Name: Protocolo para a formação de biofilme Streamer em um dispositivo micro com micro-pilares (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 19 s
Description: Aprenda a formar biofilmes streamer em dispositivo microfluídico com micropilares usando Pseudomonas fluorescens. Este protocolo demonstra a evolução temporal dos streamers por microscopia de fluorescência.

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Os autores gostariam de agradecer ao professor Howard Ceri, do Departamento de Ciências Biológicas da Universidade de Calgary, por fornecer cepas bacterianas. A. Kumar reconhece o apoio do NSERC. T. Thundat reconhece o apoio financeiro do programa Canada Excellence Research Chair (CERC). Os autores também gostariam de agradecer a ajuda da Sra. Zahra Nikakhtari pela ajuda com a videografia.

Executar os protocolos experimentais aqui na ordem descrita abaixo. Protocolos de microfabricação para criar a plataforma de microfluidos são discutidos no Passo 1 Passo 2 descreve o protocolo de cultura de bactérias (Figura 2), e Passo 3 refere-se a montagem da instalação experimental (Figura 3). Finalmente, o passo real experimental é descrito no Passo 4. 1 Chip Fabricação Procedimento NOTA: Proper procedimentos de segurança devem ser seguidas para os processos descritos abaixo. Consulte o oficial de segurança institucional para mais detalhes. <ol><li> Projete a máscara com um software apropriado (por exemplo, L-Edit). O desenho é constituído por um canal principal micro-canal de largura de 625 m. A região central do canal contém uma matriz de micro-postos 50 um de diâmetro, espaçados de 25 um (ver a ficheiros suplementar). </li><li> Imprima este projeto em vidro (5 &quot;x 5&quot; vidro soda cal), Que tem uma espessura de 0,09 &quot;e é revestido por cerca de 70 nm de espessura da camada de crómio (Cr), usando mascaramento de modo a preparar uma máscara de foto. Utilização AZ400K programador durante 1 min. Seguida, gravar a camada de Cr Cr usando cáustico durante cerca de 1 min a utilização de acetona para retirar a resistir e limpá-lo com uma solução fria de piranha. (H 2 SO 4 e H 2 O 2 em uma proporção de 3: 1). </li><li> Fotolitografia <ol><li> Limpe uma bolacha 4 &quot;de silício padrão quimicamente com solução piranha para 20 min. </li><li> Lavar o wafer com água DI e secá-la. </li><li> Aquece-se a bolacha em uma placa quente (200 ° C durante 15 min). </li><li> Cubra o wafer de silício com photoresist. Aqui, o revestimento fotoprotector positivo AZ4620 foi revestido por centrifugação sobre uma bolacha de silício, a 2000 rpm durante 25 segundos para se obter uma camada de espessura de 12,5 | iM. </li><li> Remover todo o solvente por cozimento da bolacha mole em uma placa quente, flutuando a bolacha durante 90 segundos em fluxo de azoto a 100 ° C. Em seguida, mantê-lo no vácuo a tele mesma temperatura durante 60 seg. </li><li> Coloque a bolacha em uma caixa escura por 24 horas para a desidratação. </li><li> Expor a pastilha à luz ultravioleta, a fim de transferir o padrão concebido para o foto-resistente. </li><li> Mergulha-se o wafer foto-resistente na solução de revelação (AZ400K) para 240 seg. Em seguida, lavar a bolacha com álcool isopropílico e secá-lo, colocando em uma corrente de azoto gasoso. </li></ol></li><li> ICP-DRIE (plasma indutivamente acoplado - Deep Reactive Ion Etching) Processo <ol><li> Aplicar DRIE gravura. Escolha a profundidade etch adequado de acordo com a profundidade final necessária para o dispositivo (50 mm nesta investigação). Photoresist actua como uma camada de máscara, durante este processo. </li><li> Remover o fotorresistente remanescente com acetona e limpar a bolacha. </li></ol></li><li> PDMS (polidimetilsiloxano) Fundição <ol><li> Use triclorometilsilano (EMT) para silanização o molde mestre de silício. Despeje 2 ou 3 gotas de triclorometilsilano em um frasco e colocá-lo num exsicador junto aomolde mestre de silício. Permitir 2-3 horas para o processo de silanização para ser concluído. </li><li> Num recipiente separado, misturar a base de silicone Sylgard 184 com o agente de cura pela relação de peso de 10: 1 para preparar PDMS. Desgasificar o PDMS, submetendo-o a condições de vácuo (cerca de 2 h). </li><li> Coloque o molde mestre de silício em um suporte. Em seguida, despejar o PDMS sobre o molde mestre de silício para formar o selo de PDMS. Certifique-se de que não se formam bolhas de PDMS durante este processo. </li><li> Curar o PDMS durante 2 horas a 80 ° C. </li><li> Retire o selo PDMS do molde mestre. Em seguida, corte os PDMS carimbar em microchips separados. Finalmente, a utilização de um núcleo de corte de furos para a entrada (s) e saída (s). </li></ol></li><li> Colagem de PDMS para Vidro <ol><li> Expor a lamínula e PDMS selo de plasma de oxigênio por 30 seg. Vínculo PDMS selo à lamela. </li><li> Para obter uma vedação adequada entre o carimbo de PDMS e o deslizamento da tampa, o dispositivo de recozimento, colocando-o num forno a 70 ° C durante 10 min. </li&gt; </ol></li></ol> 2 Cultura bacteriana NOTA: protocolos adequados de biossegurança devem ser seguidas para os passos 2-4. Consulte o oficial de segurança institucional para mais detalhes. <ol><li> Prepare placas LB Agar <ol><li> Adicionar 20 g de meio de Luria-Bertani (LB) agar (Miller) pós e 500 ml de água ultra-pura a um balão de 1 L. Agita-se a dissolver o pó. </li><li> Esterilizar por autoclave a 15 psi, a 121 ° C durante 15 min. </li><li> Permitir que o balão arrefeça a 50-55 ° C num banco ou num banho de água na capa de biossegurança. </li><li> Adicionar o antibiótico tetraciclina para se conseguir uma concentração final de 50 ug / ml. Misture bem por agitação. </li><li> Despeje a mistura em placas. Encha cada prato até meia - 2/3 cheio. </li><li> Chama bolhas de ar brevemente para estourá-los se formar. Bolhas de ar solidificados são difíceis de espalhar a cultura bacteriana over. </li><li> Permitir que as placas de arrefecer à temperatura ambiente durante a noite. </li><li> Quando eles são legais,colocar placas de volta para a sua manga, selar o saco, etiqueta (antibiótico e data), e armazenar a 4 ° C. NOTA: Cubra o estoque de placas com papel de alumínio, como a luz desativa muitos antibióticos. </li></ol></li><li> Caldo LB Preparação <ol><li> Adicionar 20 g de meio de Luria-Bertani (LB) broth (Miller) pós e 1 L de água ultrapura com um balão. Agita-se a dissolver o pó. </li><li> Esterilizar por autoclave a 15 psi, a 121 ° C durante 15 min. </li><li> Permitir balão arrefecer até 50-55 ° C num banco ou num banho de água na capa de biossegurança. </li><li> Adicionar o antibiótico tetraciclina para se conseguir uma concentração final de 50 ug / ml. Misture bem por agitação. </li><li> Quando estiver frio, coloque a garrafa rotulada a 4 ° C. NOTA: Cubra a garrafa com papel de alumínio, como a luz desativa muitos antibióticos. </li></ol></li><li> Cultura das bactérias em uma placa de LB Agar (Este protocolo utiliza Pseudomonas fluorescens) <ol><li> Pegue o estoque de bactérias do freezer (-80 °; C) e coloque-o no gelo. </li><li> Coloque o ° C -80 estoque bacteriana e uma placa de ágar LB dentro de uma capa de biossegurança. </li><li> Streak a estirpe bacteriana em uma placa de ágar LB em ziguezague. Cubra a placa de ágar e incubar-lo a 30 ° C durante a noite. Finalmente, a placa de armazenar no frigorífico a 4 ° C. </li></ol></li><li> Preparar a solução bacteriana (S1) <ol><li> Despeje 50 ml de caldo LB mídia para um frasco autoclavado. Realize esta operação dentro de uma capa de biossegurança. </li><li> Transferir uma única colónia bacteriana da placa de agar LB para o balão. Esta operação deverá ser realizada dentro de um capuz de biossegurança. </li><li> Colocar o balão numa incubadora com agitação a 30 ° C e 150 rpm durante um tempo suficiente (4 h). </li></ol></li><li> Preparar a solução bacteriana diluída (S2) <ol><li> Despeje 5 ml de caldo de meio LB num tubo de plástico esterilizado. </li><li> Diluir S1 por mistura com meio LB. Então, Vórtice a solução. Dilui-se a solução atingir a desejada ópticaai densidade (OD medido a 600 nm = 0,1). NOTA: experimentos biofilme normalmente empregam valores de DO nesta vizinhança. </li></ol></li></ol> 3 Prepare o Setup Experimental <ol><li> Usando pinças ligar tubos de plástico flexíveis (0.20 &quot;ID) na entrada (s) e saída (s) de que o microchip. As entradas e saídas foram previamente perfurados na porção de PDMS do microchip (passo 1.5.5). Nesta investigação , o circuito integrado é composto de duas entradas e uma saída. </li><li> Encher a seringa (s) com a solução bacteriana (solução S2) e remover todas as bolhas na seringa (s). </li><li> Conecte a ponta da seringa (s) (30 G 0.5 &quot;agulha romba) no tubo (s) de entrada. Então, conecte tubo de saída (s) para contentor de resíduos. </li></ol> 4 Execute o Experimento <ol><li> Ligar a seringa (s) para a ponta (s) seringa. </li><li> Local e correção seringa (s) para a bomba de seringa. Em seguida, coloque o microchip sob um microscópio óptico com lentes objetivas de desired ampliação (por exemplo, 40X). Cobrir o microchip com um aparelho de câmara de células vivas para manter um ambiente de temperatura constante para o crescimento bacteriano (30 ° C por P. fluorescens). </li><li> A bomba para o nível de fluxo desejado (por exemplo 10 l / h) e iniciar o bombeamento de fluidos. </li><li> Uma vez que as bactérias são introduzidas na câmara, a formação de biofilme é também iniciada. A formação de biofilme e de maturação tipicamente ocorrem ao longo de um período de várias horas ou mesmo dias. Observar e tirar fotos de crescimento do biofilme através do microscópio. </li></ol>

<ol><li>Valiei, A., Kumar, A., Mukherjee, P. P., Liu, Y., Thundat, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+web+of+streamers%3A+biofilm+formation+in+a+porous+microfluidic+device%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">A web of streamers: biofilm formation in a porous microfluidic device.</a> Lab Chip. 12, 5133-5137 (2012).</li>
<li>Costerton, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+Biofilms%3A+A+Common+Cause+of+Persistent+Infections%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Bacterial Biofilms: A Common Cause of Persistent Infections.</a> Science. 284, 1318-1322 (1999).</li>
<li>Flemming, H. C., Wingender, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biofilm+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The biofilm matrix.</a> Nat Rev Microbiol. 8, 623-633 (2010).</li>
<li>Wong, G. C. L., O’Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((All+together+now%3A+Integrating+biofilm+research+across+disciplines%5BTitle%5D)+AND+%22MRS+Bulletin%22%5BJournal%5D)">All together now: Integrating biofilm research across disciplines.</a> MRS Bulletin. 36, 339-342 (2011).</li>
<li>Yazdi, S., Ardekani, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+aggregation+and+biofilm+formation+in+a+vortical+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Biomicrofluidics%22%5BJournal%5D)">Bacterial aggregation and biofilm formation in a vortical flow.</a> Biomicrofluidics. 6, 044114(2012).</li>
<li>Rusconi, R., Lecuyer, S., Guglielmini, L., Stone, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laminar+flow+around+corners+triggers+the+formation+of+biofilm+streamers%5BTitle%5D)+AND+%22J+R+Soc+Interface%22%5BJournal%5D)">Laminar flow around corners triggers the formation of biofilm streamers.</a> J R Soc Interface. 7, 1293-1299 (2010).</li>
<li>Drescher, K., Shen, Y., Bassler, B. L., Stone, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm+streamers+cause+catastrophic+disruption+of+flow+with+consequences+for+environmental+and+medical+systems%5BTitle%5D)+AND+%22P+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Biofilm streamers cause catastrophic disruption of flow with consequences for environmental and medical systems.</a> P Natl Acad Sci USA. 110, 4345-4350 (2013).</li>
<li>Marty, A., Roques, C., Causserand, C., Bacchin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+bacterial+streamers+during+filtration+in+microfluidic+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Biofouling%22%5BJournal%5D)">Formation of bacterial streamers during filtration in microfluidic systems.</a> Biofouling. 28, 551-562 (2012).</li>
<li>Taherzadeh, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computational+Study+of+the+Drag+and+Oscillatory+Movement+of+Biofilm+Streamers+in+Fast+Flows%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Computational Study of the Drag and Oscillatory Movement of Biofilm Streamers in Fast Flows.</a> Biotechnol Bioeng. 105, 600-610 (2010).</li>
<li>Vrouwenvelder, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+flow+regime+on+pressure+drop+increase+and+biomass+accumulation+and+morphology+in+membrane+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Res%22%5BJournal%5D)">Impact of flow regime on pressure drop increase and biomass accumulation and morphology in membrane systems.</a> Water Res. 44, 689-702 (2010).</li>
<li>Mitchell, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm+enhanced+geologic+sequestration+of+supercritical+CO2%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Greenhouse+Gas+Control%22%5BJournal%5D)">Biofilm enhanced geologic sequestration of supercritical CO2.</a> International Journal of Greenhouse Gas Control. 3, 90-99 (2009).</li>
<li>Soleimani, S., Van Geel, P. J., Isgor, O. B., Mostafa, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+of+biological+clogging+in+unsaturated+porous+media%5BTitle%5D)+AND+%22J+Contam+Hydrol%22%5BJournal%5D)">Modeling of biological clogging in unsaturated porous media.</a> J Contam Hydrol. 106, 39-50 (2009).</li>
<li>Kumar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscale+confinement+features+can+affect+biofilm+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Microfluid+Nanofluid%22%5BJournal%5D)">Microscale confinement features can affect biofilm formation.</a> Microfluid Nanofluid. 14, 895-902 (2013).</li>
<li>Neethirajan, S., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNeethirajan%2C+S+%22Encylopedia+of+Nanotechnology%22">Encylopedia of Nanotechnology</a>. Bhushan, B., et al. , Springer. (2012).</li>
<li>Barathi, S., Vasudevan, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utilization+of+petroleum+hydrocarbons+by+Pseudomonas+fluorescens+isolated+from+a+petroleum-contaminated+soil%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Int%22%5BJournal%5D)">Utilization of petroleum hydrocarbons by Pseudomonas fluorescens isolated from a petroleum-contaminated soil.</a> Environ Int. 26, 413-416 (2001).</li>
<li>Das, S., Kumar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+and+post-formation+dynamics+of+bacterial+biofilm+streamers+as+highly+viscous+liquid+jets%5BTitle%5D)+AND+%22arXiv+preprint+arXiv%3A1312.6056%22%5BJournal%5D)">Formation and post-formation dynamics of bacterial biofilm streamers as highly viscous liquid jets.</a> arXiv preprint arXiv:1312.6056. , (2013).</li>
<li>Shaw, T., Winston, M., Rupp, C. J., Klapper, I., Stoodley, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Commonality+of+elastic+relaxation+times+in+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Rev+Lett%22%5BJournal%5D)">Commonality of elastic relaxation times in biofilms.</a> Phys Rev Lett. 93, (2004).</li>
<li>Berejnov, V., Djilali, N., Sinton, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lab-on-chip+methodologies+for+the+study+of+transport+in+porous+media%3A+energy+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Lab-on-chip methodologies for the study of transport in porous media: energy applications.</a> Lab Chip. 8, 689-693 (2008).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Nós demonstramos um dispositivo micro simples que imita meios porosos para estudar o desenvolvimento de biofilme em habitats complexos. Existem vários passos críticos que ditam o resultado das experiências. Eles incluem a geometria do dispositivo. Embora a geometria pós podem variar, de poros adequado para o espaço de modo a formar serpentinas é necessário. Além disso, Valiei et al. 1 demonstraram que a formação da flâmula ocorre apenas em um determinado intervalo das taxas de fluxo. Em taxas de flux...

Recentemente, demonstramos dinâmica de formação do biofilme bacteriano em um dispositivo micro que imita meios porosos 1. Biofilme bacteriano são essencialmente colônias de bactérias da superfície agregados que são revestidas por substâncias poliméricas extracelulares (EPS) 2-4. Estas películas finas de bactérias podem formar em quase todos os nichos concebível que varia de superfícies lisas ao habitat muito mais complexa de meios porosos. Valiei et al. Uma usado um dispositivo de microfluidos com uma matriz de micro-pilares para simular uma estrutura de meio poroso estudado a formação de biofilme e neste dispositivo, em função da taxa de fluxo do fluido. Eles descobriram que em um determinado regime de fluxo, os biofilmes filamentosos, conhecidos como flâmulas começaram a surgir entre os diferentes pilares. Flâmulas pode ser amarrado a uma ou ambas as extremidades a superfícies sólidas, mas o resto da estrutura é suspenso num líquido. Formação Streamer normalmente começa depois de uma primeira camada de biofilme foi formado e seu formatoion pode ditar a evolução a longo prazo de biofilme em tais habitats complexos. Recentemente, vários pesquisadores têm investigado a dinâmica de formação de serpentina. Yazdi et al. 5 mostrou que as serpentinas podem formar-se os fluxos de turbilhão originários a partir de uma bolha de oscilação. Numa outra experiência, Rusconi et al. 6 investigaram o efeito de curvatura do canal e da geometria do canal sobre a formação de fitas. Eles descobriram que as fitas podem se formar em trechos curvos de microcanais e morfologia de galhardetes está relacionada à mobilidade. Pesquisas recentes têm demonstrado que os galhardetes pode ter amplas repercussões em vários cenários naturais e artificiais como eles podem atuar como precursores da formação de estruturas maduras nas interfaces porosas, levar à proliferação de biofilme rápida e catastrófica em um sistemas biomédicos, e também causar fluxo-substancial interações estrutura, etc 1,7-9. Flâmulas biofilme muitas vezes formam ihabitats n complexos, tais como meios porosos. Crescimento do biofilme Entendimento em ambiente de meios porosos é relevante a vários processos ambientais e industriais, tais como o tratamento biológico de águas residuais 10, mantendo a integridade de poços em situações como a captura de CO 2 11 e entupimento dos poros no solo 12. Observando a formação de biofilme em tais habitats complexos, muitas vezes pode ser um desafio, devido à opacidade de meios porosos. Em tais situações, as plataformas de mídia porosos microfluídicos com base pode ser extremamente vantajoso, pois permitem em tempo real e monitoramento in situ. Outra vantagem da microfluídica é a capacidade de construir vários reatores em uma única plataforma bio-microfluídicos e, simultaneamente, permitir o monitoramento e / ou incorporação de sensores online. A flexibilidade para implementar várias experiências de laboratório em um dispositivo e a capacidade de recolher dados pertinentes significativas para a análise estatística rigorosa é um adv importanteantage de sistemas microfluídicos 13,14. No contexto da discussão acima, dinâmica de formação flâmula compreensão em um ambiente de meio poroso seria benéfico para várias aplicações. No presente estudo, nós desenvolvemos o protocolo para investigar a formação de um dispositivo de serpentina de em que mimetiza meios porosos. Confecção da plataforma microfluídica, são descritos os passos necessários para a cultura de células e experimentação. Nas nossas experiências, a estirpe bacteriana tipo selvagem de Pseudomonas fluorescens foi empregue. P fluorescens, que se encontra naturalmente no solo, tem um papel fundamental na manutenção da ecologia do solo 15. A estirpe bacteriana utilizada foi geneticamente manipulada para expressar a proteína fluorescente verde (GFP) constitutivamente.

<table><tbody><tr><td>Microscópio fluorescente</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LB ágar</td><td>Fisher</td><td>BP1425-500</td><td>suspender 40 g em 1 L de água purificada</td></tr><tr><td>LB caldo Fisher</td><td></td><td>BP1427-500</td><td>suspender 20 g em 1 L de água purificada</td></tr><tr><td>Coifa</td><td>de biossegurança Microzone corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri</td><td>Fisher</td><td>875712</td><td>estéril 100 mm x 15 mm de poliestireno Placa de Petri</td></tr><tr><td>Agitador de incubadora</td><td>New Brunswick Scientific</td><td></td><td>Excella E24 série de agitador de incubadora</td></tr><tr><td>50 ml tubo de centrífuga esterilizado</td><td>Corning</td><td>430828</td><td>Polipropileno Livre de RNase/DNase</td></tr><tr><td>Base livre de tetraciclina</td><td>MP Biomedicals</td><td>103012</td><td>50 &#956; g/ml</td></tr><tr><td>SYLGARD 184 silicone</td><td>Dow Corning Corporation</td><td>68037-59-2</td><td>Base de elastômero e agente de cura</td></tr><tr><td>Fotorresistente positivo (AZ4620)Tubo</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>de plástico</td><td>Cole-Parmer</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

protocolo para a formação de biofilme streamer em um dispositivo micro com micro-pilares

Protocol for Biofilm Streamer Formation in a Microfluidic Device with Micro-pillars

Várias espécies bacterianas possuem a capacidade para ligar a superfícies e colonizar-los sob a forma de películas finas chamadas biofilmes. Os biofilmes que crescem em meios porosos são relevantes para vários processos industriais e ambientais, como o tratamento de águas residuais e sequestro de CO 2. Usamos Pseudomonas fluorescens, uma bactéria Gram-negativa aeróbica, para investigar a formação de biofilmes em um dispositivo de microfluidos, que imita meios porosos. O dispositivo de microfluidos consiste de uma matriz de micro-mensagens, que foram fabricados utilizando-litografia macia. Subsequentemente, a formação de biofilmes em estes dispositivos com o fluxo foi investigado e que demonstram a formação de biofilmes filamentosos conhecidos como serpentinas em nosso dispositivo. Os protocolos detalhados para fabricação e montagem de dispositivos microfluídicos são fornecidos aqui, juntamente com os protocolos de cultura de bactérias. Os procedimentos detalhados para a experimentação com o dispositivo micro também são apresentados juntamente com o representanteresultados.

Usando o protocolo de microfabricação acima mencionado, um dispositivo de microfluidos com base de PDMS foi construído. Figura 1 mostra o microscópio electrónico de varrimento (SEM) de imagens do dispositivo de PDMS. Figura 1a mostra a secção de entrada do dispositivo. Uma entrada de tipo forquilha é criado para equalizar a pressão do outro lado da cabeça do dispositivo. Outras imagens de SEM mostraram igualmente que as paredes da coluna são quase verticais (Figura 1b)....

Protocolos para o estudo da formação de biofilme em um dispositivo microfluídico que imita meios porosos são discutidos. O dispositivo microfluídico consiste em uma matriz de micro-pilares e a formação de biofilme por Pseudomonas fluorescens neste dispositivo é investigada.

Protocolo para a formação de biofilme Streamer em um dispositivo micro com micro-pilares

Several bacterial species possess the ability to attach to surfaces and colonize them in the form of thin films called biofilms. Biofilms that grow in ...

O objetivo geral deste procedimento é demonstrar a formação de filetes bacterianos em um dispositivo microfluídico com microcolunas. Isso é realizado primeiramente pela fabricação do chip microfluídico. O segundo passo do procedimento consiste em cultivar as bactérias testadas, neste caso, Pseudomonas fluorescens.As etapas finais consistem em montar a configuração experimental, injetar as bactérias no chip microfluídico e coletar os dados. Em última análise, os resultados podem mostrar a evolução temporal dos filetes por meio de imagens de microscopia de fluorescência. A demonstração visual deste método é fundamental, pois as diferentes etapas são difíceis de aprender.Devido à natureza interdisciplinar do experimento, este procedimento exige pastilhas de silício com gravação a íons reativos profunda. O fotoresiste nas pastilhas deve ser removido. Comece com o molde mestre em silêncio.Adicione duas ou três gotas de tricloroetileno a um frasco e coloque-o em um dessecador, com o molde posicionado com a face voltada para cima ao lado do frasco. Em duas ou três horas, o molde estará silanizado. Durante a silanização, prepare a mistura de PDMS combinando a base de silicone cigar 1 8 4 com o agente de cura numa proporção de 10 para 1.Em seguida, desgaseifique o PDMS sob vácuo por cerca de duas horas. Agora, transfira uma silanizada para um suporte e despeje o PDMS sobre ela, garantindo que não se formem bolhas. Deixe o PDMS curar na silanizada a 80 graus Celsius por duas horas.Isso fabrica um carimbo A-P-D-M-S a partir do molde de silício dimensionado. Quando a cura for concluída, remova o carimbo de PDMS com a ajuda de uma lâmina. Em seguida, corte o carimbo em um chip microfluídico usando a lâmina.Agora, utilizando uma broca de núcleo, perfure orifícios nas posições de entrada e saída no carimbo. O próximo passo é ligar o carimbo ao vidro. Exponha uma lamínula de 24 milímetros e o carimbo de PDMS ao plasma de oxigênio por 30 segundos.Após a exposição, fixe a lamínula no lado inferior do carimbo de PDMS e uma ligação se formará. Coloque o conjunto em uma estufa a 70 graus Celsius por 10 minutos. Para concluir o processo deste protocolo, prepare placas de LB feitas com água ultrapura e suplementadas com 50 microgramas por mililitro de tetraciclina adicionados a 50 a 55 graus Celsius.Ao despejar os meios em placas, as bolhas podem ser eliminadas por meio da chama. As placas resfriadas e solidificadas devem ser datadas e armazenadas a quatro graus Celsius, envoltas em papel alumínio. Além disso, prepare caldo LB feito com água ultrapura e suplementado com 50 microgramas por mililitro de tetraciclina.Armazene o caldo a quatro graus Celsius e também envolto em papel alumínio. Agora, cultive cepas de pseudomonas fluorescence armazenadas a menos 80 graus Celsius em placas de LB, faça o estriamento das placas em padrão zigue-zague e incube-as durante a noite a 30 graus Celsius no escuro. No dia seguinte, escolha uma colônia da placa e inocule um frasco contendo S um recém-preparado, incubado durante a noite a 30 graus Celsius com agitação de 150 RPM.Meça a densidade óptica do cultivo após a incubação. Em seguida, prepare a solução S dois. Adicione cinco mililitros de LB a um tubo plástico e, depois, adicione quantidade suficiente da solução S um para obter uma OD em 600 nanômetros de 0,1, o que é típico para um experimento de biofilme.Primeiro, monte o experimento usando pinças. Conecte tubos plásticos com diâmetro interno de 0,20 polegadas às entradas e saídas do chip preparado. Os tubos devem ser flexíveis e suficientemente longos. Neste caso, têm cerca de 20 polegadas de comprimento.Em seguida, encha as seringas com a solução S2. Acople agulhas rombudas de calibre 30 e remova as bolhas. Evitar que bolhas de ar entrem no canal é uma etapa crítica, especialmente devido à duração prolongada do experimento.As bolhas podem danificar as estruturas moles formadas pelas bactérias. Em seguida, conecte as seringas aos tubos de entrada e conecte os tubos de saída aos recipientes de descarte. Agora, posicione as seringas em uma bomba de seringa e ajuste a bomba à taxa de fluxo desejada, como oito microlitros por hora, em um microscópio equipado com uma câmara de células ajustada à temperatura de incubação.Utilize um objetivo de 40 x para visualizar o chip microfluídico. Agora, inicie a bomba. Quando as bactérias são introduzidas na câmara, a formação de biofilme também é iniciada.O biofilme irá se formar e amadurecer por horas ou dias; capture imagens para acompanhar seu desenvolvimento. Utilizando um chip microfluídico fabricado por MEAF, foi realizada a imagem. A entrada em formato de garfo é criada para equalizar a pressão ao longo do dispositivo.Pode-se observar também que as paredes das colunas são quase verticais. Para examinar a formação de biofilme, fluorescência foi injetada no dispositivo a oito microlitros por hora. A formação de biofilme iniciou-se após alguns minutos da infusão da cultura bacteriana diluída.No entanto, após algumas horas, observou-se o aparecimento de estruturas filamentosas estendendo-se entre os microsustentáculos na região mediana. A elipse tracejada delimita um filete em formação, fixado em uma das extremidades à região polar de um dos microsustentáculos. Filetes também foram observados ao longo da diagonal entre dois microsustentáculos.A espessura dos filetes aumentou com o tempo devido à divisão celular, bem como à incorporação de bactérias planctônicas. Eles também se proliferaram com o tempo, e como os filetes ocupavam um grande volume no dispositivo, isso levou à formação de biofilme maduro, o qual poderia entupir o dispositivo. Uma simulação mecânica do fluxo através do dispositivo mostra que os filetes inicialmente se orientam ao longo das linhas de corrente do fluido.Além disso, na fase inicial, os filetes se originam em locais de maior velocidade do fluxo. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como os filetes de biofilme se formam e evoluem em um ambiente microfluídico. Não se esqueça de que o trabalho com bactérias pode ser extremamente perigoso, e precauções, como protocolos de biossegurança, devem sempre ser adotadas ao realizar este procedimento.

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

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