Simples e Testes Olfativo para Ratos assistido por computador
15 de junho de 2015
Apresentamos um teste olfativo simples e imparcial em camundongos. Com este protocolo, a discriminação olfativa, a preferência, a evitação e a sensibilidade a um novo odor em comparação com a água podem ser avaliadas em sessões comportamentais únicas. Este método é indicado para um único experimentador e a análise é baseada no processamento de vídeo assistido por computador.
O objetivo geral do experimento a seguir é testar a discriminação olfativa inata, a preferência olfativa ou a evitação e a sensibilidade olfativa em camundongos. Isso é conseguido expondo o camundongo a um novo atrativo ou apelante, e a um odor neutro, que é a água. Enquanto isso, uma câmera de vídeo grava a sessão comportamental.
Em seguida, o vídeo é analisado na Imagem J usando as macros fornecidas para obter o tempo gasto nos parâmetros de odor e água. Os resultados mostram o comportamento de preferência ou evitação aos odores em comparação com a água entre os diferentes genótipos com base na análise assistida por computador post hoc. A principal vantagem do teste olfativo sobre o uso de arena e olfativa dedicadas é que ele usa uma arena familiar e, portanto, é de conclusão rápida e configuração simples.
Além disso, ele usa hardware barato demonstrando que o procedimento será Emmanuel Abry, de acordo com o aluno do meu laboratório. Para este experimento, use machos de três a cinco meses de idade, C 57 pretos, seis tipos selvagens e camundongos transgênicos. Esta demonstração usa duas linhas de nocaute e controles de ninhada.
Para as arenas experimentais, use gaiolas de rato esterilizadas limpas com três centímetros de cama. Em seguida, prepare a configuração da câmera. Posicione-o 58 centímetros acima do chão da gaiola em um tripé personalizado.
Faça algumas marcas no balcão para indicar onde deve estar a posição da gaiola. Para uma imagem central, configure a câmera para gravar um vídeo de 320 por 240 pixels a aproximadamente 15 quadros por segundo. Para preparar o testador, tenha concentrados de cada perfume armazenados em solvente sempre que possível.
Para o teste de preferência, faça uma solução de 10% de peso por volume de manteiga de amendoim em óleo de amendoim. Para o teste de evitação, use uma solução de ácido metilbutírico a 98%. Para o teste de sensibilidade, colete urina feminina de um camundongo da mesma cepa um a dois dias antes do teste.
Contenha uma fêmea com a barriga acima da grade da gaiola e colete gotas de sua urina em um prato de plástico. Colete amostras de várias fêmeas para normalizar. Para variabilidade individual, puxe todas as amostras em um tubo de 1,5 mililitro e armazene-o a menos 20 graus Celsius.
Para começar a habituar os animais, coloque um em uma gaiola limpa e deixe-o explorar. Por cinco minutos, o ambiente da gaiola de teste deve ser igual ao da gaiola inicial. Repita a fase de habituação uma vez em cada dia de teste, quando o período de habituação terminar, inicie a gravação e pipete 60 microlitros de um perfume agradável.
Neste caso, manteiga de amendoim em uma parede na parede oposta, pipete a mesma quantidade de água. Um perfume neutro, aplique as gotas cerca de 10 centímetros acima de cada parede. Agora deixe o animal explorar por dois minutos e, em seguida, pare a gravação e devolva o mouse à sua gaiola doméstica.
Repita o processo com cada mouse a ser testado. Sempre usando gaiolas de teste novas. Três a cinco dias Depois de realizar todos os testes de preferência, realizar o teste de evasão usando uma nova gaiola de teste.
Para cada mouse, execute o teste de evitação. Como o teste de atração, substitua apenas o aroma agradável pelo cheiro de evitação, que é o ácido metilbutírico dois. Para o teste de sensibilidade, uma gaiola pode ser reutilizada entre as tentativas para o mesmo camundongo.
Portanto, marque o lado da água da gaiola e prepare-se para limpar as paredes curtas com papel embebido em etanol a 70% entre os testes. No dia do experimento, faça quatro concentrações da urina com a série de diluição de dez vezes. Usando água bidestilada como o teste de evitação, habitue cada animal à sua gaiola de teste por cinco minutos.
Em seguida, exponha cada camundongo à urina na diluição mais alta no início, que é de um a 10.000. Durante o registo, aplique a diluição da urina na gaiola de teste e aplique água na parede oposta. Como feito para outros testes, deixe o animal explorar.
Por dois minutos. Depois disso, transfira o animal para uma gaiola de rato limpa. Depois de todos os animais terem atingido a concentração mais baixa, limpar todas as paredes da gaiola de ensaio e repetir o ensaio em cada ratinho utilizando a urina mais concentrada seguinte.
Continue este processo até que a urina pura seja testada. Depois de coletar todos os dados para um experimento, abra os vídeos na imagem J para ajuste e detalhes de processamento dos quais são fornecidos no protocolo de texto usando os protocolos descritos. Duas linhas de nocaute diferentes.
Os grupos B e C foram comparados com os controles de cama do grupo A. Um teste t de Student não direcional com variância igual ou desigual compara o tempo gasto entre o odor e a água dentro dos genótipos. Compare o comportamento entre os genótipos usando uma inovação unidirecional. Ambos os grupos experimentais, B e C, não mostraram preferência pelo odor atraente No teste de evitação, a resposta ao odor repulsivo de dois ácidos metilbutírico foi a esperada para os grupos A e B, mas o grupo C não apresentou comportamento de evitação a esse odor.
No teste de sensibilidade, o limiar de atração foi obtido subtraindo-se o tempo gasto com a urina do tempo gasto com água, a urina preferida à água em uma diluição de um a 1000. Enquanto ambos os grupos experimentais, B e c precisaram de uma concentração 100 vezes maior para mostrar uma preferência. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em algumas horas se for executada corretamente, seguindo esse procedimento, outros métodos, como aprendizado e extinção olfativa, podem ser realizados para investigar a plasticidade e o aprendizado olfativo.
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Visão Geral
Este estudo apresenta um teste olfativo direto projetado para ratos, permitindo a avaliação da discriminação olfativa, preferência, evitação e sensibilidade a um odor novo em comparação com água. O método é eficiente para um único experimentador e depende de análise de vídeo assistida por computador.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Análise Comportamental
- Teste Olfativo
Fundamentos
- O experimento visa avaliar comportamentos olfativos inatos em ratos.
- Envolve exposição a um odor novo e um controle neutro (água).
- O comportamento é gravado e analisado para determinar preferências ou aversões.
- Este método utiliza um ambiente familiar para os ratos, aumentando a confiabilidade dos resultados.
Objetivo do Estudo
- Avaliar a discriminação olfativa em ratos.
- Avaliar preferência olfativa e comportamentos de evitação.
- Medir a sensibilidade olfativa a odores novos.
Métodos Utilizados
- Os ratos são expostos a um atrativo ou apelante novo e água.
- As sessões comportamentais são gravadas usando uma câmera de vídeo.
- A análise de vídeo é realizada usando o software Image J com macros.
- Os resultados são analisados para determinar o tempo gasto com cada odor.
Principais Resultados
- Os resultados indicam comportamentos de preferência ou evitação em relação aos odores em comparação com a água.
- As respostas comportamentais variam entre diferentes genótipos.
- O método permite configuração e conclusão rápidas dos experimentos.
- A análise assistida por computador melhora a precisão dos resultados.
Conclusões
- O teste olfativo é um método confiável para avaliar o comportamento olfativo em ratos.
- Usar uma arena familiar simplifica o processo experimental.
- Esta abordagem pode ser benéfica para vários estudos comportamentais em neurociência.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
Olfactory dysfunction is an early biomarker in neurodegenerative disease models, making reliable rodent olfaction assays critical for target validation in CNS drug discovery. This method enables rapid, reproducible assessment of innate odor perception and sensitivity without food/water restriction, supporting high-throughput screening of genetic or pharmacological interventions. By quantifying behavioral responses to attractants, aversants, and sensitivity thresholds, it provides mechanistic de-risking for targets implicated in olfactory network dysfunction.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by linking genotype to olfactory behavior, enabling functional validation of targets in olfactory pathways.
- Operational Value: Uses familiar environments and minimal habituation, reducing stress-induced variability and improving assay reproducibility across genotypes.
- Predictive Value: Detects altered odor preference or avoidance in knockout models, supporting early de-risking of targets associated with neurodegenerative or psychiatric indications.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative time-spent metrics via computer-assisted ImageJ analysis, enabling objective comparison of odor responses across experimental groups.
- Operational Value: Requires only standard cages, bedding, scents, and a video camera, allowing scalable implementation in discovery labs without specialized equipment.
- Predictive Value: Supports dose-response characterization in sensitivity testing, informing lead optimization by defining effective concentration ranges for odorant-evoked behaviors.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Aligns with human olfactory deficits as prodromal biomarkers, enhancing translational relevance of mouse models in neurodegenerative disease research.
- Operational Value: Enables longitudinal sensitivity testing through serial dilution series, supporting progression tracking in preclinical efficacy studies.
- Predictive Value: Identifies genotype-specific thresholds for odor detection, aiding in patient stratification and biomarker-aligned target selection.
Pipeline & Workflow Integration
This method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to lead identification, providing behavioral readouts that inform go/no-go decisions prior to compound investment.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by measuring innate olfactory discrimination and preference, clarifying gene function in sensory processing pathways.
- Screening: Delivers standardized, quantitative outputs (time in odor vs. water zones) that enable reliable comparison of compound or genotype effects.
- Analytics: Computer-assisted analysis provides reproducible, threshold-based measurements that support statistical comparison across treatment conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by modeling olfactory sensitivity loss, a feature predictive of clinical neurodegeneration.
- Enterprise Reuse: Reusable across multiple test types (preference, avoidance, sensitivity) and mouse strains, functioning as a platform capability rather than a single-use assay.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in olfactory circuit function.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility through fixed exposure times, blinded video analysis, and internal water controls.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling rapid triage of targets using low-cost, high-reproducibility behavioral phenotyping.
- Portfolio Impact: Informs risk-adjusted advancement decisions by identifying targets whose modulation rescues or recapitulates olfactory phenotypes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in rodent handling, behavioral observation, and basic video tracking software (ImageJ).
- Dependent on consistent lighting, camera positioning (58 cm above cage), and odorant preparation (e.g., peanut butter oil dilutions, urine dilution series).
- Necessitates cross-team standardization of habituation protocols and blind analysis to minimize operator bias.
- Adaptation across model systems requires validation of odorant relevance (e.g., species-specific pheromones or aversants).
- Practical limitation: Assay sensitivity depends on accurate odorant delivery and cleanup between trials to prevent cross-contamination, particularly in sensitivity testing.
