Protocolo para a formação de biofilme Streamer em um dispositivo micro com micro-pilares
20 de agosto de 2014
Protocolos para o estudo da formação de biofilme em um dispositivo microfluídico que imita meios porosos são discutidos. O dispositivo microfluídico consiste em uma matriz de micro-pilares e a formação de biofilme por Pseudomonas fluorescens neste dispositivo é investigada.
O objetivo geral deste procedimento é demonstrar a formação de serpentinas bacterianas em um dispositivo microfluídico com micro pilares. Isso é feito fabricando primeiro o chip microfluídico. A segunda etapa do procedimento é cultivar as bactérias testadas, neste caso a fluorescência de pseudomonas.
As etapas finais são montar a configuração experimental, injetar as bactérias no chip microfluídico e coletar dados. Em última análise, os resultados podem mostrar a evolução temporal das flâmulas por meio de imagens de microscopia de fluorescência da gripe. A demonstração visual desse metal é crítica, pois as diferentes etapas são difíceis de aprender.
Devido à natureza interdisciplinar do experimento, este procedimento requer wafers de silício com gravação de íons reativos profundos. O fotorresistente nas bolachas deve ser lavado. Comece com silencioso o molde mestre.
Adicione duas ou três gotas de tricloroetileno a um frasco e coloque-o em um dessecador junto com o desenho do molde para cima ao lado dele. Em duas ou três horas, o molde será siloizado. Durante a siloização, prepare a base de silicone do charuto 1 8 4 da mistura PDMS com um agente de cura na proporção de 10 para um.
Em seguida, desgaseifique o PDMS sob vácuo por cerca de duas horas. Agora transfira um wafer siloizado para um suporte e despeje o PDMS sobre ele, garantindo que nenhuma bolha seja formada. Deixe o PDMS curar no wafer a 80 graus Celsius por duas horas.
Isso fabrica o selo A-P-D-M-S a partir do molde de silicone dimensionado. Quando a cura estiver concluída, retire o carimbo PDMS com a ajuda de um cortador. Em seguida, corte o carimbo em um chip microfluídico usando o cortador.
Agora, usando um núcleo de corte, faça furos nas posições de entrada e saída no carimbo. O próximo passo é colar o carimbo ao vidro. Exponha uma lamínula de 24 milímetros e o carimbo PDMS ao plasma de oxigênio por 30 segundos.
Após a exposição, prenda a lamínula na parte inferior do carimbo PDMS e um vínculo se formará. Coloque o conjunto em um forno a 70 graus Celsius por 10 minutos. Para completar o processo para este protocolo, prepare placas LB feitas com água ultrapura e dosadas com 50 microgramas por mililitro de tetraciclina adicionada a 50 a 55 graus Celsius.
Ao despejar os pratos, as bolhas podem ser estouradas queimando-as. As placas resfriadas e solidificadas devem ser datadas e armazenadas a quatro graus Celsius em um filme de papel alumínio. Também preparamos caldo LB feito com água ultra pura e dosado com 50 microgramas por mililitro de tetraciclina.
Guarde o caldo a quatro graus Celsius e também embrulhado em papel alumínio. Agora, os estoques de cultura de fluorescência de pseudomonas armazenados a 80 graus Celsius negativos nas placas LB, listram as placas em zigue-zague e as incubam durante a noite a 30 graus Celsius no escuro. No dia seguinte, pegue uma colônia da placa e inocule um frasco de S one recém-preparado incubado durante a noite a 30 graus Celsius com 150 RPM de agitação.
Meça a densidade óptica da cultura após a incubação. Em seguida, faça a solução S dois. Adicione cinco mililitros de LB a um tubo de plástico e, em seguida, adicione o suficiente da solução S um para um OD a 600 nanômetros de 0,1, o que é típico para um experimento de biofilme.
Primeiro, configure o experimento usando uma pinça Conecte tubos de plástico com um diâmetro interno de 0,20 polegadas às entradas e saídas do chip preparado. Os tubos devem ser flexíveis e suficientemente longos. Aqui eles têm cerca de 20 polegadas.
Em seguida, encha as seringas com a solução S dois. Prenda agulhas cegas de calibre 30 e remova as bolhas. Evitar que bolhas de ar entrem no canal é uma etapa crítica, especialmente devido à duração da linha do experimento.
As bolhas podem danificar as estruturas moles formadas pelas bactérias. Em seguida, conecte as seringas aos tubos de entrada e conecte os tubos de saída aos recipientes de resíduos. Agora posicione as seringas em uma bomba de seringa e ajuste a bomba para a vazão desejada, como oito microlitros por hora em um microscópio equipado com uma câmara celular ajustada para a temperatura de incubação.
Use uma objetiva de 40 x talvez para visualizar o chip microfluídico. Agora, ligue a bomba. Quando as bactérias são introduzidas na câmara, a formação de biofilme também é iniciada.
O biofilme se formará e amadurecerá por horas, dias, tirará imagens para acompanhar seu progresso. Usando o chip microfluídico fabricado pela SEMA, foi obtida uma imagem. A entrada em forma de garfo é criada para equalizar a carga de pressão em todo o dispositivo.
Também pode ser visto que as paredes dos pilares são quase verticais. Para examinar a formação de biofilme, fluorescência foi injetada no dispositivo a oito microlitros por hora. A formação do biofilme começou após alguns minutos de infusão da cultura bacteriana diluída.
No entanto, após algumas horas, observou-se o aparecimento de estruturas filamentosas que se estendiam entre os micro pilares perto do meio. A elipse tracejada demarca uma serpentina formadora formada amarrada em uma extremidade à região do pólo de um dos micro pilares. Flâmulas também foram vistas ao longo da diagonal entre dois micro pilares.
A espessura das flâmulas aumentou com o tempo devido à divisão celular, bem como à incorporação de bactérias planctônicas. Eles também proliferaram com streamers de tempo ocupando um grande volume no dispositivo, levando à formação de biofilme maduro, que poderia entupir o dispositivo. Uma simulação mecânica do fluxo através do dispositivo mostra que as serpentinas inicialmente se orientam ao longo de linhas de fluxo de fluido.
Além disso, na fase inicial, as serpentinas se originam em locais de maior velocidade de fluxo. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como as serpentinas de biofilme se formam e evoluem em um ambiente microfluídico. Não se esqueça de que trabalhar com bactérias pode ser extremamente perigoso, e precauções como protocolos de biossegurança devem sempre ser tomadas durante a realização deste procedimento.
Veja a transcrição completa e aceda a milhares de vídeos científicos
Visão Geral
Este artigo discute protocolos para o estudo da formação de biofilmes utilizando um dispositivo microfluídico projetado para imitar meios porosos. O foco está na investigação da formação de biofilmes por Pseudomonas fluorescens neste dispositivo.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Microfluídica
- Formação de biofilme
- Comportamento bacteriano
Antecedentes
- Dispositivos microfluídicos podem replicar ambientes complexos.
- Pseudomonas fluorescens é um organismo modelo para estudos de biofilmes.
- Compreender a formação de biofilmes é crucial para diversas aplicações.
- Visualizar os filetes bacterianos aprimora a compreensão da dinâmica dos biofilmes.
Objetivo do Estudo
- Demonstrar a formação de filamentos bacterianos em uma configuração microfluídica.
- Investigar o comportamento de Pseudomonas fluorescens em um ambiente controlado.
- Fornecer uma representação visual do desenvolvimento de biofilme.
Métodos Utilizados
- Fabricação de um chip microfluídico com microcolunas.
- Cultivo de Pseudomonas fluorescens para experimentação.
- Montagem da configuração experimental para observação de biofilmes.
- Injeção de bactérias no dispositivo microfluídico e coleta de dados.
Resultados Principais
- A evolução temporal dos filetes bacterianos foi capturada com sucesso.
- A microscopia de fluorescência forneceu imagens nítidas da formação de biofilmes.
- Os resultados demonstraram a dinâmica do desenvolvimento de biofilmes.
- Os recursos visuais aprimoraram a compreensão do processo experimental.
Conclusões
- O dispositivo microfluídico imita efetivamente meios porosos para estudos de biofilmes.
- Pseudomonas fluorescens serve como um modelo valioso para pesquisa de biofilmes.
- As demonstrações visuais são essenciais para compreender procedimentos complexos.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este protocolo permite o estudo de filamentos de biofilme bacteriano em um ambiente microfluídico que simula meios porosos, oferecendo um sistema controlado para investigar a dinâmica de adesão e colonização microbiana relevante para incrustações industriais e processos ambientais. Ao visualizar a formação de biofilmes filamentosos sob fluxo, os pesquisadores podem avaliar mecanismos de desenvolvimento inicial de biofilmes que orientam estratégias anti-incrustantes e a otimização de bioprocessos. A abordagem permite a redução mecanicista de riscos na validação de alvos para intervenções antimicrobianas ou disruptoras de biofilmes, fornecendo observações quantitativas e reprodutíveis sobre o início e a maturação dos filamentos.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêuticos
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite investigar a adesão bacteriana e a produção de matriz extracelular sob condições controladas de fluxo para validar alvos envolvidos na iniciação do biofilme.
- Valor Operacional: Fornece uma plataforma microfluídica reprodutível para triagem de moduladores genéticos ou químicos da formação de filamentos em Pseudomonas fluorescens.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Gera leituras quantitativas e com resolução temporal por microscopia de fluorescência da espessura e cobertura do biofilme para análise de resposta à dose.
- Valor Operacional: Padroniza as condições de formação do biofilme por meio do controle preciso da taxa de fluxo e da geometria do chip, melhorando a reprodutibilidade do ensaio em campanhas de triagem.
Pesquisa Translacional e Pré-Clinica
- Valor Científico: Apoia a avaliação de compostos disruptores de biofilmes em um sistema relevante para doenças que imita a colonização microbiana em nichos industriais ou ambientais.
- Valor Operacional: Permite continuidade pré-clínica ao vincular observações em microfluidica a resultados macroscópicos de biofilmes, como entupimento de dispositivos e obstrução de fluxo.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se insere no continuum de descoberta, desde a testagem de hipóteses sobre alvos até a otimização de compostos líderes, especialmente para programas voltados a agentes anti-infecciosos ou antiincrustantes, nos quais a formação de biofilme é uma desvantagem importante.
- Biologia da Descoberta: Facilita a redução de riscos mecanicistas ao visualizar como perturbações genéticas ou químicas afetam a iniciação e o alongamento de estruturas filamentares entre microcolunas.
- Triagem: Fornece saídas padronizadas e quantitativas de imagem que permitem comparar a formação de biofilmes entre diferentes condições experimentais.
- Análises: Permite medir a espessura, orientação e cobertura superficial das estruturas filamentares ao longo do tempo para avaliar a eficácia de compostos.
- Pesquisa Translacional: Conecta observações em microfluídica com relevância pré-clínica ao modelar o desenvolvimento de biofilmes em ambientes estruturados análogos a superfícies médicas ou industriais.
- Reutilização Corporativa: Estabelece uma plataforma microfluídica modular adaptável a outras cepas bacterianas ou condições de fluxo para ampla aplicação em P&D.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Reduz a ambiguidade mecanicista na formação de biofilmes ao isolar o efeito do fluxo e da topologia da superfície no desenvolvimento de estruturas filamentares.
- Valor Operacional: Garante padronização e escalabilidade por meio de protocolos de fabricação por litografia suave e inoculação bacteriana controlada.
- Valor Estratégico: Aprimora decisões de prosseguir ou interromper programas antimicrobianos ao fornecer confiança preditiva precoce na eficácia da inibição de biofilmes.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco de candidatos com base em sua capacidade de prevenir a maturação de biofilmes mediada por estruturas filamentares e a obstrução do sistema.
Considerações sobre a Implementação
- Exige experiência em fabricação de microfluídica, manipulação estéril de bactérias e microscopia de fluorescência.
- Depende do acesso a equipamentos de sala limpa para moldagem de PDMS e ligação por plasma de oxigênio.
- Necessita padronização de vazões, inóculo bacteriano e tempo de incubação entre diferentes usuários e locais.
- A adaptação a outras espécies bacterianas pode exigir otimização das condições de cultivo e compatibilidade com a superfície.
- As limitações práticas incluem o entupimento potencial dos canais em estágios avançados de biofilme, exigindo definição de tempo final para aquisição de imagens.
