Um método padronizado para a Análise do fígado sinusoidal células endoteliais e Seus fenestrações por Microscopia Eletrônica de Varredura

O objetivo geral deste procedimento é analisar o endotélio sinusoidal hepático. Isso é feito isolando primeiro um fígado e perfundindo-o com fixador. Em seguida, o fígado é cortado em blocos e desidratado em preparação para microscopia eletrônica.

Em seguida, as amostras de fígado são revestidas com pulverização catódica e examinadas ao microscópio eletrônico. Finalmente, as micrografias eletrônicas são analisadas e o diâmetro e a frequência da fenestração e a porcentagem de porosidade são calculados. Em última análise, a microscopia eletrônica é usada para mostrar alterações no endotélio sinusoidal hepático sob várias condições.

Este método nos fornece informações sobre a ultraestrutura e morfologia dos vasos sanguíneos do fígado em seu endotélio. Também pode ser usado para examinar o rim e o cérebro da mesma forma Todos os procedimentos que envolvem o uso de animais são realizados de acordo com a legislação local. Este trabalho é aprovado pelo Comitê de Bem-Estar Animal do Distrito de Saúde Local de Sydney.

Os procedimentos permitidos estão descritos na documentação da licença do projeto e seguem diretrizes que garantem o bem-estar do animal em todos os momentos. Esta é uma cirurgia de não sobrevivência. Após preparar o fixador, de acordo com o protocolo de texto, aqueça o tampão de perfusão e o fixador a 35 a 37 graus Celsius.

Uma vez que o animal é anestesiado com uma única injeção intraperitoneal de cetamina e xilazina, avalie o nível de sedação pela retirada do membro posterior e uma pinça da cauda. Em seguida, com uma tesoura de ponta romba, faça uma incisão em Y no abdômen do animal para expor o fígado e a veia porta. Em seguida, amarre duas suturas muito frouxas ao redor da veia porta, uma proximal ao fígado e a outra mais distalmente ao fígado.

Canule a veia porta com uma cânula IV de tamanho apropriado. Em seguida, aperte as suturas para prender a cânula. Agora, usando cinco a 20 mililitros de PBS quente a 37 graus Celsius, comece a perfusão a uma pressão de 10 centímetros de H2O.

Evite a entrada de bolhas de ar no fígado, o que produziria artefatos e pressão de ar muito alta, o que danificaria o fígado, cortaria o AVC da veia abdominal e torácica para permitir que o tampão saísse livremente do fígado. Isso evita alta contrapressão, danos ao fígado, células sinusoidais e endoteliais ou LCCs. Quando o fígado estiver livre de sangue, substitua o PBS por microscopia eletrônica ou em, fixador e perfundir até que o fígado esteja endurecido e muito pálido.

Aproximadamente cinco minutos. Em seguida, com o bisturi, corte o fígado em blocos de um a dois milímetros cúbicos. Use o fixador em para postar.

Fixe o tecido a quatro graus Celsius por 24 a 72 horas. Em seguida, transfira o tecido para um tampão Cate de sódio 0,1 molar e armazene a quatro graus Celsius por até 12 meses para montar as amostras para microscopia eletrônica de varredura ou MEV. Depois de desidratar as amostras de acordo com o protocolo de texto, rotule a base dos tocos de metal SEM e aplique fita de carbono dupla face na parte superior dos tocos sob um microscópio de dissecação, visualize as amostras para identificar a superfície com os melhores sinusóides para SEM.

Renda, uma superfície escolhida voltada para cima na superfície da fita de carbono do toco e cole-a firmemente no toco. Depois de realizar o revestimento por pulverização catódica e SEM de acordo com o protocolo de texto, abra uma imagem na imagem J e use uma barra de escala embutida na imagem para definir a escala usando a ferramenta polígono na imagem J trace ao redor de toda a área plana do LSEC, incluindo áreas fenestradas e fenestradas, exclua quaisquer grandes pedaços de detritos que estejam na superfície da célula que possam estar obscurecendo as fenestrações. Para medir o diâmetro da fenestração, coloque uma linha no diâmetro mais longo de cada fenestração selecionando a ferramenta de linha.

Pressione M para medir a linha e D para desenhar permanentemente a linha na imagem. Esta linha é definida como o diâmetro da fenestração e agora estará disponível na caixa de resultados da imagem J.Meça todas as lacunas que são buracos maiores no citoplasma LSEC com mais de 250 nanômetros, bem como fenestrações. Calcule a área de lacunas que não são circulares traçando-as e usando a imagem J para calcular sua área além dos dados da caixa de resultados na imagem J em uma planilha do Excel.

Para uma análise mais aprofundada, use as seguintes fórmulas para realizar cálculos de fenestração. O diâmetro médio da fenestração é igual à média de todos os diâmetros da fenestração. A área de fenestração é igual a pi r ao quadrado, onde R é calculado a partir de diâmetros de fenestração individuais.

A porcentagem de porosidade é igual a sigma pi R ao quadrado sobre a área total analisada e mícrons vezes 100 excluem a soma da área das lacunas deste cálculo. Para apresentar os dados nas publicações, inclua o diâmetro da fenestração com uma declaração confirmando que os diâmetros limite foram usados para definir as fenestrações, a frequência e a porosidade da fenestração, também incluindo uma declaração confirmando se as lacunas foram incluídas na análise e um gráfico de distribuição de frequência do diâmetro da fenestração e o número de blocos de fígados, bem como imagens. A baixa ampliação por MEV revela uma superfície plana da amostra hepática com uma área exposta grande o suficiente para observar muitos vasos hepáticos grandes e sinusóides, incluindo o trato portal e o ES central, como mostrado aqui.

Garantir a colocação correta do bloqueio hepático no coto de montagem é essencial para obter imagens nítidas dos sinusóides e a cápsula brilhante, que cobre todos os detalhes dos sinusóides do fígado, deve ser evitada. Por esse motivo, como mostrado aqui, uma maior ampliação permite a observação de fenestrações LSEC. As placas dos hepatócitos podem parecer vasos sanguíneos, mas características como o IVC auxiliam na orientação.

Esta figura demonstra que a alta pressão de profusão pode causar artefatos como grandes lacunas no endotélio que se acredita serem causadas pela coalescência das placas LSEC SIV que são facilmente identificadas sob MEV, evitando a membrana celular diretamente acima dos núcleos, que pode ser vista como uma protuberância sob a superfície do LSEC ajudará na precisão dos cálculos de densidade e porosidade da fenestração. Finalmente, a quantificação da densidade e frequência do diâmetro da fenestração LSEC fornece uma medição empírica das fenestrações e permite medições de alterações induzidas por doenças do envelhecimento, toxinas ou terapias. Após o procedimento de perfusão, o tecido pode ser processado para outras técnicas, como microscopia eletrônica de transmissão, para observar a ultraestrutura celular, a estrutura mitocondrial.

Também pode ser usado para histologia.