Protocolo para a formação de biofilme Streamer em um dispositivo micro com micro-pilares

Protocolos para o estudo da formação de biofilme em um dispositivo microfluídico que imita meios porosos são discutidos. O dispositivo microfluídico consiste em uma matriz de micro-pilares e a formação de biofilme por Pseudomonas fluorescens neste dispositivo é investigada.

O objetivo geral deste procedimento é demonstrar a formação de serpentinas bacterianas em um dispositivo microfluídico com micro pilares. Isso é feito fabricando primeiro o chip microfluídico. A segunda etapa do procedimento é cultivar as bactérias testadas, neste caso a fluorescência de pseudomonas.

As etapas finais são montar a configuração experimental, injetar as bactérias no chip microfluídico e coletar dados. Em última análise, os resultados podem mostrar a evolução temporal das flâmulas por meio de imagens de microscopia de fluorescência da gripe. A demonstração visual desse metal é crítica, pois as diferentes etapas são difíceis de aprender.

Devido à natureza interdisciplinar do experimento, este procedimento requer wafers de silício com gravação de íons reativos profundos. O fotorresistente nas bolachas deve ser lavado. Comece com silencioso o molde mestre.

Adicione duas ou três gotas de tricloroetileno a um frasco e coloque-o em um dessecador junto com o desenho do molde para cima ao lado dele. Em duas ou três horas, o molde será siloizado. Durante a siloização, prepare a base de silicone do charuto 1 8 4 da mistura PDMS com um agente de cura na proporção de 10 para um.

Em seguida, desgaseifique o PDMS sob vácuo por cerca de duas horas. Agora transfira um wafer siloizado para um suporte e despeje o PDMS sobre ele, garantindo que nenhuma bolha seja formada. Deixe o PDMS curar no wafer a 80 graus Celsius por duas horas.

Isso fabrica o selo A-P-D-M-S a partir do molde de silicone dimensionado. Quando a cura estiver concluída, retire o carimbo PDMS com a ajuda de um cortador. Em seguida, corte o carimbo em um chip microfluídico usando o cortador.

Agora, usando um núcleo de corte, faça furos nas posições de entrada e saída no carimbo. O próximo passo é colar o carimbo ao vidro. Exponha uma lamínula de 24 milímetros e o carimbo PDMS ao plasma de oxigênio por 30 segundos.

Após a exposição, prenda a lamínula na parte inferior do carimbo PDMS e um vínculo se formará. Coloque o conjunto em um forno a 70 graus Celsius por 10 minutos. Para completar o processo para este protocolo, prepare placas LB feitas com água ultrapura e dosadas com 50 microgramas por mililitro de tetraciclina adicionada a 50 a 55 graus Celsius.

Ao despejar os pratos, as bolhas podem ser estouradas queimando-as. As placas resfriadas e solidificadas devem ser datadas e armazenadas a quatro graus Celsius em um filme de papel alumínio. Também preparamos caldo LB feito com água ultra pura e dosado com 50 microgramas por mililitro de tetraciclina.

Guarde o caldo a quatro graus Celsius e também embrulhado em papel alumínio. Agora, os estoques de cultura de fluorescência de pseudomonas armazenados a 80 graus Celsius negativos nas placas LB, listram as placas em zigue-zague e as incubam durante a noite a 30 graus Celsius no escuro. No dia seguinte, pegue uma colônia da placa e inocule um frasco de S one recém-preparado incubado durante a noite a 30 graus Celsius com 150 RPM de agitação.

Meça a densidade óptica da cultura após a incubação. Em seguida, faça a solução S dois. Adicione cinco mililitros de LB a um tubo de plástico e, em seguida, adicione o suficiente da solução S um para um OD a 600 nanômetros de 0,1, o que é típico para um experimento de biofilme.

Primeiro, configure o experimento usando uma pinça Conecte tubos de plástico com um diâmetro interno de 0,20 polegadas às entradas e saídas do chip preparado. Os tubos devem ser flexíveis e suficientemente longos. Aqui eles têm cerca de 20 polegadas.

Em seguida, encha as seringas com a solução S dois. Prenda agulhas cegas de calibre 30 e remova as bolhas. Evitar que bolhas de ar entrem no canal é uma etapa crítica, especialmente devido à duração da linha do experimento.

As bolhas podem danificar as estruturas moles formadas pelas bactérias. Em seguida, conecte as seringas aos tubos de entrada e conecte os tubos de saída aos recipientes de resíduos. Agora posicione as seringas em uma bomba de seringa e ajuste a bomba para a vazão desejada, como oito microlitros por hora em um microscópio equipado com uma câmara celular ajustada para a temperatura de incubação.

Use uma objetiva de 40 x talvez para visualizar o chip microfluídico. Agora, ligue a bomba. Quando as bactérias são introduzidas na câmara, a formação de biofilme também é iniciada.

O biofilme se formará e amadurecerá por horas, dias, tirará imagens para acompanhar seu progresso. Usando o chip microfluídico fabricado pela SEMA, foi obtida uma imagem. A entrada em forma de garfo é criada para equalizar a carga de pressão em todo o dispositivo.

Também pode ser visto que as paredes dos pilares são quase verticais. Para examinar a formação de biofilme, fluorescência foi injetada no dispositivo a oito microlitros por hora. A formação do biofilme começou após alguns minutos de infusão da cultura bacteriana diluída.

No entanto, após algumas horas, observou-se o aparecimento de estruturas filamentosas que se estendiam entre os micro pilares perto do meio. A elipse tracejada demarca uma serpentina formadora formada amarrada em uma extremidade à região do pólo de um dos micro pilares. Flâmulas também foram vistas ao longo da diagonal entre dois micro pilares.

A espessura das flâmulas aumentou com o tempo devido à divisão celular, bem como à incorporação de bactérias planctônicas. Eles também proliferaram com streamers de tempo ocupando um grande volume no dispositivo, levando à formação de biofilme maduro, que poderia entupir o dispositivo. Uma simulação mecânica do fluxo através do dispositivo mostra que as serpentinas inicialmente se orientam ao longo de linhas de fluxo de fluido.

Além disso, na fase inicial, as serpentinas se originam em locais de maior velocidade de fluxo. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como as serpentinas de biofilme se formam e evoluem em um ambiente microfluídico. Não se esqueça de que trabalhar com bactérias pode ser extremamente perigoso, e precauções como protocolos de biossegurança devem sempre ser tomadas durante a realização deste procedimento.