Caracterizando a migração celular no tridimensional em Vitro ferida ambientes

O objetivo geral deste procedimento é observar o efeito de tratamentos específicos de interesse na migração celular em um andaime de fibrina associado a uma ferida tridimensional. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da cicatrização de feridas, sobre como as alterações na estrutura da rede de fibras influenciam a migração celular e para coágulos de fibrina nos locais da ferida, a principal vantagem desta técnica é que ela fornece um método simples e reprodutível para analisar a migração celular dentro de coágulos de fibrina em 3D. Geralmente, os indivíduos novos neste método terão dificuldades porque a transferência dos esferóides pode ser difícil.

Comece aquecendo um frasco de fibroblasto dérmico humano neonatal congelado em banho-maria a 37 graus Celsius. Quando as células estiverem descongeladas, colete-as por centrifugação e ressuspenda o pellet em meio de fibroblastos dérmicos humanos neonatais frescos a 1 x 10 elevado à concentração de 6 células por mililitro. Em seguida, semeie as células em um frasco de cultura T75 para uma incubação de 72 horas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.

Quando a cultura atingir 80% de confluência, desprenda as células com cinco mililitros de tripsina EDTA. Após cinco minutos a 37 graus Celsius, neutralize a tripsina com cinco mililitros de meio aquecido e misture 40 microlitros de células com azul de tripano na proporção de 1:1. Reserve uma alíquota de 10 microlitros de células para contagem.

Colete as células por centrifugação e ressuspenda o pellet a uma concentração de 1,25 x 10 elevado a 5 células por mililitro. Em seguida, coloque no fundo de uma placa de Petri de 10 centímetros cinco mililitros de PBS estéril. Em seguida, inverta a tampa da placa de Petri e adicione várias gotas de 20 microlitros da suspensão celular na superfície interna da tampa.

Quando todas as gotas tiverem sido colocadas, inverta novamente a tampa no prato, tomando cuidado para não desalojar as gotas penduradas e coloque suavemente o prato em uma incubadora de 37 graus Celsius por 72 horas. No final da incubação, adicione 100 microlitros de solução de coágulo por esferóide por poço, a uma placa de 48 poços e agite suavemente e bata na placa para garantir que a mistura de coágulo de fibrina cubra todo o poço. Coloque a placa na incubadora por uma hora.

Quando a camada de coágulo tiver polimerizado, confirme a presença de esferóides na cultura de gotas suspensas, sob um microscópio óptico e transfira a placa de 48 poços e a placa de cultura de gotas suspensas para uma capa de cultura de células. Inverta cuidadosamente a tampa da placa de Petri para acessar as culturas de gotas suspensas e use uma seringa de um mililitro equipada com uma agulha de calibre 21, para transferir uma gota para cada poço revestido de fibrina. Tomo cuidado extra ao aspirar e plaquear os esferoides, pois a etapa mais difícil e crítica do processo é transferir os esferoides sem destruí-los.

Examine a placa ao microscópio para confirmar se os esferóides foram devidamente semeados nos poços apropriados. Coloque suavemente 100 microlitros de solução de coágulo recém-preparada em cada esferóide contendo gota e reexamine os esferóides ao microscópio, para confirmar se eles ainda estão intactos e no centro de cada poço. Em seguida, retorne a placa de 48 poços para a incubadora para permitir que a segunda camada de fibrina polimerize.

Após uma hora, trate cada poço com 500 microlitros do meio apropriado para o grupo esferóide experimental correspondente e retorne a placa à incubadora de 37 graus Celsius. Obtenha imagens dos esferoides por microscopia de campo claro a cada 24 a 72 horas, usando uma pilha z para visualizar seções transversais sucessivas da cultura de células 3D. Em seguida, no software de análise de imagem apropriado, trace a borda da célula de cada esferóide em cada ponto de tempo sucessivo e use a função de medição para acessar o aumento percentual na área de cada esferoide.

Seguindo sua cultura, no agente pró ou antimigratório de interesse, as áreas iniciais dos esferoides podem ser determinadas por imagens microscópicas de campo claro e usadas como referência para determinar o grau de crescimento celular subsequente dos corpos esferóides em cada ponto de tempo sucessivo. Neste experimento representativo, os esferóides que foram expostos a um agente pró-migratório exibiram um grau significativamente maior de migração para longe do corpo esferóide original em comparação com os esferóides expostos a um agente inibidor ou controle de migração. Por outro lado, os esferóides expostos a um agente anti-migratório exibiram um grau significativamente reduzido de migração para longe do corpo esferóide original, em comparação com os esferóides tratados com controle.

Uma vez dominada, essa técnica pode ser concluída em duas horas e meia, excluindo o tempo de cultura de células, se for realizada corretamente. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como cultivar e incorporar esferoides celulares para ensaios tridimensionais de migração celular in vitro. Após este procedimento, outros métodos, como histológico e imuno-histoquímica, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais sobre como a estrutura da rede de fibrina dentro do coágulo ou o alinhamento da actina nas células esferóides correspondem ao aumento ou diminuição da migração celular.

Não se esqueça de que trabalhar com culturas de células e agulhas pode ser extremamente perigoso e que precauções como usar o equipamento de proteção adequado e trabalhar com uma capa de cultura estéril devem sempre ser tomadas durante a execução deste procedimento.