaO FTSE a uma cassete a incorporação de tecidos. Remover fixador restante por lavagem com água e desidratar o tecido usando concentrações de etanol crescente. </li><li> Divida a pele equivalente por um corte vertical no meio. Coloque as duas peças em um molde de base de metal cheio de parafina com superfícies de corte para baixo. Adicionar a cassete de tecido na parte superior do molde como um suporte. </li><li> Corte fatias de 3-5 mm e flutuar-los em um banho de 40 ° C água para straitening, montar os slides em lâminas de microscópio adequados. Fatias secarem completamente. </li></ol></li><li> Hematoxilina e Eosina (H &amp; E) e imuno-histoquímica (IHQ) coloração <ol><li> Colocar as lâminas em prateleira e incubar durante 1 hora a 60 ° C. Certifique-se de que a parafina é derretida. Stain fatias com H &amp; E reidratadas como uma coloração visão geral padronizado. </li><li> Para a coloração com H &amp; E preparar 4x cuvetes de vidro para coloração com xilol, 3x com etanol a 96%, 2x com etanol a 70%, 1x com etanol a 50%, 4x de água desionizada, 1x hematoxilina, 1x HCl-pThanol (13,7 ml de 1 M de HCl ad 200 ml de etanol a 50%), 1x separador de água, 1x eosina (1 g eosina em 100 ml de água desionizada) e 2 x 2-propanol. </li><li> Colocar as lâminas 10 min em xilol I e ​​10 min em xilol II para Desparafinar e reidratar slides. Dip desliza 3x em etanol a 96% I, 3x em etanol a 96% II, 3x com etanol a 70% e 3 x em 50% de etanol. Gire as lâminas em água deionizada. Para diferenciar corante hematoxilina, 2x mergulho na HCl-etanol. Enxágüe em água deionizada. Para blueing, lugar desliza 5 min no separador de água. Para eosina, lugar desliza 1 min em eosina e lavar depois em água deionizada. Para a desidratação, dip slides 2x em etanol a 70%, 2x em etanol a 96% e colocá-las durante 5 min em 2-propanol I, durante 5 min em 2-propanol II, 5 min em xilol I e ​​5 min em xilol II. Depois de H &amp; E coloração, núcleos de células são coradas em azul, citoplasma e matriz extracelular estão manchadas de vermelho. </li><li> Para a recuperação antigênica, remover a parafina com xileno e reidratar fatias para a coloração. Coloque as fatiasna panela a vapor e cozinhe fatias desparafinizadas e reidratadas por 20 min em pré-aquecido 10 mM tampão citrato (pH 6). </li><li> Colocar as lâminas em tampão de lavagem (PBS tampão + 0,5% polissorbato 20) e fatias de círculo com um repelente de slides caneta stylus líquido ou diamante. </li><li> Colocar as lâminas em câmara úmida. O bloqueio da peroxidase endógena, por adição de 100 ul solução de peróxido de hidrogénio a 3% para cada fatia. Cuidado! Muito perigoso em caso de pele e dos olhos contato. Manusear com equipamentos de proteção individual. Lave as lâminas em tampão de lavagem. </li><li> Aplicar o anticorpo primário e incubar durante 1 h à TA. Lave as lâminas três vezes com tampão de lavagem. Daqui em diante, as amostras devem ser mantidas no escuro. </li><li> Use sistema de detecção biotina-estreptavidina para a detecção da ligação antigénio-anticorpo específico. </li><li> Núcleos contracorante com Hematoxilina de 1 min. Desidratar e montar slides. </li><li> Amostras de imagem usando um microscópio invertido. </li></ol></li></ol> &lt;p class = &quot;jove_title&quot;&gt; 5. Lesão por uso do dispositivo Automated Ferimento (AWD) <ol><li> Prepare o AWD por desinfecção da área de trabalho com etanol a 70% e luz ultravioleta. Certifique-se que a cabeça de perfuração do tamanho desejado (por exemplo, 1 mm), está ligado. </li><li> Coloque equivalentes de pele em áreas designadas da placa de suporte da amostra autoclavado usando uma pinça estéril. Coloque a placa de suporte à tomada de amostra abaixo da cabeça de perfuração. </li><li> Use o software de controle para definir os parâmetros ferindo da seguinte forma: a velocidade de rotação: 15.000 rpm; penetração: 1,5 milímetros; propulsão: 100 Hz. Esses parâmetros devem ser definidos para cada tipo de amostra individualmente. Transferência ferindo parâmetros para o AWD. </li><li> Comece ferindo procedimento. Retire a placa transportadora amostra da tomada. Transferência feridos FTSE volta em pastilhas usadas para a cultura usando uma pinça estéril. </li><li> Continuar com a cultura de FTSE feridos na incubadora (37 ° C, 5% CO 2) para a investigação de regeneração. Alternatively, usar os modelos para a análise histológica em qualquer momento. </li></ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Em células in vitro são normalmente expandido em culturas de células de duas dimensões, em que as células aderem a superfícies de plástico. No entanto, estas condições de cultura não reflectem as condições tridimensionais fisiológicas em que as células crescem in vivo. Sob condições tridimensionais, as células podem formar ligações célula-célula e célula-matriz naturais e migrar em três dimensões. Especialmente na cura de feridas cutâneas a semelhança da situação in vivo é essencial p...

A pele é o maior órgão do corpo. Ela cria uma barreira entre o ambiente externo e os órgãos internos. Além disso, a pele protege o corpo contra a perda de fluido, as influências ambientais, infecções e lesões e ajuda a regular a temperatura do corpo 1. Devido à sua localização exposta, a pele é frequentemente afetada pelo trauma mecânico, térmico ou químico. Embora a pele é geralmente capaz de auto-reparo, múltiplos fatores locais, como infecção, oxigenação e suficiência venosa pode levar a cicatrização de feridas prejudicada. Cicatrização de feridas também pode ser interferido por fatores sistêmicos como a obesidade, alcoolismo, tabagismo, medicação, nutrição e doenças como a diabetes. 2 O processo de cicatrização de feridas pode ser dividida em três fases: (i) a fase inflamatória, (ii) o proliferativas e o (iii) em fase de remodelação. Após lesão da pele, um sinal complexo inicia-cascata, levando ao encerramento da ferida. 3Após um traumatismo, a ferida é sangramento e um coágulo sanguíneo é formado. Os fibroblastos passar para o coágulo de sangue e substituí-lo por um novo tecido que seja posteriormente remodelada ao longo dos anos. O entendimento atual da reparação cutânea processos biológicos subjacente é limitado. Pequenos modelos animais e de suínos têm sido usados ​​para estudar a cicatrização de feridas. No entanto, estes resultados não podem ser transferidos diretamente para os seres humanos devido a diferenças específicas de cada espécie. Em adição a estes modelos in vivo, alguns aspectos da cicatrização de feridas pode ser estudado através da simulação de uma situação de ferida através de riscar em culturas de monocamada in vitro com base em linhas celulares imortalizadas ou células primárias. 4 Estes modelos riscar são altamente padronizados, mas não suficientemente reflectir o fisiologia complexo in vivo. Além disso 5 modelos bidimensionais, tridimensionais equivalentes de pele humana foram desenvolvidas para a investigação dermatológica. A parte dérmica desses modelos são generated utilizando diversos suportes, incluindo derme decelularizados, 6 hidrogéis colágeno, 7,8 glicosaminoglicanos 9 ou materiais sintéticos. 10 Empregando estas equivalentes de pele, o papel das interações epitélio-mesenquimal 11, a re-epitelização, o crosstalk celular entre fibroblastos e queratinócitos e a influência de diferentes factores de crescimento pode ser estudada. Além disso, estes modelos são úteis para obter novos conhecimentos sobre como fibroblastos migram para a área ferida e como fatores quimiotáticos influenciar a regeneração dos tecidos 12. Não só geração do próprio modelo a cicatrização de feridas é um desafio, mas também para estabelecer uma ferida altamente padronizada em um modelo é problemático. As técnicas comuns para criar as feridas são testes de risco, 13 queimaduras, 14 de fita de abrasão, 15 lesões térmicas, 16 blisters de sucção, nitrogênio líquido 17, 18, ​​19 lasers </sup&gt; bisturis, 18 meshers 6 e punções. 20 A maioria desses métodos têm as mesmas armadilhas. Lesões implementadas manualmente são difíceis de padronizar e se reproduzir entre vários testes. O tamanho, forma e profundidade da ferida variar entre estudos e, assim, prejudicar a qualidade dos dados de pesquisa. O uso do laser para ferir a pele pode ser definido de forma relativamente fácil padronizado, mas conduz a uma situação que imita queimaduras. O calor aplicado por laser pode provocar a desnaturação da proteína, agregação de plaquetas constrição ou navios, o que pode levar ao tecido necrótico. Em uma abordagem alternativa, foi desenvolvido um dispositivo ferimento automatizado (AWD), que nos permite gerar feridas cutâneas definidas e precisas em condições estéreis. Parâmetros ferindo, como profundidade e velocidade de penetração, bem como as revoluções da cabeça de perfuração pode ser regulada. Neste estudo, nós combinamos o AWD com em casa desenvolvidos espessura completa equivalentes de pele (ftSE), que são comparáveis ​​a um protocolo publicado por Gangatirkar et al. 8 a camada dérmica da pele equivalente é composta por fibroblastos dérmicos humanos (HDF), que são incorporados em colagénio I um hidrogel. Na camada dérmica, os queratinócitos epidérmicos humanos (HEK) são semeadas. Dentro de duas semanas na interface ar-líquido da HEK construir-se uma epiderme composta de várias camadas de células vitais e um estrato córneo. Para além da geração de este modelo, este estudo mostra a utilização do AWD para criar feridas definidos e precisos em FTSE.

<table><tbody><tr><td>Tripsina EDTA (1:250) 0,5% em DPBS</td><td>PAA</td><td>L11-003</td><td>0,05%</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Fosfato Tampolado Salino</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Colágeno (6 mg/ml em 0,1% de ácido acético)</td> <td>Produzido em casa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fibronectina Proteína Humana, Plasma (50&nbsp; &micro; g/ml)</td><td>Life Technologies</td><td>33016-015</td><td></td></tr><tr><td>Inserções</td><td>Nunc</td><td>140627</td><td></td></tr><tr><td>placa de 6 poços&nbsp;</td>Placa <td>de 140685</td><td></td> <td>Nunc</td></tr><tr>de<td>24 poços</td><td>Nunc</td><td>142485</td><td></td></tr><tr><td>lâminas de microscópio</td><td>R. Langenbrinck</td><td>03-0070</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Cultura de fibroblastos (500 ml):</td></tr><tr><td>DMEM, alta glicose</td><td>Life Technologies</td><td>11965-092</td><td>89% (445 ml)</td></tr><tr><td>Soro bovino fetal</td><td>Bio & Venda</td><td>FCS. ADD.0500</td><td>10% (50 ml)</td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina (10,000 U/ml)</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td>1% (5 ml)</td></tr><tr><td colspan="4"><forte>Meio de cultura de Keratinozyten (500 ml):</td></tr><tr><td>Meio de Crescimento de Queratinócitos 2</td><td>Promocell&nbsp;</td><td>C-20111</td><td>89% (445 ml)</td></tr><tr><td>Meio de Crescimento de Queratinócitos 2 SupplementPack</td><td>Promocell&nbsp;</td><td>C-39011</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina (10.000 U / ml)</td> <td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td>1% (5 ml)</td></tr><tr> < td colspan = "4 ">< forte > Solução de neutralização em gel (250 ml): < / forte ></td></tr> <tr><td>Dulbecco ' s Meio Eagle Modificado, alto teor de glicose em pó com L-Glutamina</td><td>PAA</td><td>G0001,3010</td><td>93% (232,5 ml)</td></tr><tr><td>Sal de sódio de sulfato de condroitina de cartilagem de tubarão</td><td>Sigma</td><td>C4384-1g</td><td>1% (2,5 ml)</td></tr><tr><td>Soro bovino fetal</td><td>Bio & Venda</td><td>FCS. ADD.0500</td><td>3% (7,5 ml)</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>H3375-1kg</td><td>3% (7.5 ml)</td></tr><tr><td colspan="4">Modelo de pele submersos médios (500&nbsp; ml):</td></tr><tr><td>Meio de Crescimento de Queratinócitos 2</td><td>Promocell&nbsp;</td><td>C-20111</td><td></td></tr><tr><td>Meio de Crescimento de Queratinócitos 2 Suplemento Promocell</td><td>&nbsp;</td><td>C-39011</td><td></td></tr><tr><td>Soro fetal de bezerro</td><td>Bio & Venda</td><td>FCS. ADD.0500</td><td>5%-2% (25 ml-10 ml)&nbsp;</td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina (10.000 U/ml)</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td>1% (5 ml)</td></tr><tr><td colspan="4"><forte>Modelo de pele meio de interface ar-líquido (500 ml):</forte></td></tr><tr><td>Meio de Crescimento de Queratinócitos 2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Meio de Crescimento de Queratinócitos 2 Pacote de Suplementos</td><td>Promocell&nbsp;</td><td>C-39011</td><td>adicionando apenas suplementos: insulina, hidrocortisona, epinefrina, transferrina, CaCl2</td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina (10.000 U/ml)</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td>1% (5 ml)</td></tr><tr><td>CaCl2 (300 mM)</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>C7902-500g</td><td>0,62% (3,1 ml)</td></tr><tr><td colspan="4">Histologia:</td></tr><tr><td>IHC-Kit DCS SuperVision 2 HRP</td><td>DCS</td><td>PD000KIT</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo Vimentina</td><td>Abcam</td><td>ab92547</td><td></td></tr><tr><td>CK14</td><td>anticorpo Sigma&nbsp;</td><td>HPA023040-100&micro; l</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo CK10</td><td>Dako</td><td>M7002</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo de filaggrina</td><td>Abcam</td><td>ab81468</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">H& Coloração E: < / forte ></td></tr> <tr><td>Mayer &agudo; s Haemalaun</td><td>AppliChem</td><td>A0884,2500</td><td></td></tr><tr><td>Xylol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>296325-4X2L</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>32205-4X2.5L</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H1758-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Eosin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E4009-5G</td><td></td></tr><tr><td>2-Propanolol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I9516-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Meio de montagem</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M1289-10ML</td><td></td></tr></tbody></table>

geração de espessura completa tridimensional pele equivalente e automated ferimento

Generation of a Three-dimensional Full Thickness Skin Equivalent and Automated Wounding

Os modelos in vitro são uma alternativa econômica e ética para estudar os processos de cicatrização de feridas cutâneas. Além disso, usando células humanas, esses modelos refletem a situação da ferida humana melhor do que os modelos animais. Embora os modelos bidimensionais sejam amplamente utilizados para investigar processos como migração e proliferação celular, modelos mais complexos são necessários para obter um conhecimento mais profundo sobre a cicatrização de feridas. Além de um sistema de modelo adequado, a geração de feridas precisas e reprodutíveis é crucial para garantir resultados comparáveis entre diferentes testes. Neste estudo, é mostrada a geração de uma pele tridimensional de espessura total equivalente ao estudo da cicatrização de feridas. A parte dérmica dos modelos é composta por fibroblastos dérmicos humanos embebidos em um hidrogel de colágeno tipo I de cauda de rato. Após a inoculação com queratinócitos epidérmicos humanos e consequente cultura na interface ar-líquido, uma epiderme multicamadas é formada sobre os modelos. Para estudar o processo de cicatrização de feridas, desenvolvemos adicionalmente um dispositivo automatizado de feridas, que gera feridas padronizadas em uma atmosfera estéril.

O HDF e hek isolado diferem tanto na morfologia e na expressão de marcadores típicos. O HDF mostraram morfologia típica forma de fuso, ao passo que a morfologia de hek pode ser descrito por uma morfologia de paralelepípedos. As células foram caracterizadas por coloração imuno-histoquímica (Figura 1) antes de utilizá-los para FTSE. O HDF são positivas para a vimentina (Figura 1A), um marcador para os fibroblastos. Primário HEK altamente expressar proteína diferenciação precoce citoquerat...

O objetivo deste protocolo é construir um equivalente tridimensional de pele de espessura total, que se assemelhe à pele natural. Com um dispositivo de ferimento automatizado especificamente construído, feridas precisas e reprodutíveis podem ser geradas sob manutenção de esterilidade.

Geração de espessura completa tridimensional Pele Equivalente e Automated Ferimento

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models ...

O objetivo geral deste procedimento é construir um equivalente dérmico tridimensional com espessura total, que se assemelhe à pele natural, e gerar feridas precisas e reprodutíveis em condições estéreis, utilizando um dispositivo automatizado de indução de feridas. Isso é realizado primeiramente incorporando fibroblastos dérmicos humanos primários em um hidrogel de colágeno tipo I. Em seguida, queratinócitos epidérmicos humanos primários são semeados sobre a superfície do hidrogel revestido com fibronectina.Em seguida, o modelo é cultivado em condições submersas e, posteriormente, sob uma interface ar-líquido, formando um equivalente tridimensional de pele de espessura total, composto por um componente dérmico e uma epiderme multilamelar. Por fim, uma ferida padronizada é gerada em ambiente estéril. Em última análise, a coloração imuno-histoquímica e a microscopia são utilizadas para avaliar a estrutura histológica do equivalente de pele de espessura total lesionado.A principal vantagem dessa técnica em relação a métodos existentes, como modelos animais, por exemplo, é que o equivalente de pele de espessura total é composto por células humanas primárias. Assim, juntamente com o dispositivo automatizado de indução de ferimento, podemos gerar ferimentos padronizados. Dessa forma, o dispositivo automatizado de indução de ferimento pode fornecer informações sobre os processos de cicatrização cutânea em um ambiente humanizado. Ele também pode ser aplicado a nossos sistemas, como engenharia de tecidos ósseos.Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais sobre a cicatrização de feridas, como os processos biológicos, os mecanismos subjacentes à reparação da pele e a comunicação celular entre os componentes epidérmico e dérmico. Para iniciar, dissolva o colágeno com ácido acético 0,1% até uma concentração final de seis miligramas por mililitro. Prepare a solução de neutralização do gel misturando 232,5 mililitros de DMM 2X, 7,5 mililitros de SFC, 7,5 mililitros de HEPES 3 molar e 2,5 mililitros de insulina a 5 miligramas por mililitro.Coloque inserções de sulfato de condroitina nos poços de uma placa de 24 poços para destacar fibroblastos dérmicos humanos ou HDFs e centrifugue as suspensões celulares por cinco minutos a 270 ×g. Conte as células e centrifugue um equivalente de 1.200.000 HDF por cinco minutos a 270 ×g. Remova o sobrenadante e use quatro mililitros de solução de neutralização de gel fria para ressuspender cuidadosamente os HDF, evitando a formação de bolhas de ar.Em seguida, re-suspenda a solução com oito mililitros de solução de colágeno. A seguir, utilize uma pipeta multicanal e adicione 500 microlitros da mistura de células com colágeno a cada inserto. Incube os géis na placa de 24 poços por 20 minutos a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono para permitir a solidificação dos géis.Em seguida, utilize dois mililitros de DMM mais 10% de FCS por poço. Para submergir os géis, incube os géis por 24 horas. Utilize água ultrapura para dissolver a proteína fibronectina humana até uma concentração final de 50 microgramas por mililitro.Após incubar os géis do equivalente dérmico por 24 horas, remova o meio. Utilize 25 microlitros de solução de fibronectina para cobrir cada equivalente dérmico e incube os géis por 30 minutos. Enquanto isso, re-suspenda os queratinócitos epidérmicos humanos ou HKS com KGM-2 mais 5% FCS até uma concentração final de 1 milhão de células por litro, e semeie 100.000 células no topo de cada gel.Em seguida, incubar os géis por 45 minutos para permitir que as células adiram, usando KGM Two Ready Plus com 5% FCS imerso nas células e continuar a incubação. Após a incubação de dois a três dias, substituir o meio por 2% FCS, seguido pela substituição do meio sem FCS, dois a três dias depois. No dia sete, remover completamente o meio.Use pinças estéreis para colocar cada inserto em um poço de uma placa de seis poços. Em seguida, adicione 1,5 mililitro de meio de elevação aérea por poço. Tendo o cuidado de não molhar a superfície do FTSC.Troque o meio a cada dois ou três dias durante mais 14 dias. Prepare o dispositivo automatizado de lesão utilizando 70% de etanol e luz ultravioleta para desinfetar a área de trabalho com pinças estéreis. Coloque os equivalentes dérmicos nas áreas designadas da placa portadora de amostras para autoclave.Coloque uma placa porta-amostras no soquete abaixo da cabeça de perfuração. Use o software de controle para definir os parâmetros de lesão da seguinte forma: velocidade de rotação 15.000 RPM, penetração de 1,5 milímetros.Propulsão de 100 hertz. Transfira os parâmetros de lesão para o dispositivo automatizado de indução de lesão. Inicie o procedimento de lesão quando concluído.Remova a placa de transporte da amostra do encaixe e use pinça estéril para transferir o FTSE ferido de volta para o inserto utilizado para o cultivo. Incube o FTSE ferido até a avaliação experimental. Utilize os modelos para sua análise histológica a qualquer momento.Os HDF e HKS isolados foram caracterizados por meio de coloração imunohistoquímica antes de serem utilizados na EFTS. Os HDF são positivos para mentonina, um marcador de fibroblastos; os HKS expressam fortemente a proteína de diferenciação inicial CITOQUERATINA 14, mas quase não expressam a proteína de diferenciação tardia de queratinócitos CITOQUERATINA 10. As EFTS foram cultivadas por sete dias em condições de meio submerso, seguidos por 14 dias na interface ar-líquido.Durante esse processo, o FTSC contrai significativamente em 21 dias. As HEK estão se proliferando mediante a alteração do nível do meio de forma que a superfície dos modelos fique exposta ao ar. E, pelo aumento da concentração de cálcio, as HKS são estimuladas a se diferenciar em uma epiderme multicelular composta por várias camadas vitais de queratinócitos.Em diferentes estágios de diferenciação de D e átrio da córnea. Ao comparar a coloração de hematoxilina e eosina do FTSE com a da pele humana nativa, torna-se evidente que o FTSE mimetiza a arquitetura histológica da pele. Os HDF no hidrogel de colágeno tipo um podem ser corados com anticorpos primários contra vimentina.Além disso, os queratinócitos formam uma camada epidérmica composta por células positivas para citoceratina 14 e o marcador de diferenciação tardia. A CITOCERATINA 10 é expressa nas camadas suprabasais. Além disso, o estrato córneo é positivo para RIN após o seu desenvolvimento.Essa técnica abriu caminho para pesquisadores na área de dermatologia explorarem a cicatrização cutânea e uma configuração in vitro padronizada que imita de perto a pele humana.

generation-three-dimensional-full-thickness-skin-equivalent-automated

Research

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