Motor e hipocampo aprendizagem espacial Dependente e Avaliação de Memória de Referência em um rato transgénico modelo da doença de Alzheimer com AVC

O objetivo geral desses testes comportamentais é avaliar a função motora, bem como o desempenho no aprendizado espacial e na memória em um novo modelo comórbido de rato para doença de Alzheimer e acidente vascular cerebral. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área da demência, como a forma pela qual a patologia do acidente vascular cerebral e da doença de Alzheimer interagem, produzindo um fenótipo com possível déficit motor acentuado e declínio cognitivo acelerado. A principal vantagem dessas técnicas é que elas permitem testar uma ampla gama de funções cerebrais, sendo ao mesmo tempo fáceis de realizar, economicamente eficientes e adequadas para testes repetidos em pontos temporais posteriores.

As implicações dessa técnica estendem-se à prevenção da demência após acidente vascular cerebral, pois compostos preventivos inovadores podem ser testados quanto ao seu potencial de amenizar o fenótipo comportamental comórbido. Para começar, posicione um espelho em um ângulo de 45 graus abaixo de um aparato de cilindro previamente montado. Em seguida, fixe uma câmera de vídeo em um tripé e posicione-a a uma distância de aproximadamente 50 centímetros do aparato.

Verifique se todo o diâmetro do cilindro no espelho pode ser visualizado pela câmera. Em seguida, escolha uma rata acclimatada e, em um quadro branco, anote o número do animal e as informações adicionais do ensaio. Coloque este quadro na frente do espelho e, então, pressione gravar na câmera de vídeo.

Continue pegando o rato pela base da cauda e colocando-o no cilindro. Em seguida, fixe a tampa do equipamento e remova a placa branca para que ela não obstrua mais o espelho. Após a remoção da placa branca, prossiga para filmar o animal por cinco minutos, período que constitui um único ensaio.

Após esse período, interrompa a gravação, retorne o rato à sua gaiola de alojamento e limpe o cilindro com toalhas de papel e água. Em seguida, repita os passos descritos anteriormente mais duas vezes, totalizando três ensaios por rato. Uma vez coletados os dados de todos os ratos, importe os arquivos da câmera para um programa de edição de vídeo e prossiga com a quantificação do número de contatos com os quatro membros, conforme descrito no protocolo textual.

Primeiro, posicione duas unidades de prateleiras a aproximadamente 100 centímetros de distância uma da outra, em frente a uma parede preta. Em seguida, use fita adesiva para fixar as extremidades de uma viga de madeira previamente adquirida nas prateleiras, de modo que haja aproximadamente um metro de madeira sem suporte entre elas. Depois, coloque uma câmera de vídeo sobre um tripé e posicione-a de forma que a câmera capture todo o comprimento da viga.

Prossiga escolhendo uma rata que tenha passado por uma sessão de treinamento em caminhada sobre trilha e registre seu número e informações adicionais do ensaio em um quadro branco. Ao finalizar, prenda o quadro branco na parede atrás da trilha. Em seguida, coloque a gaiola de origem do animal e um tubo de enriquecimento ambiental, que servem como uma fila motivadora na qual a rata pode entrar imediatamente após atravessar a prancha, em uma das extremidades da trilha.

Em seguida, pressione o botão de gravação na câmera de vídeo. Imediatamente após, pegue o rato pela base da cauda e coloque-o na extremidade oposta da barra, sem a gaiola e o tubo. Grave o animal até que ele atravesse com sucesso todo o comprimento da madeira elevada, o que indica o fim do ensaio.

Se a rata fizer uma pausa no meio do percurso sobre a viga, toque suavemente na sua cauda para estimular o movimento. Após o animal completar a tarefa, mova a sua gaiola de origem para a outra extremidade da viga. Em seguida, altere o número da tentativa no quadro branco e repita o procedimento conforme descrito anteriormente.

Depois de registradas todas as tentativas dos animais, importe os arquivos da câmera para um programa de edição de vídeo e analise os dados relevantes sobre o passo, escorregões das patas e quedas, conforme descrito no protocolo textual. Comece fixando uma câmera de vídeo acima do centro de uma piscina circular vazia. Em seguida, delimite os quatro quadrantes do tanque colocando fita adesiva na borda da piscina e alinhe-os corretamente com o contorno do tanque no programa de software de rastreamento.

Em seguida, encha o tanque com água até uma profundidade de 36 centímetros e adicione tinta preta não tóxica até que o líquido fique opaco, garantindo que a plataforma não seja visível abaixo da superfície da água e melhorando a visualização de ratos brancos. Uma vez que a piscina tenha sido preparada, rodeie-a com superfícies de parede lisas. Em seguida, prepare pistas espaciais cortando quatro formas de cores diferentes em cartolina.

Em seguida, fixe uma forma em cada uma das paredes associadas às posições norte, sul, leste e oeste da piscina. Para realizar um experimento de aprendizado espacial, prossiga colocando uma plataforma circular no quadrante sudoeste da piscina. No programa de computador correspondente, verifique se esta estrutura está alinhada com uma área designada para a plataforma no quadrante.

Prossiga segurando um rato pela base da cauda e colocando-o suavemente em um local de início designado na água, junto à parede da piscina. Assim que o animal estiver no tanque, afaste-se rapidamente do seu campo de visão e sinalize a outro experimentador para iniciar o software de rastreamento. Permita que o rato nade até localizar e subir na plataforma.

Nesse momento, o outro pesquisador deve interromper o ensaio no computador. Deixe o animal permanecer sobre a plataforma por 30 segundos. Se a rata não encontrar a plataforma dentro do tempo determinado para o ensaio, neste caso 90 segundos, guie o animal até a estrutura e deixe-o permanecer ali por 30 segundos.

Em seguida, levante a rata pela base da cauda e retire-a do labirinto, colocando-a sobre uma toalha pendurada no braço. Repita este procedimento mais três vezes por animal, com um intervalo entre ensaios de 20 minutos, de modo que cada rata complete um total de quatro ensaios.

Após a conclusão do experimento de aprendizado espacial, remova a plataforma da piscina para iniciar os testes de sonda. No software, verifique se a posição anterior da plataforma, no quadrante sudoeste, permanece definida. Em seguida, introduza uma rata na piscina.

Colocando-o na água ao longo da parede do tanque. Como antes, saia imediatamente do campo de visão do animal e instrua outro pesquisador a iniciar o software de rastreamento. Ao final do teste de sonda de 30 segundos, segure o animal pela base da cauda, retire-o do tanque e, em seguida, coloque-o sobre um braço coberto com uma toalha.

Repita este procedimento uma semana depois. Após todos os animais terem realizado os testes de aprendizado espacial e os testes de sonda, analise os dados conforme descrito no protocolo textual. Os dados de uso dos quatro membros obtidos no aparato de cilindro foram coletados de ratos transgênicos APP21 três dias antes e sete e vinte dias após a indução de acidente vascular cerebral.

Quando padronizados e comparados ao valor que representa o uso igualitário dos quatro membros, a linha vermelha aqui, esses resultados indicam que os ratos com comorbidade não demonstram estatisticamente déficit nos quatro membros. Resultados semelhantes foram obtidos para animais selvagens com ou sem acidente vascular cerebral e para ratos transgênicos APP21 isoladamente. No entanto, os animais com comorbidade apresentaram diferenças na função motora associada à locomoção.

Dados da tarefa de travessia em travecoletados para essas ratas sete dias antes e 21 dias após a indução do acidente vascular cerebral revelam um aumento significativo no número de passos necessários para atravessar a prancha, o que não foi observado em outros grupos. Os resultados do labirinto aquático de Morris também revelam déficits de memória em animais comorbidos, conforme evidenciado por este gráfico que mostra a mudança percentual na latência, ou seja, o tempo que os animais levam para alcançar o quadrante da piscina onde a plataforma antes estava, entre o primeiro e o segundo ensaio de sonda. Aqui, ratas APP21 com acidente vascular cerebral levam significativamente mais tempo no segundo ensaio para entrar no quadrante-alvo.

Uma diferença que não foi demonstrada nem pelos ratos transgênicos isoladamente nem pelos animais selvagens com acidente vascular cerebral. Isso indica que os animais com comorbidades apresentam déficit de memória de longo prazo. Ao tentar realizar este procedimento, é importante manter todas as variáveis tão consistentes quanto possível durante e entre as sessões de teste e criar um ambiente livre de estresse para os animais.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como avaliar o desempenho motor e cognitivo em modelos de ratos de demência pós-AVC.