Simples e Testes Olfativo para Ratos assistido por computador

O objetivo geral do experimento a seguir é testar a discriminação olfativa inata, a preferência ou evitação olfativa e a sensibilidade olfativa em camundongos. Isso é realizado expondo o camundongo a um atrativo ou agente atrativo novo e a um odor neutro, que é a água. Enquanto isso, uma câmera de vídeo registra a sessão comportamental.

Em seguida, o vídeo é analisado no Image J utilizando as macros fornecidas para obter os parâmetros de tempo gasto com o odor e com a água. Os resultados mostram o comportamento de preferência ou aversão a odores em comparação com a água entre diferentes genótipos, com base na análise pós-hoc assistida por computador. A principal vantagem do teste olfativo em relação ao uso de uma arena e olfação dedicadas é que ele utiliza uma arena familiar, sendo, portanto, de conclusão rápida e montagem simples.

Além disso, utiliza hardware de baixo custo, demonstrando o procedimento que será realizado por Emmanuel Abry, aluno de graduação no meu laboratório. Para este experimento, utilize camundongos machos de três a cinco meses de idade, C57 black, seis de tipo selvagem e camundongos transgênicos. Esta demonstração utiliza duas linhagens com genes knockout e controles provenientes da mesma ninhada.

Para as arenas experimentais, utilize gaiolas esterilizadas e limpas para camundongos com três centímetros de camação. Em seguida, prepare o equipamento da câmera. Posicione-a a 58 centímetros acima do piso da gaiola, em um suporte personalizado de tripé.

Faça algumas marcas na bancada para indicar a posição em que a gaiola deve ficar. Para uma imagem central, configure a câmera para gravar um vídeo de 320 por 240 pixels a aproximadamente 15 quadros por segundo. Para preparar o indivíduo em teste, tenha concentrados de cada odor armazenados em solvente sempre que possível.

Para o teste de preferência, prepare uma solução de 10% peso por volume de manteiga de amendoim em óleo de amendoim. Para o teste de evitação, tenha uma solução de 98% de ácido butírico metílico. Para o teste de sensibilidade, colete urina de fêmeas de um camundongo da mesma linhagem um a dois dias antes do teste.

Restrinja uma fêmea com o ventre acima da grade da gaiola e colete gotas de sua urina em um recipiente de plástico. Colete amostras de várias fêmeas para normalização. Devido à variabilidade individual, reúna todas as amostras em um tubo de 1,5 mililitro e armazene a menos 20 graus Celsius.

Para iniciar a habituação dos animais, coloque um deles em uma gaiola limpa e deixe-o explorar. Durante cinco minutos, o ambiente da gaiola de teste deve ser semelhante ao da gaiola de origem. Repita a fase de habituação uma vez em cada dia de teste; quando o período de habituação terminar, inicie a gravação e pipete 60 microlitros de um odor agradável.

Neste caso, coloque manteiga de amendoim em uma parede e, na parede oposta, pipete a mesma quantidade de água. Com um odor neutro, aplique as gotas aproximadamente a 10 centímetros de altura em cada parede. Deixe agora o animal explorar por dois minutos, depois interrompa a gravação e devolva o camundongo à sua gaiola de origem.

Repita o processo com cada camundongo a ser testado. Sempre utilizando novas gaiolas de teste. Três a cinco dias após realizar todos os testes de preferência, realize o teste de evitação usando uma nova gaiola de teste.

Para cada camundongo, realize o teste de evitação. Como no teste de atração, substitua apenas o odor agradável pelo odor de evitação, que é o ácido dois metil butírico. Para o teste de sensibilidade, uma mesma gaiola pode ser reutilizada entre ensaios para o mesmo camundongo.

Marque, então, o lado da água da gaiola e prepare-se para limpar as paredes curtas com papel embebido em etanol 70% entre os ensaios. No dia do experimento, prepare quatro concentrações da urina por meio de uma série de diluições dez vezes consecutivas. Utilizando água bidestilada, como no teste de aversão, habitue cada animal à sua gaiola de teste por cinco minutos.

Em seguida, exponha cada camundongo à urina na diluição mais alta inicialmente, que é de um para 10.000. Durante a gravação, aplique a diluição de urina à gaiola de teste e aplique água à parede oposta. Como feito em outros testes, permita que o animal explore.

Durante dois minutos. Posteriormente, transfira o animal para uma gaiola limpa para camundongos. Após todos os animais terem sido expostos à menor concentração, limpe todas as paredes da gaiola de teste e repita o teste em cada camundongo utilizando a urina com a próxima concentração mais elevada.

Continue este processo até que a urina pura seja testada. Após coletar todos os dados de um experimento, abra os vídeos no ImageJ para ajustes e detalhes de processamento, cujas instruções são fornecidas no protocolo descrito no texto. Duas linhagens diferentes de knockout.

Os grupos B e C foram comparados ao grupo controle feito com cama. Um teste T de Student não direcional com variância igual ou desigual compara o tempo gasto entre o odor e a água dentro dos genótipos. Compare o comportamento entre genótipos utilizando uma ANOVA unidirecional. Ambos os grupos experimentais, B e C, não mostraram preferência pelo odor atrativo. No teste de evitação, a resposta frente ao odor repulsivo do ácido dois metil butírico foi a esperada para os grupos A e B, mas o grupo C não exibiu comportamento de evitação a esse odor.

No teste de sensibilidade, o limiar de atração foi obtido subtraindo-se o tempo gasto com urina do tempo gasto com água, preferindo-se a urina em relação à água numa diluição de um para 1000. Enquanto ambos os grupos experimentais, B e C, precisaram de uma concentração 100 vezes maior para demonstrar preferência. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em algumas horas, se for executada corretamente; após esse procedimento, outros métodos, como aprendizado olfativo e extinção, podem ser realizados para investigar a plasticidade olfativa e o aprendizado.