Caracterizando a migração celular no tridimensional em Vitro ferida ambientes

O objetivo geral deste procedimento é observar o efeito de tratamentos específicos de interesse sobre a migração celular em um suporte tridimensional de fibrina associado a feridas. Este método pode ajudar a responder perguntas-chave na área de cicatrização de feridas, sobre como alterações na estrutura da rede de fibras influenciam a migração celular e os coágulos de fibrina em locais de feridas. A principal vantagem desta técnica é que ela fornece um método simples e reprodutível para analisar a migração celular dentro de coágulos de fibrina em 3D. Geralmente, indivíduos novos neste método enfrentam dificuldades, pois a transferência dos esferoides pode ser desafiadora.

Inicie aquecendo um frasco com fibroblastos dérmicos humanos neo-natais congelados em banho-maria a 37 graus Celsius. Quando as células estiverem recém-descongeladas, colete-as por centrifugação e re-suspenda o pellet em meio fresco para fibroblastos dérmicos humanos neo-natais na concentração de 1 x 10⁶ células por mililitro. Em seguida, semeie as células em um frasco de cultura T75 para um período de incubação de 72 horas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.

Quando a cultura atingir 80% de confluência, desprenda as células com cinco mililitros de tripsina EDTA. Após cinco minutos a 37 °C, neutralize a tripsina com cinco mililitros de meio aquecido e misture 40 microlitros de células com azul de tripano na proporção de 1:1. Reserve uma alíquota de 10 microlitros de células para contagem.

Coletar as células por centrifugação e ressuspender o pellet em uma concentração de 1,25 x 10⁵ células por mililitro. Em seguida, cobrir o fundo de uma placa de Petri de 10 centímetros com cinco mililitros de PBS estéril. Em seguida, inverter a tampa da placa de Petri e adicionar várias gotas de 20 microlitros da suspensão celular na superfície interna da tampa.

Quando todas as gotas tiverem sido colocadas, recoloque a tampa invertida sobre a placa, tomando cuidado para não deslocar as gotas suspensas, e coloque suavemente a placa em uma incubadora a 37 graus celsius por 72 horas. Ao final da incubação, adicione 100 microlitros de solução de coágulo por esferoide por poço, em uma placa de 48 poços, e agite e bata suavemente na placa para garantir que a mistura de coágulo de fibrina recubra todo o poço. Coloque a placa na incubadora por uma hora.

Quando a camada de coágulo tiver polimerizado, confirme a presença de esferoides na cultura de gota pendente, sob um microscópio óptico, e transfira a placa de 48 poços e a cultura de gota pendente para uma cabine de cultura celular. Inverta cuidadosamente a tampa da placa de Petri para acessar as culturas de gota pendente e utilize uma seringa de um mililitro equipada com agulha de 21 gauge para transferir uma gota para cada poço revestido com fibrina. Tenho cuidado extra ao aspirar e semear os esferoides, pois a etapa mais difícil e crítica do processo é transferir os esferoides sem destruí-los.

Examine a placa ao microscópio para confirmar que os esferoides foram adequadamente semeados nos poços apropriados. Adicione cuidadosamente 100 microlitros de solução de coágulo recém-preparada sobre cada gota contendo os esferoides e examine novamente os esferoides ao microscópio, para confirmar que ainda estão intactos e no centro de cada poço. Em seguida, retorne a placa de 48 poços ao incubador para permitir a polimerização da segunda camada de fibrina.

Após uma hora, trate cada poço com 500 microlitros do meio apropriado para o grupo correspondente de esferoides experimentais e retorne a placa ao incubador a 37 graus Celsius. Obtenha imagens dos esferoides por microscopia de campo claro a cada 24 a 72 horas, utilizando um empilhamento em z para visualizar cortes transversais sucessivos do cultivo celular tridimensional. Em seguida, no software apropriado de análise de imagens, trace a borda celular de cada esferoide em cada ponto temporal sucessivo e utilize a função de medição para obter o percentual de aumento na área de cada esferoide.

Após o cultivo na presença do agente pró ou anti-migratório de interesse, as áreas iniciais dos esferoides podem ser determinadas por meio de imagens em microscopia de campo claro e utilizadas como referência para avaliar o grau de migração celular subsequente a partir dos corpos esferoidais em cada ponto temporal sucessivo. Neste experimento representativo, os esferoides expostos a um agente pró-migratório exibiram um grau significativamente maior de migração para fora do corpo esferoidal original em comparação com os esferoides expostos a um agente inibidor da migração ou controle. Por outro lado, os esferoides expostos a um agente anti-migratório exibiram um grau significativamente menor de migração a partir do corpo esferoidal original, em comparação com os esferoides tratados com o controle.

Uma vez dominada, essa técnica pode ser concluída em duas horas e meia, excluindo o tempo de cultivo celular, se for realizada corretamente. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como cultivar e embutir esferoides celulares para ensaios tridimensionais de migração celular in vitro. Após este procedimento, outros métodos, como histologia e imunohistoquímica, podem ser realizados para responder perguntas adicionais sobre como a estrutura da rede de fibrina dentro do coágulo ou o alinhamento da actina nas células do esferoide correspondem ao aumento ou diminuição da migração celular.

Não se esqueça de que trabalhar com culturas celulares e agulhas pode ser extremamente perigoso e que precauções, como o uso de equipamentos de proteção adequados e o trabalho em uma cabine de fluxo laminar estéril, devem sempre ser tomadas ao realizar este procedimento.