Name: Um método padronizado para a Análise do fígado sinusoidal células endoteliais e Seus fenestrações por Microscopia Eletrônica de Varredura (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 38 s
Description: Aprenda a analisar células endoteliais sinusoidais hepáticas e suas fenestrações por microscopia eletrônica de varredura. Este método padronizado permite medir diâmetro, frequência e porosidade para estudar função hepática.

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Os autores não têm agradecimentos.

NOTA: Todos os procedimentos que envolvam a utilização de animais são realizados de acordo com a legislação local. Nosso trabalho é aprovado pela Comissão Distrital de Saúde Bem-Estar Animal da Sydney Local. Os procedimentos autorizados estão descritas na documentação da licença do projeto e seguir as orientações que garantam o bem-estar do animal em todos os momentos. Assegurar o cumprimento da legislação sobre experimentação animal do país onde o trabalho é realizado. 1. Protocolo para Preparando EM Fixative <ol><li> Para 100 ml de fixador, preparar paraformaldeído por adição de 2 g de paraformaldeído em pó a 25 ml de água destilada em um balão de Erlenmeyer de calor, a 65 ° C, agitando constantemente com um agitador magnético. NOTA: O glutaraldeído, paraformaldeído e tampão cacodilato de sódio são todas as substâncias perigosas e devem sempre ser manuseados em fumehood. </li><li> Aquece-se a 65 ºC durante 2 min, em seguida, deixa-se arrefecer. Se necessário, adicionar solução de hidróxido de sódio dropwise agitando para limpar solução completamente. NOTA: hidróxido de sódio é perigoso, manusear com cuidado. </li><li> Adicionar 10 ml de estoque de glutaraldeído grau EM, 50 ml de tampão de cacodilato de sódio 0,2 M e 2 g de sacarose e agita-se com um agitador magnético. Adicionar 2 ml de 1,0 M de CaCl2. </li><li> Ajustar a pH 7,4 antes da solução até perfazer 100 ml com água destilada. O fixador final contém de 2,5% de glutaraldeído, paraformaldeído a 2%, 2 mmol CaCl2, 2% de sacarose em tampão de cacodilato 0,1 M. Certifique-se de que a osmolaridade total é de 440 mOsmol / L. Use dentro de 24 horas de preparação. </li></ol> 2. Fixação de Perfusão do Fígado <ol><li> Tampão de perfusão quente e fixador de 35-37 ºC. A temperatura correcta do tampão exsanguinação e fixador ajuda a assegurar a integridade do tecido. </li><li> Anestesiar o animal com uma injecção intraperitoneal única de 50 mg / kg de cetamina e 5 mg / kg de xilazina. </li><li> Uma vez que o animal está sobanestesia profunda, avaliada pela retirada da pata traseira e cauda pitada, uma incisão Y é feito com uma tesoura sem corte terminou em abdômen do animal para expor a veia hepática e portal. NOTA: Certifique-se de que o equipamento está limpo para evitar a contaminação das amostras com microorganismos e detritos geral que será facilmente visto em SEM. </li><li> Amarrar duas suturas muito soltas em torno da veia porta proximal para o fígado, o outro mais distalmente para o fígado. </li><li> Canular a veia porta com uma cânula de tamanho apropriado IV (18 G para ratos, 22 G para ratos) suturas .Aperte para garantir cânula. </li><li> Começar a perfusão com solução salina tamponada com fosfato aquecido a 37 ° C, e a uma pressão de 10 cm de H 2 0. Entre 5 e 20 ml de PBS, é geralmente necessária para desangrar o fígado. NOTA: Não para permitir que as bolhas de ar a entrar no fígado através dos tubos ligados à cânula, como eles induzem artefactos secundárias a embolização e pressão; Danos nos hepatócitos, sinusoids e fenestrações LSEC ocorre se a pressão de perfusão é demasiado elevada. </li><li> Cortar a veia cava abdominal e torácica para permitir que o tampão para sair livremente a partir do fígado. Isso evita danos alta contra-pressão para LSECs. </li><li> Uma vez que o fígado é livre de sangue, substitua com PBS EM fixador e perfundir durante aproximadamente 5 minutos, até que o fígado é endurecido e muito pálido. </li><li> Descontinuar a perfusão e cortar o fígado fixado em 1-2 mm3 blocos usando um bisturi afiado. </li><li> Tecido pós-fix em EM fixador para 24-72 horas a 4 ºC. NOTA: Em geral, underfixation causa mais artefatos do que com excessiva fixação. </li><li> Mudar fixador seguinte período pós-correção para tampão cacodilato de sódio 0,1 M para armazenamento a 4 ºC. NOTA: As amostras armazenadas desta forma será preservado por um período significativo de tempo (até 12 meses), a fixação secundária no entanto oportuno e exame é recomendado para melhores resultados. </li></ol> 3. Agulha Perfusion NOTA: fixação da agulha é uma variante da fixação de perfusão que envolve a injecção de fixador directamente no tecido do fígado de biópsia. O objectivo é que o fixador para ser liberado através dos vasos sanguíneos, a fim de desangrar-los e expor todo o bloco de tecido para fixador. Cuidados devem ser tomados para manter a pressão de injecção de baixa pressão para evitar ferimentos 18,19. <ol><li> Remover um pequeno pedaço de fígado do animal ou objecto e enxaguar em solução salina para remover o sangue e detritos. </li><li> Desenhar a solução salina normal para a seringa equipada com uma agulha de calibre fino (tipicamente uma seringa de insulina). </li><li> Injectar a solução salina muito lentamente para o fígado até que o sangue é empurrado para fora do tecido. As injecções múltiplas pode ser necessária. </li><li> Desenhar o fixador EM de outra seringa equipada com uma agulha de calibre fino (tipicamente uma seringa de insulina). </li><li> Injectar o fixador muito lentamente para o fígado até que se torne difícil e tan na cor. Injecção múltiplas pode ser necessária. </li><li> Corte o fígado fixado em 1-2 mm3 blocos usando um bisturi afiado. Incubar em fixador EM para 24 - 72 h a 4 ° C. Lavar 3 vezes em tampão cacodilato de sódio 0,1 M antes de iniciar a fixação secundário. </li></ol> 4. Preparação para Microscopia Eletrônica de Varredura <ol><li> Lavar amostra 3 vezes em tampão de cacodilato de sódio 0,1 M. Para corrigir lipídios, pós fixar a amostra em 2% de tetróxido de ósmio em tampão cacodilato de sódio 0,1 M durante 2 h. NOTA: Completo de lavar roupa é muito importante como cross glutaraldeído e tetróxido de ósmio reagir e gerar artefatos em SEM. </li><li> Lavar as amostras em concentrações crescentes de etanol, para se iniciar a desidratação. Primeira lavagem em etanol a 50% durante 5 minutos; em seguida, 3 vezes durante 5 min com 70% de etanol; lavar três vezes durante 5 min com 90% de etanol; lavar duas vezes durante 5 min em etanol a 100%; e finalmente lavar duas vezes durante 10 min em etanol a 100% (crivo molecular). </li><li> Remover todo o etanol a partir das amostras<html> e substituir com hexametildissilazano (HMDS) em fumehood e deixe por 10 min. Remover HMDS a partir das amostras de tecidos e deixa-se evaporar. NOTA: HMDS é altamente higroscópico quando frio, portanto, permitir atingir a TA antes de usar pela etapa final desidratação. </li><li> Opcionalmente, montar as amostras imediatamente ou colocá-los em um dessecador até que esteja pronto para montar para SEM. </li></ol> 5. Montagem NOTA: montagem exemplar correto irá maximizar o número de sinusoids claramente delineados disponíveis para análise em MEV. <ol><li> Rotular a base dos metais tocos SEM e aplicar fita de carbono condutora dupla face para o topo da tocos. </li><li> Visualizar amostras usando um microscópio de dissecação para identificar a superfície com as melhores sinusóides para subsequente SEM. Coloque a superfície para cima sobre a superfície da fita de carbono do topo. </li><li> Espécimes da vara firmemente ao topo, as amostras estão agora prontas para revestimento por pulverização. </li></ol>ove_title &quot;&gt; 6. Revestimento NOTA: O revestimento da peça com uma fina película de metal condutor (ouro ou platina) em um recinto sputter coater o modelo e protege contra danos provenientes de um feixe de elétrons. Se o revestimento é muito grosso estruturas de interesse pode ser obscurecida. <ol><li> Coloque tocos na câmara de vácuo automática de revestidor por crepitação fina, para o modo de rotação e de revestimento por pulverização automático definido para 45 segundos. Use revestimento de platina para mais fino detalhamento, no entanto ouro também é adequado. </li><li> Aplicar uma fina camada de tinta de carbono para as superfícies externas das amostras de fígado montados, tomando cuidado para não revestir as superfícies sinusoidais. </li><li> Uma vez que as amostras são revestidas com platina e carbono tinta ter secado eles estão prontos para a observação sobre o SEM. As amostras podem ser armazenadas num exsicador. </li></ol> 7. Usando o Microscópio Eletrônico de Varredura <ol><li> Lugar espécimes em microscópio eletrônico de varredura e microscópio para retornar vácuo. &lt;/ Li&gt; <li> Usando procedimentos operacionais padrão microscópio para visualização de espécimes dando início a uma ampliação baixa, aumentando gradualmente a ampliação. </li><li> Certifique-se o microscópio é ajustado apropriadamente para trabalhar a distância, tamanho de ponto e astigmatismo. </li><li> Verifique se há integridade fixação. Se o LSEC é na maior parte livre de lacunas e contém fenestrations medição 30-250 nm de diâmetro isso geralmente indicam que a preparação de amostras foi bem sucedida. </li><li> Se os sinusoids estão cheios de lacunas ou desprovido de fenestrações a preparação da amostra não foi bem sucedida ou se houver patologia significativa. Neste caso, cortar a amostra com uma lâmina de barbear muito fina, e as superfícies de corte recoberto e analisados ​​por sinusóides fixos com sucesso. </li><li> Em aproximadamente 15.000-20.000 × ampliação seleccionar LSEC superfícies planas que estão livres de detritos com boa fixação e onde as fenestrações são claramente visíveis (contendo tipicamente pelo menos 10 fenestrações). </li><li> Excepto imagens de pelo menos 10 por sinusóides do fígado, a partir de diferentes áreas dos blocos, utilizando, pelo menos, dois blocos por fígado. Amostragem 10 micrografias a 15.000 - 20.000 × ampliação por animal é geralmente suficiente para a quantificação de fenestrações para ser representativa de todo o fígado. </li></ol> 8. Análise NOTA: O software ImageJ, que pode ser baixado gratuitamente a partir do NIH é utilizada para quantificar diâmetro fenestration e frequência ( <a href="http://imagej.nih.gov/ij">www.imagej.nih.gov/ij</a> ). <ol><li> Abrir imagem J e definir a escala usando a barra de escala embutido na imagem (Screen shot 1). </li><li> Usando a ferramenta de polígono em ImageJ, traço em torno de toda a área plana do LSEC incluindo áreas fenestrados e defenestrado. Não basta traçar os pratos perfurados, pois isso vai falsamente inflacionar porosidade. Excluir qualquer grandes peças de detritos que estão na superfície celular, que pode ser obscurifenestrations GN. </li><li> Para medir o diâmetro fenestration, traçar uma linha através do maior diâmetro de cada fenestration selecionando a ferramenta de linha, e pressionar &quot;m&quot; para medir a linha, e &quot;d&quot; (empate) para desenhar de forma permanente a linha na imagem. Esta linha é definido como o diâmetro fenestraï¿½o. O comprimento da linha de agora estará disponível na caixa de ImageJ de resultados (Screen shot 2). </li><li> Medir todos os espaços que são furos maiores no citoplasma LSEC superior a 250 nm, assim como fenestrações. As lacunas são muitas vezes artefatos que refletem má perfusão ou fixação, no entanto lacunas também pode ocorrer como resultado de uma doença e toxicidade. Os dados para as lacunas serão excluídos do cálculo dos parâmetros fenestration mais tarde na análise. </li><li> A área de lacunas que não são circulares deve ser calculada pelo traçado em torno das lacunas e calcular sua área em ImageJ. </li><li> Cole os dados da caixa de resultados em ImageJ em uma planilha do Excel para furtheanálise r. </li></ol> 9. Cálculos <ol><li> Média fenestration diâmetro = média de todos os diâmetros fenestration (não incluindo as lacunas, onde as lacunas são ≥ 250 nm). </li><li> Área Fenestração = πr 2, onde r, o raio, é calculado a partir do diâmetro fenestrações indivíduo (R = d / 2), não incluindo lacunas. </li><li> Porosidade (%) = (Σ (πr 2) Área total analisado / - Σ (área de hiatos =)) (2 ^ M)) x 100. </li><li> Frequência Fenestration = número total de fenestrações / (área total analisado-Σ (área de lacunas) (mm 2). </li></ol> 10. Apresentação de Dados Fenestration NOTA: Sempre que possível, publicações, incluindo a quantificação de dados fenestration deve incluir as seguintes informações <ol><li> Fenestration diâmetro, com uma declaração confirmando o que diâmetros de fronteira onde usado para definir fenestrations (tipicamenteentre 50-250 nm), Fenestração frequência (número / uM 2) e a porosidade (%). </li><li> Uma indicação que confirma se lacunas foram incluídos na análise, gráfico de distribuição de frequências de diâmetro fenestraï¿½o e o número de blocos, os fígados, imagens e fenestrações devem ser incluídos na análise. </li></ol>

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<li>Cogger, V. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperlipidemia+and+surfactants%3A+the+liver+sieve+is+a+link%5BTitle%5D)+AND+%22Atherosclerosis%22%5BJournal%5D)">Hyperlipidemia and surfactants: the liver sieve is a link.</a> Atherosclerosis. 189 (2), 273-281 (2006).</li>
<li>Cogger, V. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+oxidative+stress+on+the+liver+sieve%5BTitle%5D)+AND+%22J+Hepatol%22%5BJournal%5D)">The effects of oxidative stress on the liver sieve.</a> J Hepatol. 41 (3), 370-376 (2004).</li>
<li>Cogger, V. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+structured+illumination+microscopy+of+liver+sinusoidal+endothelial+cell+fenestrations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional structured illumination microscopy of liver sinusoidal endothelial cell fenestrations.</a> J Struct Biol. 171 (3), 382-388 (2010).</li>
<li>Braet, F., de Zanger, R., Seynaeve, C., Baekeland, M., Wisse, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+atomic+force+microscopy+study+on+living+skin+fibroblasts+and+liver+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Electron+Microsc%22%5BJournal%5D)">A comparative atomic force microscopy study on living skin fibroblasts and liver endothelial cells.</a> J Electron Microsc. 50 (4), 283-290 (2001).</li>
<li>Monkemoller, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+fenestrations+in+liver+sinusoidal+endothelial+cells+by+optical+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Chem+Chem+Phys%22%5BJournal%5D)">Imaging fenestrations in liver sinusoidal endothelial cells by optical localization microscopy.</a> Phys Chem Chem Phys. 16 (24), 12576-12581 (2014).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

A capacidade de medir de forma precisa e reprodutivelmente o estado do endotélio sinusoidal fígado é um passo importante na compreensão da biologia destas células altamente especializadas. Novas técnicas, como a microscopia de iluminação estruturada 32, microscopia de força atômica e 33 d-STORM (direto Stochastic Optical Reconstrucion Microscopia) 34 irá transmitir informações importantes sobre a morfologia destas células in vitro, mas SEM continua a ser a principal metodologia ...

As células endoteliais sinusoidais hepáticas (LSECs) são altamente diferenciadas, células endoteliais que revestem a parede da sinusóide hepática. LSECs são perfuradas com fenestrações que são não-diaphragmed, transcelular poros de 50-250 nm de diâmetro. Até 20% da superfície é coberta por LSECs fenestrações, que são geralmente em grupos de dezenas a centenas chamadas placas de peneira 1-3 (Figura 1). Fenestrações permitir a transferência de plasma e nanosubstrates entre o sangue e hepatócitos, a criação de um sistema de ultrafiltração é altamente eficiente. Fenestrações são estruturas dinâmicas - tanto o seu tamanho e / ou o número pode ser alterado em resposta a vários estados fisiológicos, de drogas, e doença. Por exemplo, fenestrations são maiores no jejum do que no estado alimentado 4; 2-di-iodoamphetamine aumenta número fenestration; 5,6 e uma redução no tamanho e número de fenestrações por célula ocorre em envelhecimento e muitos estados doença 13/7 </sup&gt;. A medição precisa do tamanho e número de fenestrações é importante para a compreensão de como LSEC morfologia é influenciado por várias doenças, tóxicos e estados fisiológicos; o seu impacto sobre a função hepática; e para o desenvolvimento de moduladores fenestraï¿½o intervenções terapêuticas 1. O estudo de fenestrações é difícil. O diâmetro das fenestrações se encontra abaixo da resolução da microscopia óptica convencional, de modo que anteriormente apenas a observação por microscopia de electrões, tanto em tecido do fígado ou cultivadas LSECs intactos tem sido possível. O microscópio eletrônico de varredura (SEM) tem sido mais frequentemente utilizado para estudar tamanho fenestration, a frequência ea porosidade (a percentagem de membrana LSEC que é perfurado por fenestrations) porque SEM permite a observação de grandes áreas de superfície endotelial e medição de milhares, se não dezenas de milhares de fenestrações. Apesar de sua utilidade, os resultados que são relatados a partir de estudos baseados SEM-paraLSEC parâmetros como o tamanho fenestraï¿½o, número, frequência e a porosidade pode variar amplamente na literatura (Quadro 1). Fenestrações e pratos perfurados são estruturas frágeis que contrato, quebram, dilatam ou se aglutinam durante a preparação de amostras, processamento, assim, o cuidado é necessário para preservar a sua integridade. A pressão de perfusão elevada 14; osmolaridade incorreto do fixador e buffers 15; fixação inadequada ou fixação do tempo; e velocidade de desidratação pós-fixação e secagem são todas as áreas de processamento para SEM que podem produzir produtos manufacturados que interferem com a preservação da ultraestrutura (Figura 2). Perda de fenestrações (&#39;defenestration&#39;) e fenestraï¿½o encolhimento pode ocorrer como resultado de má fixação, resultando na redução de diâmetro e porosidade fenestraï¿½o célula. Métodos para melhorar a conservação de amostras para análise em MEV foram descritos anteriormente 15-17 e será discutidoaqui com dicas adicionais sobre como melhorar a preservação da amostra. Os principais objectivos da preservação espécime são para remover o sangue dos sinusóides, de modo que a superfície do LSEC pode ser visualizado e para evitar danos ou LSEC de alta pressão ou fixação retardada. Perfusão do fígado inteiro de fixador através da veia portal é o método preferido para a fixação hepática. Tal como descrito em pormenor noutro 16,18 perfusão deve ser efectuada a baixa pressão (por exemplo, 10 cm de H 2 0) para evitar artefactos relacionados com a pressão de perfusão e os danos para a LSEC, tipicamente manifestada como grandes lacunas dentro da membrana celular. No entanto, muitas vezes fixação razoável pode ser obtido utilizando a agulha de perfusão de biópsias de fígado de seres humanos e animais, tal como descrito em detalhe noutro local 19. Esta técnica envolve a injeção diretamente fixador para o tecido até que o sangue é liberado para fora da amostra eo tecido é firme e fixo. Fixação de amostras para a microscopia de electrões tem de ser perfORMED tão rapidamente quanto possível a seguir à interrupção do fluxo de sangue para evitar alterações ultra-estruturais que ocorrem como resultado dos processos fígados autoliticas extremamente rápidas. Nós também apresentamos um método de análise de imagem que minimiza a inclusão de artefactos, e padroniza a medição das fenestrações. Variação na seleção de senóides para micrografias, análise de imagens de artefatos, e medição de área celular para porosidade e fenestration frequência levaram a grandes discrepâncias nos resultados publicados. A abordagem padronizada de avaliação e medida de fenestrações e os requisitos mínimos para a apresentação dos dados não tenham sido claramente abordada na literatura anteriormente 4,10,20-31.

<table><tbody><tr><td>25% de grau EM Glutaraldeído</td><td>ProSciTech</td><td>C001</td><td>Armazene o estoque a -20 C até que seja necessário, evite recongelar</td></tr><tr><td>o pó de paraformaldeído</td><td>Sigma Aldrich</td><td>158127</td> Sempre prepare o pó de cacodilato de sódio <td>fresco de paraformaldeído</td></tr><tr><td></td><td>Sigma Aldrich</td><td>C0250</td><td>Prepare o estoque de 0,2 M, pH 7,4 dissolvendo o pó em dH2O, usado principalmente a 0,1 M preparando a diluição 1:2</td></tr><tr><td>Cloreto de cálcio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C1016</td><td>Prepare 1 M CaCl2dissolvendo o pó em dH2O</td></tr><tr><td>Trróxido de ósmio</td><td>ProSciTech</td><td>C011</td><td>Lave as ampolas em ácido fraco antes de usar para evitar contaminação. Prepare 2% de estoque em garrafa de vidro</td></tr><tr><td>Etanol- Absolute</td><td>Sigma Aldrich</td><td>459836&nbsp;</td><td>100% de etanol deve ser de alta qualidade e armazenado com peneira molecular</td></tr><tr><td>Outros graus de etanol</td><td>Labtech</td><td>EL5</td><td>Prepare etanoles graduados com dH2O</td></tr><tr><td>Hexametildisilazane</td><td>Sigma Aldrich</td><td>52619&nbsp;</td><td>Deixe atingir a temperatura ambiente antes de usar</td></tr><tr><td>Cânulas</td><td>Terumo</td><td>TSROX1832C, TSROX2225C, TSROX2419C</td><td>18 G é adequado para a maioria dos ratos, 22 G é adequado para a maioria dos camundongos, mas é bom ter alguns 24 G à mão no caso de camundongos muito pequenos</td></tr><tr><td>Fita de carbono condutora</td><td>ProSciTech</td><td>IA0201</td><td></td></tr><tr><td>Tinta de carbono</td><td>ProSciTech</td><td>I003</td><td></td></tr><tr><td>Cetamina</td><td></td><td></td><td>Deve ser obtido sob licença</td></tr><tr><td>Xylazine</td><td></td><td></td><td>Deve ser obtido sob licença</td></tr><tr><td>Peneira Molecular</td><td>Sigma Aldrich</td><td>208647</td><td>Remove a água do etanol 100%</td></tr></tbody></table>

um método padronizado para a análise do fígado sinusoidal células endoteliais e seus fenestrações por microscopia eletrônica de varredura

A Standardized Method for the Analysis of Liver Sinusoidal Endothelial Cells and Their Fenestrations by Scanning Electron Microscopy

As células endoteliais sinusoidais do fígado são a porta de entrada para o fígado, suas fenestrações transcelulares permitem a transferência desimpedida de substâncias pequenas e dissolvidas do sangue para o parênquima hepático para metabolismo e processamento. As fenestrações são estruturas dinâmicas - tanto seu tamanho quanto / ou número podem ser alterados em resposta a vários estados fisiológicos, drogas e doenças, tornando-as um alvo importante para a modulação. Uma compreensão de como a morfologia do LSEC é influenciada por várias doenças, estados tóxicos e fisiológicos e como essas alterações afetam a função hepática requer uma medição precisa do tamanho e do número de fenestrações. Neste artigo, descrevemos as técnicas de fixação e processamento de microscopia eletrônica de varredura usadas em nosso laboratório para garantir a preparação de amostras reprodutíveis e uma interpretação precisa. Os métodos incluem fixação por perfusão, fixação secundária e desidratação, preparação para o microscópio eletrônico de varredura e análise. Finalmente, fornecemos um método passo a passo para análise de imagem padronizada que beneficiará todos os pesquisadores da área.

Visualização inicial em baixa ampliação por microscopia eletrônica de varredura revela uma superfície plana da amostra do fígado com uma área exposta grande o suficiente para observar muitas grandes vasos hepáticos e sinusóides (Figura 1A). Assegurar a colocação de bloco de fígado correta na montagem stub é essencial para a obtenção de imagens claras dos sinusóides e cápsula do fígado do Glisson deve ser evitado por este motivo (Figura 1B). O aumento da ampliação permite inspecção mais ...

A célula endotelial sinusoidal do fígado fenestrada é um sistema de filtro biologicamente importante que é altamente influenciado por várias doenças, toxinas e estados fisiológicos. Essas alterações afetam significativamente a função hepática. Descrevemos métodos para a padronização da medição do tamanho e número de fenestrações nessas células.

Um método padronizado para a Análise do fígado sinusoidal células endoteliais e Seus fenestrações por Microscopia Eletrônica de Varredura

Liver sinusoidal endothelial cells are the gateway to the liver, their transcellular fenestrations allow the unimpeded transfer of small and dissolved ...

O objetivo geral deste procedimento é analisar o endotélio sinusoidal hepático. Isso é realizado primeiramente isolando um fígado e perfundindo-o com fixador. Em seguida, o fígado é cortado em blocos e desidratado para preparação para microscopia eletrônica.Em seguida, as amostras de fígado são metalizadas por pulverização e examinadas em microscópio eletrônico. Por fim, as micrografias eletrônicas são analisadas e os diâmetros e frequências das fenestrações, bem como a porcentagem de porosidade, são calculados. Em última instância, a microscopia eletrônica é utilizada para demonstrar alterações no endotélio sinusoidal hepático sob diversas condições.Este método fornece-nos informações sobre a ultraestrutura e a morfologia dos vasos sanguíneos do fígado em seu endotélio. Pode também ser utilizado para examinar o rim e o cérebro da mesma maneira. Todos os procedimentos que envolvem o uso de animais são realizados de acordo com a legislação local. Este trabalho foi aprovado pelo Comitê de Bem-Estar Animal do Distrito de Saúde Local de Sydney.Os procedimentos permitidos são descritos na documentação da licença do projeto e seguem diretrizes que garantem o bem-estar do animal em todos os momentos. Esta é uma cirurgia não sobrevivencial. Após preparar o fixador, de acordo com o protocolo descrito, aqueça o tampão de perfusão e o fixador a 35 a 37 graus Celsius.Uma vez que o animal esteja anestesiado com uma única injeção intraperitoneal de cetamina e xilazina, avalie o nível de sedação por meio do reflexo de retirada da pata traseira e de um aperto na cauda. Em seguida, com tesoura de pontas rombas, faça uma incisão em Y no abdômen do animal para expor o fígado e a veia porta. Depois, amarre dois pontos muito frouxos ao redor da veia porta, um proximal ao fígado e o outro mais distal ao fígado.Canule a veia porta com uma cânula intravenosa de tamanho apropriado. Em seguida, aperte os pontos para fixar a cânula. Agora, utilizando cinco a vinte mililitros de PBS aquecido a 37 graus Celsius, inicie a perfusão a uma pressão de 10 centímetros de H2O.Evite que bolhas de ar entrem no fígado, pois isso produziria artefatos e pressão de ar excessiva, o que danificará o fígado; corte a veia cava abdominal e torácica para permitir que o tampão saia livremente do fígado. Isso evita alta pressão retrograda, danos ao fígado, células sinusoidais e endoteliais ou CCLs. Assim que o fígado estiver livre de sangue, substitua o PBS por fixador para microscopia eletrônica ou ME e realize a perfusão até que o fígado esteja endurecido e muito pálido.Aproximadamente cinco minutos. Em seguida, com o bisturi, corte o fígado em blocos de um a dois milímetros cúbicos. Use fixador EM para pós-fixação.Fixe o tecido a quatro graus Celsius por 24 a 72 horas. Em seguida, transfira o tecido para tampão de Catecolato de sódio 0,1 molar e armazene a quatro graus Celsius por até 12 meses para montar os espécimes para microscopia eletrônica de varredura ou MEV. Após desidratar as amostras de acordo com o protocolo descrito no texto, rotule a base dos suportes metálicos para MEV e aplique fita de carbono dupla-face na parte superior dos suportes sob um microscópio estereoscópico, visualize as amostras para identificar a superfície com os melhores sinusoides para MEV.Posicione a amostra com a superfície escolhida voltada para cima sobre a superfície da fita de carbono no suporte e fixe-a firmemente ao suporte. Após realizar o revestimento por pulverização catódica e a MEV de acordo com o protocolo descrito, abra uma imagem no ImageJ e use uma barra de escala embutida na imagem para definir a escala, utilizando a ferramenta de polígono no ImageJ para traçar ao redor de toda a área plana do LSEC, incluindo regiões fenestradas e não fenestradas, excluindo quaisquer grandes fragmentos de detritos presentes na superfície celular que possam estar ocultando as fenestrações. Para medir o diâmetro das fenestrações, trace uma linha através do diâmetro mais longo de cada fenestração utilizando a ferramenta de linha.Pressione M para medir a linha e D para desenhar permanentemente a linha sobre a imagem. Esta linha é definida como o diâmetro da fenestração e agora estará disponível na caixa de resultados do ImageJ. Meça todas as lacunas que forem orifícios maiores no citoplasma das LSEC acima de 250 nanômetros, bem como as fenestrações. Calcule a área das lacunas que não são circulares contornando-as e utilizando o ImageJ para calcular sua área; transfira os dados da caixa de resultados do ImageJ para uma planilha do Excel.Para análises adicionais, utilize as seguintes fórmulas para realizar os cálculos de fenestração. O diâmetro médio de fenestração equivale à média de todos os diâmetros de fenestração. A área de fenestração equivale a pi r ao quadrado, onde R é calculado a partir dos diâmetros individuais de fenestração.O percentual de porosidade equivale a sigma pi R ao quadrado dividido pela área total analisada em micrômetros, multiplicado por 100, excluindo da análise a área total das lacunas. Para apresentar os dados em publicações, inclua o diâmetro da fenestração com uma declaração confirmando que os diâmetros das bordas foram utilizados para definir as fenestrações, a frequência de fenestrações e a porosidade; inclua também uma declaração confirmando se as lacunas foram incluídas na análise, bem como um gráfico de distribuição de frequência do diâmetro das fenestrações, o número de blocos de fígado e imagens. A baixa magnificação por MEV revela uma superfície plana da amostra de fígado com uma área exposta suficientemente grande para observar muitos vasos hepáticos e sinusoides grandes, incluindo o trato portal e o centro ES, conforme mostrado aqui.Garantir o posicionamento correto do fragmento de fígado no suporte de montagem é essencial para obter imagens nítidas dos sinusoides e da cápsula glistens, que cobre todos os detalhes dos sinusoides do fígado, devendo ser evitada. Por esse motivo, como mostrado aqui, uma maior ampliação permite a observação das fenestrações das LSEC. As lâminas de hepatócitos podem parecer vasos sanguíneos, mas características como a BLI auxiliam na orientação.Esta figura demonstra que uma pressão elevada de perfusão pode causar artefatos, como grandes lacunas no endotélio, que se acredita serem provocadas pela coalescência das placas de SIV das LSEC, facilmente identificadas por MEV, evitando a membrana celular diretamente acima dos núcleos, que pode ser vista como uma saliência sob a superfície das LSEC, o que auxiliará na precisão dos cálculos de densidade e porosidade das fenestrações. Por fim, a quantificação do diâmetro, densidade e frequência das fenestrações das LSEC fornece uma medida empírica das fenestrações e permite avaliar alterações induzidas pelo envelhecimento, doenças, toxinas ou terapias. Após o procedimento de perfusão, o tecido pode ser processado para outras técnicas, como microscopia eletrônica de transmissão, para analisar a ultraestrutura celular e a estrutura mitocondrial.Também pode ser utilizado para histologia.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

O estudo do fígado sinusoidal células endoteliais (SCEE) devem ser realizados com células primárias provenientes do animal como não existem linhas celulares. Este método baseia-se na digestão de fígado e centrifugação diferencial para SEC purificação para a cultura subseqüente e experimentação.

Endocitose em Fígado vivo seguidos de purificação de células do fígado por perfusão de fígado

Recrutamento de leucócitos para o fígado ocorre dentro dos canais especializados dos sinusóides hepáticos, que são revestidas por células endoteliais sinusoidais hepáticas únicas. Microscopia de contraste de fase de recrutamento de leucócitos através do endotélio sinusoidal hepática humana em condições de tensão de cisalhamento fisiológico pode facilitar a elucidação dos mecanismos moleculares que estão na base deste processo.

Um fluxo de Adesão Ensaio para o Estudo de Recrutamento de leucócitos para hepáticas humanas senoidais endotélio sob condições de estresse de cisalhamento

O objetivo do presente protocolo é obter alta viabilidade e alto rendimento de hepatócitos e células endoteliais sinusoidais do fígado. Isso é realizado pela perfusing o fígado com uma solução de colagenase tipo IV através da veia portal, seguida por centrifugação diferencial para obter hepatócitos e células endoteliais sinusoidais.

Purificação de hepatócitos e células endoteliais sinusoidais de fígado de rato perfusão

O objetivo do presente protocolo é identificar populações de células endoteliais linfáticas dentro do fígado usando marcadores descritos. Nós utilizamos colagenase IV e DNase e um suave de picagem de tecido, combinado com citometria de fluxo, para identificar uma população distinta de células endoteliais linfáticas.

Digestão do fígado murino para um fluxo Cytometric análise de células endoteliais linfáticas

Aqui, nós apresentamos um protocolo para a coloração da imunofluorescência para observar diretamente as pilhas endothelial da aorta do rato. Esta técnica é útil ao estudar o phenotype celular e molecular de pilhas endothelial em testes padrões de fluxo diferentes e no desenvolvimento da aterosclerose.

Usando a mancha da imunofluorescência da cara do en para observar diretamente pilhas endothelial vasculares

Este protocolo descreve um método de rotina para o uso de microscopia eletrônica de varredura em bloco serial (SBF-SEM), uma poderosa técnica de imagem 3D. A aplicação bem sucedida do SBF-SEM depende de técnicas adequadas de fixação e coloração de tecidos, bem como cuidadosa consideração das configurações de imagem. Este protocolo contém considerações práticas para a totalidade deste processo.

Microscopia eletrônica de varredura de blocos de bloco serial (SBF-SEM) de amostras de tecido biológico

Aqui, apresentamos como gerar um modelo de peixe-zebra associado ao Carcinoma Hepatocelular (CHC) associado à doença hepática gordurosa não alcoólica (DHGNA) para estudar o impacto do excedente de colesterol no microambiente hepático e na paisagem das células imunes.

Análise do Microambiente Hepático Durante a Progressão Precoce do Carcinoma Hepatocelular Associado à Doença Hepática Gordurosa Não Alcoólica em Peixe-Zebra.

Aqui descrevemos e demonstramos um protocolo para o isolamento da célula endotelial do fígado do camundongo primário (LSEC). O protocolo é baseado na perfusão da colagem hepática, purificação celular não parenquimal por centrifugação de baixa velocidade e seleção de contas magnéticas CD146. Também fenótipo e caracterizamos esses LSECs isolados usando citometria de fluxo e microscopia eletrônica de varredura.

Isolamento e Caracterização de Células Endoteliais Hemorlicais do Fígado Primário do Rato

O presente protocolo otimiza os métodos de perfusão/decelularização hepática in situ e microscopia de dois fótons para estabelecer uma plataforma confiável para visualizar a dinâmica do remodelamento da matriz extracelular (MEC) durante a esteato-hepatite não alcoólica (EHNA).

Imagem 3D da Matriz Extracelular Hepática em Modelo de Esteatohepatite Não Alcoólica em Camundongos

Um protocolo simples e abrangente para adquirir detalhes tridimensionais de locais de contato de membrana entre organelas em hepatócitos do fígado ou células em outros tecidos.

Caracterização tridimensional de Sítios de Contato Interorganelle em Hepatócitos usando Microscopia eletrônica de seção serial

Descrevemos aqui o enriquecimento de pequenas vesículas extracelulares derivadas de tecido de câncer hepático através de um método otimizado de ultracentrifugação diferencial.

Um método de enriquecimento para pequenas vesículas extracelulares derivadas do tecido de câncer de fígado

Aprenda a analisar células endoteliais sinusoidais hepáticas e suas fenestrações por microscopia eletrônica de varredura. Este método padronizado permite medir diâmetro, frequência e porosidade para estudar função hepática.

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Um método padronizado para a Análise do fígado sinusoidal células endoteliais e Seus fenestrações por Microscopia Eletrônica de Varredura

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