Um método padronizado para a Análise do fígado sinusoidal células endoteliais e Seus fenestrações por Microscopia Eletrônica de Varredura

O objetivo geral deste procedimento é analisar o endotélio sinusoidal hepático. Isso é realizado primeiramente isolando um fígado e perfundindo-o com fixador. Em seguida, o fígado é cortado em blocos e desidratado para preparação para microscopia eletrônica.

Em seguida, as amostras de fígado são metalizadas por pulverização e examinadas em microscópio eletrônico. Por fim, as micrografias eletrônicas são analisadas e os diâmetros e frequências das fenestrações, bem como a porcentagem de porosidade, são calculados. Em última instância, a microscopia eletrônica é utilizada para demonstrar alterações no endotélio sinusoidal hepático sob diversas condições.

Este método fornece-nos informações sobre a ultraestrutura e a morfologia dos vasos sanguíneos do fígado em seu endotélio. Pode também ser utilizado para examinar o rim e o cérebro da mesma maneira. Todos os procedimentos que envolvem o uso de animais são realizados de acordo com a legislação local. Este trabalho foi aprovado pelo Comitê de Bem-Estar Animal do Distrito de Saúde Local de Sydney.

Os procedimentos permitidos são descritos na documentação da licença do projeto e seguem diretrizes que garantem o bem-estar do animal em todos os momentos. Esta é uma cirurgia não sobrevivencial. Após preparar o fixador, de acordo com o protocolo descrito, aqueça o tampão de perfusão e o fixador a 35 a 37 graus Celsius.

Uma vez que o animal esteja anestesiado com uma única injeção intraperitoneal de cetamina e xilazina, avalie o nível de sedação por meio do reflexo de retirada da pata traseira e de um aperto na cauda. Em seguida, com tesoura de pontas rombas, faça uma incisão em Y no abdômen do animal para expor o fígado e a veia porta. Depois, amarre dois pontos muito frouxos ao redor da veia porta, um proximal ao fígado e o outro mais distal ao fígado.

Canule a veia porta com uma cânula intravenosa de tamanho apropriado. Em seguida, aperte os pontos para fixar a cânula. Agora, utilizando cinco a vinte mililitros de PBS aquecido a 37 graus Celsius, inicie a perfusão a uma pressão de 10 centímetros de H2O.

Evite que bolhas de ar entrem no fígado, pois isso produziria artefatos e pressão de ar excessiva, o que danificará o fígado; corte a veia cava abdominal e torácica para permitir que o tampão saia livremente do fígado. Isso evita alta pressão retrograda, danos ao fígado, células sinusoidais e endoteliais ou CCLs. Assim que o fígado estiver livre de sangue, substitua o PBS por fixador para microscopia eletrônica ou ME e realize a perfusão até que o fígado esteja endurecido e muito pálido.

Aproximadamente cinco minutos. Em seguida, com o bisturi, corte o fígado em blocos de um a dois milímetros cúbicos. Use fixador EM para pós-fixação.

Fixe o tecido a quatro graus Celsius por 24 a 72 horas. Em seguida, transfira o tecido para tampão de Catecolato de sódio 0,1 molar e armazene a quatro graus Celsius por até 12 meses para montar os espécimes para microscopia eletrônica de varredura ou MEV. Após desidratar as amostras de acordo com o protocolo descrito no texto, rotule a base dos suportes metálicos para MEV e aplique fita de carbono dupla-face na parte superior dos suportes sob um microscópio estereoscópico, visualize as amostras para identificar a superfície com os melhores sinusoides para MEV.

Posicione a amostra com a superfície escolhida voltada para cima sobre a superfície da fita de carbono no suporte e fixe-a firmemente ao suporte. Após realizar o revestimento por pulverização catódica e a MEV de acordo com o protocolo descrito, abra uma imagem no ImageJ e use uma barra de escala embutida na imagem para definir a escala, utilizando a ferramenta de polígono no ImageJ para traçar ao redor de toda a área plana do LSEC, incluindo regiões fenestradas e não fenestradas, excluindo quaisquer grandes fragmentos de detritos presentes na superfície celular que possam estar ocultando as fenestrações. Para medir o diâmetro das fenestrações, trace uma linha através do diâmetro mais longo de cada fenestração utilizando a ferramenta de linha.

Pressione M para medir a linha e D para desenhar permanentemente a linha sobre a imagem. Esta linha é definida como o diâmetro da fenestração e agora estará disponível na caixa de resultados do ImageJ. Meça todas as lacunas que forem orifícios maiores no citoplasma das LSEC acima de 250 nanômetros, bem como as fenestrações. Calcule a área das lacunas que não são circulares contornando-as e utilizando o ImageJ para calcular sua área; transfira os dados da caixa de resultados do ImageJ para uma planilha do Excel.

Para análises adicionais, utilize as seguintes fórmulas para realizar os cálculos de fenestração. O diâmetro médio de fenestração equivale à média de todos os diâmetros de fenestração. A área de fenestração equivale a pi r ao quadrado, onde R é calculado a partir dos diâmetros individuais de fenestração.

O percentual de porosidade equivale a sigma pi R ao quadrado dividido pela área total analisada em micrômetros, multiplicado por 100, excluindo da análise a área total das lacunas. Para apresentar os dados em publicações, inclua o diâmetro da fenestração com uma declaração confirmando que os diâmetros das bordas foram utilizados para definir as fenestrações, a frequência de fenestrações e a porosidade; inclua também uma declaração confirmando se as lacunas foram incluídas na análise, bem como um gráfico de distribuição de frequência do diâmetro das fenestrações, o número de blocos de fígado e imagens. A baixa magnificação por MEV revela uma superfície plana da amostra de fígado com uma área exposta suficientemente grande para observar muitos vasos hepáticos e sinusoides grandes, incluindo o trato portal e o centro ES, conforme mostrado aqui.

Garantir o posicionamento correto do fragmento de fígado no suporte de montagem é essencial para obter imagens nítidas dos sinusoides e da cápsula glistens, que cobre todos os detalhes dos sinusoides do fígado, devendo ser evitada. Por esse motivo, como mostrado aqui, uma maior ampliação permite a observação das fenestrações das LSEC. As lâminas de hepatócitos podem parecer vasos sanguíneos, mas características como a BLI auxiliam na orientação.

Esta figura demonstra que uma pressão elevada de perfusão pode causar artefatos, como grandes lacunas no endotélio, que se acredita serem provocadas pela coalescência das placas de SIV das LSEC, facilmente identificadas por MEV, evitando a membrana celular diretamente acima dos núcleos, que pode ser vista como uma saliência sob a superfície das LSEC, o que auxiliará na precisão dos cálculos de densidade e porosidade das fenestrações. Por fim, a quantificação do diâmetro, densidade e frequência das fenestrações das LSEC fornece uma medida empírica das fenestrações e permite avaliar alterações induzidas pelo envelhecimento, doenças, toxinas ou terapias. Após o procedimento de perfusão, o tecido pode ser processado para outras técnicas, como microscopia eletrônica de transmissão, para analisar a ultraestrutura celular e a estrutura mitocondrial.

Também pode ser utilizado para histologia.