Name: Caracterizando a migração celular no tridimensional em Vitro ferida ambientes (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 10 s
Description: Aprenda a caracterizar a migração celular em ambientes tridimensionais de ferida usando fibroblastos dérmicos humanos neonatais em matriz de fibrina. Este método reprodutível permite analisar fatores pró e antimigratórios na cicatrização de feridas.

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Financiamento para este trabalho foi fornecido pela American Heart Association (16SDG29870005) e a North Carolina State University Research e financiamento de sementes de inovação.

1. dia 1: célula e preparação do reagente Nota: toda preparação celular e reagente deve ser executada em uma câmara de segurança biológica para evitar a contaminação das amostras.
<ol><li>Morna filtrada Dulbecco &#39; s Modified Eagle &#39; s médio (DMEM), soro bovino fetal (FBS), L-glutamina e penicilina/estreptomicina em banho maria a 37 ° C.</li>
	<li>Preparar mídia de fibroblastos dérmicos humanos neonatal (HDFn), completando aquecido DMEM com 10% FBS, 1% penicilina/estreptomicina e 1% L-glutamina.</li>
	<li>Descongelar um frasco de congelados HDFns e centrífuga para 8 min a 200 x g para remover o meio de criopreservação. Ressuspender as células em meios de HDFn preparados em uma densidade de sementes de 1 x 10 6 células/mL em um frasco de cultura T-75.</li>
	<li>Balão de lugar na incubadora (37 ° C, 5% CO 2) para permitir a proliferação celular.</li>
	<li>Loja HDFn mídia em 4 ° C.</li>
	<li>Preparar pro e anti migratory reagentes conforme necessário.</li>
</ol> 2. Dia 3: Spheroid preparação <ol><li>executar o seguinte em uma capa de cultura para evitar a contaminação das amostras.</li>
	<li>Quando células alcançar 80% de confluência, mídia, Aspire e adicionar 5 mL de 0,25% Trypsin-EDTA. Balão de loja em uma incubadora de 37 ° C por 5 min separar totalmente as células da superfície do balão.</li>
	<li>Adicionar 5 mL de mídia aquecida no balão para neutralizar a tripsina.</li>
	<li>Em um tubo de microcentrifugadora, misture 10 μL de Trypan azul e 10 μL da suspensão celular.</li>
	<li>Centrifugar a suspensão celular original para 8 min a 200 g. x</li>
	<li>Enquanto a suspensão celular é ser centrifugada, adicionar 10 μL da suspensão celular Trypan azul para um hemocytometer e realizar uma contagem celular.</li>
	<li>Após centrifugação, Aspire mídia sem desalojar o centrifugado. Ressuspender as células em uma concentração de 1,25 x 10 5 células/mL.</li>
	<li>Adicionar 5 mL de soro fisiológico estéril tamponado de fosfato (PBS) para o fundo de um prato de Petri para manter um ambiente hidratado durante o crescimento do esferoide de 10 cm.</li>
	<li>Inverter a tampa da caixa de Petri. Adicionar vários 20 μL gotas de suspensão de células para a superfície interna da tampa do prato de Petri.</li>
	<li>Rapidamente inverter a tampa novamente e coloque-o na parte inferior do prato, tomando cuidado para não deslocar as gotas de suspensão. a Figura 1 ilustra o enforcamento com sucesso formado gotas.</li>
	<li>Cuidadosamente coloque o prato em uma incubadora de 37 ° C e permitir esferoides crescer em um enforcamento larga cultura por um período de 72 h.</li>
</ol> 3. Dia 6: Incorporação de esferoides em 3D Matrix <ol><li>executar o seguinte em uma capa de cultura para evitar a contaminação das amostras.</li>
	<li>Para a formação da primeira camada de fibrina, criar uma solução de coágulo volume suficiente para adicionar 100 μL de solução de coágulo por alvéolo para poços como muitos como necessário (1 esferoide por alvéolo). Os coágulos são compostos de 10% 10 X HEPES de buffer por volume (250 mM HEPES, 1500 mM NaCl, 50mm CaCl 2, pH 7,4), fibrinogênio humano de 2 mg/mL e trombina alfa humana de 0,1 U/mL. O restante do volume coágulo é composto de água ultrapura.
	<ol><li>Adicionar trombina última e rapidamente adicionar solução desejados poços em uma placa de 48 para prevenir coágulos de polimerização antes sendo adicionadas aos poços.</li>
	</ol></li> <li>Suavemente agitar/torneira bem placa para garantir que a mistura do coágulo de fibrina é revestimento todo o bem e em seguida coloque a placa bem na incubadora para 1 h permitir que a camada inferior de coágulo polimerizar. Não agite bem placa forte o suficiente para induzir a formação de bolhas; simplesmente rock placa conforme necessário até que a totalidade do poço é revestida. Se volumes maiores de coágulo são utilizados, este passo pode não ser necessário.</li>
	<li>Esferoides de transferência para a camada de fibrina.
	Placa <ol><li>remover o poço e o prato de Petri contendo esferoides no enforcamento soltar cultura da incubadora e examinar esferoides sob um microscópio. Em seguida, coloque o prato ao subúrbio de cultura.</li>
		<li>Inverter cuidadosamente a tampa da caixa de Petri para permitir o acesso para o enforcamento cair culturas.</li>
		<li>Cuidadosamente usando uma agulha 21G, ligada a uma seringa de 1 mL, transferir uma gota da tampa invertida no centro de cada bem, tomando cuidado para não perfurar a camada de fibrina polimerizada, revestindo o fundo do poço. Para efetivamente transferir a gota, puxe lentamente a queda para a agulha. Pare de puxar o êmbolo, assim que a gota inteira está dentro da agulha; puxando a queda para trás longe demais pode apresentar bolhas de ar, que podem interromper a transferência eficaz esferoide ou imagens subsequentes.</li>
		<li>Examinar a placa bem sob um microscópio para garantir que esferoides transferiram corretamente em poços tudo desejados.</li>
	</ol></li> <li>Para a formação da segunda camada de fibrina, criar uma outra solução de coágulo, usando a mesma preparação como acima para a criação da primeira camada de fibrina (passo 3.2). Pipetar 100 μL em cada gota que contenham esferoide e examinar ao microscópio novamente para garantir que esferoides ainda estão intactos e não foram empurrados para as bordas dos poços cuidadosamente.</li>
	<li>Devolve a chapa bem para a incubadora e permitir que a segunda camada polimerizar por 1 h.</li>
</ol> 4. Dia 6: Adição de fatores inibitórios ou Pro-migratória <ol><li>mídia HDFn aquecido a 37 ° C.</li>
	<li>Execute as seguintes etapas em um capuz para evitar a contaminação.</li>
	<li>Preparar a mídia para cada grupo incluindo concentrações adequadas de pro/anti-migratory agentes a ser avaliada.</li>
	<li>Remover a placa bem da incubadora e coloque em uma capa de cultura.</li>
	<li>Adicionar 500 μL de mídia padrão para cada poço do grupo controle de esferoide, 500 μL de mídia inibitória a cada poço do grupo esferoide inibidora de migração e 500 μL de mídia pro-migratórias a cada poço do grupo migração aprimorada esferoide.</li>
	<li>Devolve a chapa bem para a incubadora.</li>
	<li>Mídia de mudança cada 48 h.</li>
</ol> 5. Dias 6-9: avaliação da migração celular e proliferação <ol><li>imagem esferoides usando microscopia brightfield imediatamente após a adição da mídia (0 h) e em seguida cada 24h por 72 h. opcional: em cada ponto de tempo, pegue uma imagem de z-pilha a fim de determinar se migração está ocorrendo em aviões fora da área principal de foco. Em nossa experiência, isso não ocorre; no entanto, é útil garantir que este é o caso em cada experimento.</li>
	<li>Uso ImageJ para determinar a consequência natural de célula em cada poço, analisando o aumento percentual de área para cada esferoide traçando a borda de célula para cada esferoide em cada ponto de tempo sucessivos e usando o &#34; medida &#34; função para obter a área de.</li>
</ol>

<ol><li>Chester, D., Brown, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+biophysical+properties+of+provisional+matrix+proteins+in+wound+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Matrix+Biol%22%5BJournal%5D)">The role of biophysical properties of provisional matrix proteins in wound repair.</a> Matrix Biol. , (2016).</li>
<li>Martin, P., Leibovich, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+cells+during+wound+repair%3A+the+good%2C+the+bad+and+the+ugly%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Inflammatory cells during wound repair: the good, the bad and the ugly.</a> Trends in Cell Biology. 15 (11), 599-607 (2005).</li>
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<li>Cox, S., Cole, M., Tawil, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavior+of+Human+Dermal+Fibroblasts+in+Three-Dimensional+Fibrin+Clots%3A+Dependence+on+Fibrinogen+and+Thrombin+Concentration%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Behavior of Human Dermal Fibroblasts in Three-Dimensional Fibrin Clots: Dependence on Fibrinogen and Thrombin Concentration.</a> Tissue Eng. 10 (5-6), 942-954 (2004).</li>
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</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Este protocolo permite para o exame de migração celular, na cicatrização de feridas associada ECMs através de um modelo 3D in vitro . Um passo crucial na boa execução do processo é o desenvolvimento adequado de esferoides de fibroblastos; concentração de células durante a preparação foi otimizada para dar uma concentração inicial de 2.500 células/soltar, permitindo esferoides de forma confiável ao longo de um período de incubação de 72 h. Se um número insuficiente de células é usado, esferoides não podem agregar...

Cicatrização de feridas é um processo complexo que resulta na restauração da integridade de tecidos após lesão. Este processo é dividido em quatro fases sobrepostas englobadas por hemostasia, inflamação, proliferação e remodelação,-que cada um são regulados por uma combinação complexa de pistas solúveis, interações célula-matriz e comunicações célula-célula. 1 , 2 a orquestração destes tacos controla uma infinidade de respostas celulares na cicatrização de feridas, importante, incluindo migração celular. 3 , 4 migração celular é um processo altamente dinâmico dependente as propriedades bioquímicas e biofísicas de meio de matriz extracelular e celulares fenótipos. 5 células continuamente sonda ambiente matriz extracelular através de vias mediadas por integrina; Este processo permite que as células a perceber uma ampla gama de propriedades de matriz, incluindo topografia, rigidez e confinamento. Análise de bidimensional (2D) de migração celular demonstra que a migração é impulsionada pela formação de lamellipodia na vanguarda através da geração de feixes de filamentos de actina. Subsequente formação de aderências focais na vanguarda, em combinação com actomyosin conduzido contração e retração à aresta de fuga, conduz a célula para frente. 6 migração celular tridimensional (3D) atualmente não é bem compreendida, no entanto, estudos recentes demonstram que a migração 3D é marcadamente diferente do que o acima descrito o mecanismo em 2D e é, provavelmente, conduzido por mecanismos alterative. Por exemplo, estudos recentes por Petrie et al. demonstrado que, dependendo das propriedades do ECM, células em matrizes 3D podem alternar entre lamellipodium e lobopodium conduzido mecanismos de migração. 7 porque a migração celular é um componente crítico da resposta de cicatrização de feridas, modelos 3D de migração celular são críticos para compreender as respostas fisiológicas aos diversos estímulos durante a cicatrização de feridas. Embora o comportamento migratório de célula em superfícies 2D foi mostrado para variar muito de migração em matrizes 3D, modelos em vitro mais atuais de migração celular durante a processo, incluindo o ensaio de risco bem estabelecido, de cicatrização de feridas utilizam 2D culturas de monocamada. 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 mais recentemente desenvolvidos ensaios utilizaram uma matriz 3D, mas ainda cultura de células em um monolayer em cima da matriz, limitando assim a capacidade de verdadeiramente recapitular a tridimensionalidade do ambiente celular in vivo. 15
O objetivo do método aqui descrito é estudar a migração celular em um modelo 3D fisiologicamente relevante, em vez de em uma superfície 2D, a fim de obter uma compreensão mais robusta de respostas de migração associados os estímulos aplicados. Este método permite a avaliação da migração celular dentro de uma matriz de coágulo de fibrina 3D na presença de fatores que ativar ou inibir vias associadas a migração celular. Uma matriz de fibrina foi escolhida para esse método devido as peças de fibrina papel crítico nos estágios iniciais de cicatrização de feridas; seguir lesão, um coágulo de fibrina é formada dentro de ambientes de ferida para travar a perda de sangue e serve como um andaime para infiltração de pilha inicial durante a remodelação e reparação tecidual. 2 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 além disso, fibrina é usada clinicamente como um vedador cirúrgico e a composição dos selantes foi amarrada a migração celular e ultimate resultados de cura. Um estudo anterior por Cox et al. investigou a migração de fibroblastos com coágulos de fibrina, compostos de fibrina variada e concentrações de trombina para fins de otimização de um selante de fibrina. Nesses estudos, a migração de células de coágulos de fibrina em pratos plásticos foi quantificada. 20 aqui apresentamos um método que permite a quantificação da migração de células dentro do ambiente 3D de fibrina. Enquanto o método descrito neste protocolo especificamente usa fibrina, este modelo pode ser facilmente modificado para usar materiais alternativos matriz conforme desejado, tais como colágeno ou outras matrizes 3D. Além disso, apresentamos o uso de esferoides de fibroblasto neste ensaio como a migração de fibroblastos no leito da ferida é de suma importância para a síntese de matriz extracelular e remodelação/reparação de tecidos. No entanto, durante o reparo processo neutrófilos são o primeiro tipo de célula para migrar para o leito da lesão, seguido por macrófagos. Fibroblastos, então, começar a infiltrar o ambiente da ferida aproximadamente 48 horas após a lesão inicial, no início da fase proliferativa da processo de cicatrização de feridas. 19 este ensaio pode ser facilmente modificado para incluir os neutrófilos, macrófagos ou outros tipos de células para avaliar como alterações na estrutura do coágulo de fibrina afetam a migração desses tipos de célula. 21
Para implementar este ensaio, em primeiro lugar, um esferoide de fibroblasto é formado usando uma modificação das técnicas descritas anteriormente para cultura de células-tronco. 22 o spheroid fibroblasto é posteriormente transferido para uma matriz de fibrina 3D, e a consequência pode ser facilmente monitorizada e quantificada durante vários dias. Este protocolo leva em consideração o 3D dos sistemas fisiológicos incorporando esferoides 3D celular dentro de uma matriz de fibrina, evitando assim as limitações na relevância provocada por um usando uma superfície de crescimento 2D com uma monocamada de células migratórias comportamento modelo, enquanto ainda permitindo a avaliação do comportamento de células em um ambiente altamente controlado em vitro .

<table><tbody><tr><td>Materiais</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium, 4,5 g/L de glicose, c/ piruvato de sódio, sem L-glutamina</td><td>VWR</td><td>VWRL0148-0500</td><td>DMEM já contendo L-glutamina também pode ser usado Placa de</td></tr><tr><td>cultura de tecidos de 100 mm, não tratada, esterilizada, não pirogênica</td><td>VWR</td><td>10861-594</td><td>Pratos de qualquer tamanho podem ser usados para pendurar cultura de gota&nbsp;</td></tr><tr><td>Soro fetal bovino de países aprovados pelo USDA, inativado por calor, filtrado estéril, testado em cultura de células</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>12306C-500ML</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Fisher Scientific</td><td>ICN1680149</td><td>Não é necessário se estiver usando DMEM que já contém L-glutamina&nbsp;</td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina Solução estabilizada, filtrada estéril, com 10.000 unidades de penicilina e 10 mg de estreptomicina/mL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Fibroblastos Dérmicos Humanos, neonatais</td><td>Thermo Fisher</td><td>C0045C</td><td>Pode ser substituído por outro tipo de célula de interesse</td></tr><tr><td>Agulha de 21 G x 1 1/2'</td><td>BD&nbsp;</td><td>305167</td><td>agulhas de 22 G x 1 1/2 também funcionarão</td></tr><tr><td>Seringa de 1 mL</td><td>VWR</td><td>89174-491</td><td>Seringas de qualquer volume podem ser usadas</td></tr><tr><td>Placas de Cultura de Células Multipoços, Poliestireno, Greiner Bio-One (Embaladas Individualmente) (48 poços)</td><td>VWR</td><td>82051-004&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Fibrinogênio Humano - Plasminogênio, Fator de von Willebrand e Laboratórios de Pesquisa de Enzimas Empobrecidas de Fibronectina</td><td></td><td>FIB 3</td><td>Pode ser substituído por proteína da matriz de interesse Laboratórios de</td></tr><tr><td>Pesquisa de Enzimas</td><td>de Alfa Trombina Humana</td><td>HT 1002a</td><td>Pode não ser necessário dependendo da proteína da matriz de interesse</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr>Capuz <td></td><td></td><td></td><td>de cultura de células BSL2</td></tr><tr><td>Incubadora</td><td></td><td></td><td></td>de cultura</tr><tr><td>de células Microscópio invertido com objetiva</td><td></td><td></td><td></td>de 10X</tr><tr><td>Centrífuga compatível com tubos de</td><td></td><td></td><td></td> 15 mL</tr></tbody></table>

caracterizando a migração celular no tridimensional em vitro ferida ambientes

Characterizing Cell Migration Within Three-dimensional In Vitro Wound Environments

Atualmente, a maioria dos modelos em vitro de cicatrização, tais como ensaios de risco bem estabelecidos, envolvem estudando o fechamento da célula migração e ferida em superfícies bidimensionais. No entanto, o ambiente fisiológico no qual ferida na vivo tem lugar de cura é tridimensional, ao invés de bidimensional. Está se tornando cada vez mais claro que o comportamento da célula difere grandemente em bidimensional vs ambientes tridimensionais; Portanto, há uma necessidade de mais fisiologicamente relevantes em vitro modelos para estudar os comportamentos de migração celular no encerramento da ferida. O método descrito neste documento permite o estudo da migração celular em um modelo tridimensional que melhor reflete as condições fisiológicas do que ensaios zero bidimensionais previamente estabelecidos. A finalidade deste modelo é avaliar a consequência natural da célula através do exame de migração celular longe um esferoide corpo incorporado dentro de uma matriz de fibrina na presença de fatores de pro ou anti migratory. Usando esse método, célula consequência natural do organismo em uma matriz tridimensional de esferoide pode ser observado e é facilmente quantificável ao longo do tempo através de microscopia brightfield e análise da área de corpo de esferoide. O efeito de fatores pro-migratórias e/ou inibitórios sobre a migração de células também pode ser avaliado neste sistema. Este método fornece a pesquisadores com um método simples de analisar a migração celular no ferimento tridimensional associado matrizes em vitro, aumentando assim a relevância da vitro em células estudos prévio à utilização de animais na vivo modelos.

Cultura de esferoide pode ser utilizada para avaliar com sucesso o efeito dos agentes pro e antimigratórias na migração de fibroblastos in vitro Esferoides fibroblasto 3D podem ser formadas através de cultura de gota de suspensão durante um período de 72 h (Figura 1). Após o período de cultura, esferoides são incorporados dentro da matriz do coágulo e fotografaram usando microscopia brightfield (Figura 2). As ...

O objetivo do presente protocolo é avaliar o efeito dos factores pro e anti migratory na migração de células dentro de uma matriz tridimensional de fibrina.

Caracterizando a migração celular no tridimensional em Vitro ferida ambientes

Currently, most in vitro models of wound healing, such as well-established scratch assays, involve studying cell migration and wound closure on ...

O objetivo geral deste procedimento é observar o efeito de tratamentos específicos de interesse sobre a migração celular em um suporte tridimensional de fibrina associado a feridas. Este método pode ajudar a responder perguntas-chave na área de cicatrização de feridas, sobre como alterações na estrutura da rede de fibras influenciam a migração celular e os coágulos de fibrina em locais de feridas. A principal vantagem desta técnica é que ela fornece um método simples e reprodutível para analisar a migração celular dentro de coágulos de fibrina em 3D. Geralmente, indivíduos novos neste método enfrentam dificuldades, pois a transferência dos esferoides pode ser desafiadora.Inicie aquecendo um frasco com fibroblastos dérmicos humanos neo-natais congelados em banho-maria a 37 graus Celsius. Quando as células estiverem recém-descongeladas, colete-as por centrifugação e re-suspenda o pellet em meio fresco para fibroblastos dérmicos humanos neo-natais na concentração de 1 x 10⁶ células por mililitro. Em seguida, semeie as células em um frasco de cultura T75 para um período de incubação de 72 horas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.Quando a cultura atingir 80% de confluência, desprenda as células com cinco mililitros de tripsina EDTA. Após cinco minutos a 37 °C, neutralize a tripsina com cinco mililitros de meio aquecido e misture 40 microlitros de células com azul de tripano na proporção de 1:1. Reserve uma alíquota de 10 microlitros de células para contagem.Coletar as células por centrifugação e ressuspender o pellet em uma concentração de 1,25 x 10⁵ células por mililitro. Em seguida, cobrir o fundo de uma placa de Petri de 10 centímetros com cinco mililitros de PBS estéril. Em seguida, inverter a tampa da placa de Petri e adicionar várias gotas de 20 microlitros da suspensão celular na superfície interna da tampa.Quando todas as gotas tiverem sido colocadas, recoloque a tampa invertida sobre a placa, tomando cuidado para não deslocar as gotas suspensas, e coloque suavemente a placa em uma incubadora a 37 graus celsius por 72 horas. Ao final da incubação, adicione 100 microlitros de solução de coágulo por esferoide por poço, em uma placa de 48 poços, e agite e bata suavemente na placa para garantir que a mistura de coágulo de fibrina recubra todo o poço. Coloque a placa na incubadora por uma hora.Quando a camada de coágulo tiver polimerizado, confirme a presença de esferoides na cultura de gota pendente, sob um microscópio óptico, e transfira a placa de 48 poços e a cultura de gota pendente para uma cabine de cultura celular. Inverta cuidadosamente a tampa da placa de Petri para acessar as culturas de gota pendente e utilize uma seringa de um mililitro equipada com agulha de 21 gauge para transferir uma gota para cada poço revestido com fibrina. Tenho cuidado extra ao aspirar e semear os esferoides, pois a etapa mais difícil e crítica do processo é transferir os esferoides sem destruí-los.Examine a placa ao microscópio para confirmar que os esferoides foram adequadamente semeados nos poços apropriados. Adicione cuidadosamente 100 microlitros de solução de coágulo recém-preparada sobre cada gota contendo os esferoides e examine novamente os esferoides ao microscópio, para confirmar que ainda estão intactos e no centro de cada poço. Em seguida, retorne a placa de 48 poços ao incubador para permitir a polimerização da segunda camada de fibrina.Após uma hora, trate cada poço com 500 microlitros do meio apropriado para o grupo correspondente de esferoides experimentais e retorne a placa ao incubador a 37 graus Celsius. Obtenha imagens dos esferoides por microscopia de campo claro a cada 24 a 72 horas, utilizando um empilhamento em z para visualizar cortes transversais sucessivos do cultivo celular tridimensional. Em seguida, no software apropriado de análise de imagens, trace a borda celular de cada esferoide em cada ponto temporal sucessivo e utilize a função de medição para obter o percentual de aumento na área de cada esferoide.Após o cultivo na presença do agente pró ou anti-migratório de interesse, as áreas iniciais dos esferoides podem ser determinadas por meio de imagens em microscopia de campo claro e utilizadas como referência para avaliar o grau de migração celular subsequente a partir dos corpos esferoidais em cada ponto temporal sucessivo. Neste experimento representativo, os esferoides expostos a um agente pró-migratório exibiram um grau significativamente maior de migração para fora do corpo esferoidal original em comparação com os esferoides expostos a um agente inibidor da migração ou controle. Por outro lado, os esferoides expostos a um agente anti-migratório exibiram um grau significativamente menor de migração a partir do corpo esferoidal original, em comparação com os esferoides tratados com o controle.Uma vez dominada, essa técnica pode ser concluída em duas horas e meia, excluindo o tempo de cultivo celular, se for realizada corretamente. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como cultivar e embutir esferoides celulares para ensaios tridimensionais de migração celular in vitro. Após este procedimento, outros métodos, como histologia e imunohistoquímica, podem ser realizados para responder perguntas adicionais sobre como a estrutura da rede de fibrina dentro do coágulo ou o alinhamento da actina nas células do esferoide correspondem ao aumento ou diminuição da migração celular.Não se esqueça de que trabalhar com culturas celulares e agulhas pode ser extremamente perigoso e que precauções, como o uso de equipamentos de proteção adequados e o trabalho em uma cabine de fluxo laminar estéril, devem sempre ser tomadas ao realizar este procedimento.

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

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Revelando a Organização do citoesqueleto das células invasoras câncer em 3D

Comumente usado, são descritos métodos altamente acessíveis para analisar a migração celular e invasão in vitro. O primeiro método é o ensaio de encerramento de feridas de células que mede a mobilidade celular. O segundo método é o ensaio de migração e invasão transwell que avalia o quimiotáctica e capacidade invasiva de células.

Na migração celular in vitro e invasão Ensaios

Este artigo proporciona metodologias detalhadas para a utilização de ensaios tridimensionais (3D), para quantificar a invasão das células do cancro da mama. Especificamente, vamos discutir os procedimentos necessários para a criação de tais ensaios, quantificação e análise de dados, bem como métodos para analisar a perda da integridade da membrana que ocorre quando as células invadem.

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