Name: Isolamento de Frações Sub-nuclear Viral Replication Compartimento enriquecidas de Adenovirus-infectados células normais Humanos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 22 s
Description: Aprenda a isolar compartimentos de replicação viral de células humanas infectadas por adenovírus usando gradiente de velocidade. Este método simples permite estudar mecanismos moleculares da replicação do genoma viral e interações hospedeiro-patógeno.

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Este trabalho foi financiado por doações do CONACyT-SEP (SEP-2008-84582; CB-2011-01-168497) e Promep-SEP para R.A.G.; P.H. recebeu uma bolsa de estudos do CONACyT (447442).

1. HFF Cultura de Células e-infecção Anúncio <ol><li> Propagar o vírus Ad5 WT em monocamadas de células HEK-293 e título como unidades formadoras fluorescentes (UFF) em células HFF como anteriormente descrito 8. </li><li> Cresça fibroblastos de prepúcio humano (HFF) em 10 ml de DMEM / 10% de Soro Fetal Bovino (FBS) em cultura estéreis placas de 100 mm a 37 ° C e 5% de CO2 num incubador humidificado. Determinar o número de células utilizando uma câmara de Neubauer por contagem de células nas quatro conjuntos de 16 quadrados. O número de células por mL é obtida através do cálculo da média do número de células nas quatro conjuntos de 16 quadrados e multiplicando este número por 10 4. Para cada tempo de pós-infecção incluídos na etapa 1.3, usar 1 x 10 7 células HFF. </li><li> Mock-infectar ou infectar células HFF com adenovírus tipo 5 (Ad5) do tipo selvagem (WT) (H5pg4100 8) em 100 mm placas de cultura de tecido com 1 ml de Ad5 em DMEM por prato a uma MOI de 30 Foco Forming Unit, ou FFU , por célula. Incubar por 2 horas em ahumidified incubadora de cultura de células a 37 ° C e 5% de CO 2, de balanço cuidadosamente os pratos a cada 15 minutos para assegurar uma distribuição homogénea do inoculo de vírus sobre as células. Após este tempo, remover o meio e adicionar DMEM fresco suplementado com FBS a 10% e incuba-se durante 16, 24 ou 36 h numa incubadora de cultura de células humidificada a 37 ° C e 5% de CO 2. Prossiga para a etapa 2.1. </li></ol> 2. Preparação de fracções Sub-nuclear Enriquecido com Adenovírus RC <ol><li> Colheita Ad5-infectadas ou células HFF falsamente infectadas com um raspador celular e recolher as células em tubos de centrífuga estéreis. Determinar o número de células como no passo 1.2. Use 1 x 10 7 células para cada pós-infecção de tempo especificado no passo 1.3. </li><li> Centrifugar as células a 220 xg, 4 ºC por 5 min. </li><li> Ressuspender o sedimento celular em PBS arrefecido em gelo (NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, 10 mM de Na 2 HPO 4 1,8 mM e KH 2 PO 4). Lave o peletizado de célulass 3 vezes com 5 ml de PBS gelado por lavagem. Para este efeito, centrifugar as células a 220 xg, a 4 ° C durante 5 minutos, decantar e desprezar o sobrenadante (SN), e ressuspender o sedimento de células por pipetagem suave. </li><li> Para romper a membrana de plasma, ressuspender o sedimento celular em 700 uL de tampão hipotónico gelado (HEPES 10 mM pH 7,9, KCl 10 mM, MgCl 1,5 mM, 2, 0,5 mM DTT, 20 μ g / ml de fluoreto de fenilmetilsulfonilo (PMSF) , uma mistura de cisteína, serina, treonina e inibidores da aspartil protease, incluindo 10 μ g / ml de inibidor de tripsina pancreática bovina, 10 μ g / ml de pepstatina A e 10 μ g / ml de N-acetil-L-leucil-L-leucil-L- -argininal) e deixar que as células inchar em gelo durante 3 h. </li><li> Lyse as células utilizando um homogeneizador com uma folgada Um pilão tipo teflon. Realize 80 dounce derrames e monitor de amostras a cada 20 golpes por microscopia de campo claro para assegurar que todas as células foram lisadas, mas que têm núcleos not sido danificado ou rompido. </li><li> Centrifuga-se o homogeneizado de células a 300 xg, 4 ° C durante 5 min. Armazenar o SN como a fracção citoplasmática a -20 ° C em um tubo de centrífuga. </li><li> Para remover os detritos celulares a partir de núcleos, ressuspender o sedimento em 750 μ l de solução de 1 (S1) (0,25 M de sacarose, 10 mM de MgCl 2 20 ug / ml de PMSF, uma mistura de cisteína, serina, inibidores da treonina e da protease de aspartilo que incluem 10 μ g / ml de inibidor de tripsina pancreática bovina, 10 μ g / ml de pepstatina A e 10 μ g / ml de N-acetil-L-leucil-L-leucil-L-argininal) e camada sobre um volume igual de solução de 2 (S2) (0,35 M de sacarose, 0,5 mM de MgCl 2, 20 μ g / ml de PMSF, uma mistura de cisteína, serina, inibidores da treonina e da protease de aspartilo que incluem 10 μ g / ml de inibidor de tripsina pancreática bovina, 10 μ g / ml de pepstatina A e 10 μ g / ml de N-acetil-L-leucil-L-leucil-L-argininal). Centrifuge a 1.400 xg, 4 ºC por 5 min. </li><li> Descartar o SN utilizando uma micropipeta. Evite perturbar o sedimento. </li><li> Ressuspender o sedimento contendo núcleos isolados em 750 μ l de S2. </li><li> Para isolar frações subnucleares enriquecidos com adenovírus RC (RCF), sonicate núcleos ressuspenso com um banho de ultra-som, usando dois pulsos 5 min, ou até que todos os núcleos são lisadas como observado por microscopia de campo claro. Use gelo no banho de ultra-sons, conforme necessário para manter as amostras a, ou abaixo de 4 ° C. </li><li> Camada os núcleos sonicadas sobre um volume igual de solução de 3 (S3) (0,88 M de sacarose, 0,5 mM de MgCl2) e centrifuga-se a 3000 xg, 4 ° C durante 10 min. Guarde a 1,5 ml sobrenadante como a fracção nucleoplasmic (NPL) a -70 ºC. Ressuspender o sedimento em 700 μ l de S2 e armazenar como RCF a -70 ºC. </li></ol> 3. As análises de Western Blot RCF NOTA: Para a análise Western Blot de NPL e RCF frações set de lado 640 ul para Npl e 300 μ l para RCF do volume total obtido na etapa 2.11. <ol><li> Misturar 15 μ l de cada fracção subnuclear em tampão Laemmli 2x (4% de SDS, 20% glicerol, 10% de 2-mercaptoetanol, 0,004% de azul de bromofenol, Tris-HCl 0,125 M pH 6,8) e fervura a 95 ºC durante 5 min. Coloque as amostras em uma electroforese de sódio dodecil 10% sulfato-poliacrilamida gel (SDS-PAGE) em gel de desnaturação e de proteínas separadas por 1,5 h, a 20 miliamperes (mA). </li><li> Proteínas transferir por Eletroblotting durante 1,5 horas a 400 mA para polivinilideno (PVDF) membranas. </li><li> Bloco de membrana durante 2 horas à temperatura ambiente a partir de leite seco sem gordura a 3% em PBS. </li><li> Incubar O / N a 4 ºC com o anticorpo primário contra proteína E2A de ligação a DNA viral (B6-8 9) a uma diluição de 1: 500 em leite seco PBS / 0,3% desnatado. </li><li> Membrana Lavar 3 vezes com PBS / 0,1% Tween 20 durante 10 min. </li><li> Incubar a membrana com um rato anti IgG secundáriotibody acoplado a peroxidase de rábano (HRP) a uma diluição de 1: 10.000 em PBS durante 2 horas à temperatura ambiente. </li><li> Lava-se a membrana 3 vezes com PBS / 0,1% Tween 20 durante 10 min. </li><li> Desenvolver a membrana usando quimioluminescência aumentada e filmes de raios-X. </li></ol> 4. Detecção de ADN viral no RCF NOTA: Para o isolamento de ADN a partir de ambas as fracções de morosidade e RCF, utilizar 210 μ l para Npl e 100 μ l para RCF do volume total obtido na etapa 2.11. <ol><li> Incubar fracções sub-nucleares durante 1 h a 55 ºC, com 1 mg / ml de proteinase K e 0,5% de Tween 20. </li><li> Inactivar a proteinase K por incubação das amostras durante 10 min a 95 ° C. </li><li> Centrifugar as amostras a 20.000 xg, à temperatura ambiente durante 2 min. </li><li> Recolher o SN. Precipitar o ADN com 1/10 de volume de acetato de sódio 3M e um volume de isopropanol, O / N a 4 ° C. </li><li> Centrifugar as amostras a 20.000 xg, à temperatura ambiente durante 10 min. </li><li> Descarte o u SNcantar uma micropipeta. Lava-se a pastilha com etanol a 70% e centrifuga-se a 20000 xg, 4 ° C durante 5 min. </li><li> Ressuspender o ADN em 10 μ l de 10 mM de Tris-HCl a pH 7,4 </li><li> Quantificar ADN utilizando um espectrofotómetro, medindo a densidade óptica (DO) a 260 nm. </li><li> Para amplificar o ADN viral, utilizar 100 ng de ADN de cada fracção subnuclear numa reacção de PCR utilizando polimerase de ADN de Taq em 25 μ l de volume de reacção com iniciadores que permitem a amplificação de uma região no interior da unidade de transcrição tardia principal, a partir do nucleótido 7273 de nucleotídeo 7353 (81 pb) (Fw: GAGCGAGGTGTGGGTGAGC; Rv: GGATGCGACGACACTGACTTCA). Use as seguintes condições de ciclos: desnaturação inicial durante 3 min a 95 ºC, seguido por 20 ciclos de amplificação (1 min a 95 ° C, recozimento durante 1 minuto a 62 ° C e extensão durante 30 s a 72 ° C) e um passo final de extensão para 3 min a 72 ºC. </li><li> Executar o produto de PCR em géis de agarose a 2%, a 90 V. mancha com etídiobrometo em 0,5 μ g / ml de concentração final e visualizar o ADN para corroborar o enriquecimento do ADN viral no RCF. Lidar com brometo de etídio com extremo cuidado e certifique-se sempre usar luvas, como este composto é um potente mutagênico. Descarte brometo de etídio de acordo com as diretrizes institucionais. </li></ol> 5. tarde Viral Detecção de mRNA em RCF NOTA: Para o isolamento do RNA a partir de ambas as frações NPL e RCF, use 640 μ l para Npl e 300 μ l para RCF do volume total obtido na etapa 2.11. <ol><li> Isolar o ARN a partir de fracções subnucleares usando Trizol de acordo com as instruções do fabricante. Ressuspender o RNA em 50 μ l de DEPC (diethilpyrocarbonate) tenha sido tratada com água. </li><li> Quantificar o ARN utilizando um espectrofotómetro para medir a densidade óptica a 260 nm (cerca de 3 μ g são obtidos). Armazenar o ARN em 50 ng / ul de aliquotas a -70 ° C. </li><li> Verifique RNA purificadopara a ausência de contaminação com ADN através da realização de uma reacção de controlo na ausência de PCR de transcriptase reversa (RT), utilizando-se 5 ng de ARN total e as condições do ciclo descritas no passo 4.9. <ol><li> Se a contaminação de ADN não está ausente amplicão deve ser produzido. Se a contaminação de ADN está presente, incubar as amostras com 10 U de ADNase I, 10 U de inibidor de RNase, 0,1 M de Tris-HCl pH 8,3, 0,5 M de KCl e 15 mM de MgCl2 durante 30 min a 37 ºC. Prossiga para a re-isolar RNA como no passo 5.1. </li></ol></li><li> Para analisar ARNm viral associado a RCF, ampliada 100 ng de ARN a partir de cada fracção subnuclear por RT-PCR utilizando iniciadores desenhados para detectar ARNm tardio adenoviral de diferentes famílias de genes (Tabela 1). <ol><li> Para a transcrição reversa (RT) a 100 ng de ARN, a partir de cada fracção subnuclear numa reacção de RT utilizando enzima M-MuLV RT em 20 μ l de volume de reacção durante 1 hora a 42 ° C e 10 min a 70 ºC. </li><li> Para a amplificação, usar 1μ l do ADNc em reacções de PCR, como no passo 4.9. Use as seguintes condições de ciclos: desnaturação inicial durante 3 min a 95 ºC, seguido por 25 ciclos de amplificação (1 min a 95 ° C, recozimento durante 1 minuto à temperatura especificada no Quadro 1 e extensão durante 30 s a 72 ºC) e um etapa de extensão final de 3 min a 72 ºC. </li></ol></li><li> Executar os produtos de RT-PCR em géis de agarose a 2%, em géis de 90 V. mancha com brometo de etídio a 0,5 μ g / ml de concentração final e visualizar a corroborar associação ARNm tardio virai para o RCF. Pega brometo de etídio, tal como indicado no passo 4.10. </li></ol> 6. Imunofluorescência Visualização de RCF NOTA: Carry-out este procedimento sob uma câmara de fluxo laminar para evitar a contaminação das amostras com as partículas de poeira e filtrar todas as soluções antes de usar. <ol><li> Spot 5 uL da fracção RCF obtidos no passo 2.10 directly em uma lâmina revestida de silano. </li><li> Deixe o local seco durante cerca de 5 min à temperatura ambiente. </li><li> Re-hidratado por lentamente e indiretamente pipetando 500 μ l de PBS em uma queda ao lado do local RCF e deixá-lo fluir pela inclinação do slide. Escorra o excesso de PBS de lado. </li><li> Bloquear, cobrindo a amostra com 500 μ l de PBS / 5% de albumina de soro bovino (BSA) durante 2 horas à temperatura ambiente. </li><li> Lave o slide 3 vezes por suavemente e indiretamente pipetando 500 l μ da PBS sobre a amostra. Incline o slide para drenar o excesso de PBS. </li><li> Incubar a amostra com o anticorpo primário contra proteína E2A de ligação a DNA viral (B6-8 9) a uma diluição de 1: 500 em PBS durante 2 horas à temperatura ambiente. Cobrir a amostra manchada com 20 μ l da solução de anticorpo e incuba-se numa câmara húmida, para evitar a secagem. </li><li> Lava-se a amostra 3 vezes com PBS / 0,02% de Tween 20 e, indirectamente, por suavemente pipetando 500 μ l de PBS para a amostra. Incline o slide para drenar o exsolução de lavagem cesso. </li><li> Incubar as amostras com rato anticorpo secundário IgG anti acoplado a um fluoróforo que é excitada a 488 nm, a uma diluição de 1: 2000 em PBS, durante 1 hora a 4 ºC. Cobrir a amostra manchada com 20 μ l da solução de anticorpo e incuba-se numa câmara húmida, para evitar a secagem. </li><li> Lava-se a amostra 3 vezes com PBS / 0,02% de Tween 20 e, indirectamente, por suavemente pipetando 500 μ l de PBS para a amostra. Incline o slide para drenar o excesso de solução de lavagem. </li><li> Cobrir a amostra manchada sobre a lâmina com uma lamela utilizando 2 μ l de PBS / glicerol a 10% como meio de montagem. Selo com clara unha polonês e armazenar al -20 ºC. </li><li> Analisar as amostras utilizando um microscópio de fluorescência, com uma objectiva 63x e uma Abertura Numérica 1,4 (NA) num comprimento de onda de 488 nm. </li></ol>

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<li>Castillo-Villanueva, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Mre11+Cellular+Protein+Is+Modified+by+Conjugation+of+Both+SUMO-1+and+SUMO-2%2F3+during+Adenovirus+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22ISRN+Virology%22%5BJournal%5D)">The Mre11 Cellular Protein Is Modified by Conjugation of Both SUMO-1 and SUMO-2/3 during Adenovirus Infection.</a> ISRN Virology. 2014, 14(2014).</li>
<li>Morris, S. J., Scott, G. E., Leppard, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus+late-phase+infection+is+controlled+by+a+novel+L4+promoter%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Adenovirus late-phase infection is controlled by a novel L4 promoter.</a> J. Virol. 84, 7096-7104 (2010).</li>
<li>Wright, J., Leppard, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+adenovirus+5+L4+promoter+is+activated+by+cellular+stress+response+protein+p53%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">The human adenovirus 5 L4 promoter is activated by cellular stress response protein p53.</a> J. Virol. 87, 11617-11625 (2013).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

A fim de elucidar os mecanismos moleculares que governam a regulação das atividades celulares pela infecção viral, entender a composição e as atividades associadas ao CR seria fundamental. Portanto, para fazer uma análise detalhada do CR, estabelecemos um sistema livre de células que aproveita o tamanho e a composição bioquímica dessas estruturas induzidas por vírus, para isolar frações subnucleares enriquecidas com RC usando um procedimento simples que se baseia em gradientes de velocidade com almofadas de sacarose. As ...

Os adenovírus contêm um genoma de ADN de cadeia dupla que replicam no núcleo da célula infectada. Quando o ADN virai entra no núcleo, que se localiza junto a PML corpos nucleares 1. Após expressão do gene precoce viral, a arquitetura nuclear é reorganizada de forma dramática, induzindo a formação de microambientes virais, denominado de Compartimentos replicação viral (RC) 2. Desde adenovirus (Ad) RC são os locais onde a replicação viral genoma e expressão de genes virais final têm lugar, eles fornecem um ambiente para o recrutamento de todos os fatores virais e celulares necessários que participam nestes processos. Curiosamente, uma variedade de proteínas celulares responsáveis ​​pela resposta antiviral celular, tais como a resposta a danos no ADN, a resposta imune inata e supressão tumoral são co-optou por esses sítios virais 2. Cubos reguladoras Assim, Ad RC pode ser considerado que promovem a replicação viral eficiente enquanto concomitantemente regulação doresposta antiviral celular, indicando que estas estruturas são fundamentais para a compreensão das interacções vírus-hospedeiro de células. No entanto, os mecanismos moleculares da formação de RC, a sua composição e as suas actividades são mal compreendidos. RC adenoviral, bem como RC de outros vírus de ADN que se replicam no núcleo não estão associadas a membranas, em contraste com RC citoplasmática 3. Além disso, estas estruturas induzida por vírus são susceptíveis de ser inteiramente constituída por proteínas e ácidos nucleicos. RC formado nas células infectadas com os vírus de ARN (usualmente denominado fábricas virais) foram isolados, aproveitando a sua localização citoplásmica e ligada à membrana de estado, o que facilitou a sua morfológica detalhada, a caracterização funcional e bioquímica 4. Para nosso conhecimento, RC viral nuclear não tenham sido isolados, talvez devido à complexidade da arquitectura nuclear e ausência de m intranuclearesembranes que facilitem o seu isolamento. O estudo se baseou em vez de microscopia de imunofluorescência, FISH e microscopia eletrônica de transmissão. No entanto, apesar de complicações inerentes a isolar estruturas subnucleares, outros domínios nucleares, tais como nucléolos e Corpos de Cajal foram isoladas antes de 5,6. Desde nucléolos e Rc são ambas compostas de proteínas e ácidos nucleicos, e tem um diâmetro entre 0,5 - 5 mm, a hipótese de que RC também devem ser passíveis de isolamento. Por conseguinte, a fim de caracterizar mais precisamente a composição molecular e funções associadas a RC, foi estabelecido um novo método para isolar fracções enriquecidas com subnucleares RC. Para este fim, preparado de fracções sub-nuclear utilizando gradientes de velocidade e almofadas de sucrose semelhantes aos procedimentos usados ​​para isolar nucléolos 7 ou outros domínios nucleares 6 e estabelecido um sistema isento de células, que permite o estudo da composição molecular e de actividades associadasRC. Essa técnica deve, portanto, fazer avançar a compreensão das interações celulares vírus-hospedeiro e representa uma ferramenta poderosa que devem também facilitar a análise detalhada de RC de outros vírus que se replicam no núcleo e induzir a formação de compartimentos de replicação de dimensões semelhantes às formada em adenovirus- As células infectadas, tais como, vírus do herpes, vírus de papiloma ou poliomavírus.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>12100-046</td><td>Quente em 37 &ordm; C banho-maria antes do uso</td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino</td><td>Gibco</td><td>12484-028</td><td></td></tr><tr><td>Sacarose, Ultra Pure</td><td>Research Organics</td><td>0928S</td><td>Prepare uma solução estoque de 2,55 M e armazene a 4 &ordm; </td></tr><tr><td>Homogeneizador C Dounce</td><td>Kontess Glass Company</td><td>884900-0000</td><td></td></tr><tr><td>Branson 1800 Banho Ultrassônico</td><td>Branson</td><td>Z769533&nbsp; SIGMA</td><td>Ligue 15 min antes de usar.</td></tr><tr><td>Anticorpo secundário anti-rato IgG1 de cabra, conjugado Alexa Fluor 488</td><td>Life Technologies</td><td>A-21121</td><td>Use a uma diluição de 1:2.000 em</td></tr><tr><td>lâminas PBS Silane-Prep</td><td>Sigma</td><td>S4651-72EA</td><td>Aberto em um gabinete de fluxo laminar</td></tr><tr><td>SuperSignal West Pico Substrato quimioluminescente</td><td>Pierce ThermoScientific</td><td>34080</td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento de frações sub-nuclear viral replication compartimento enriquecidas de adenovirus-infectados células normais humanos

Isolation of Viral Replication Compartment-enriched Sub-nuclear Fractions from Adenovirus-infected Normal Human Cells

Durante a infecção de células humanas por adenovírus (Ad), o núcleo da célula hospedeira é dramaticamente reorganizado, levando à formação de microambientes nucleares através do recrutamento de proteínas virais e celulares para locais ocupados pelo genoma viral. Esses locais, chamados de compartimentos de replicação (RC), podem ser considerados domínios nucleares induzidos por vírus, onde o genoma viral é localizado e proteínas virais e celulares que participam da replicação, transcrição e processamento pós-transcricional são recrutadas. Além disso, proteínas celulares envolvidas na resposta antiviral, como proteínas supressoras de tumor, componentes de resposta a danos no DNA (DDR) e fatores de resposta imune inata também são cooptados para CR. Embora os CR pareçam desempenhar um papel crucial para promover um ciclo de replicação eficiente e produtivo, uma análise detalhada de sua composição e atividades associadas não foi feita. Para facilitar o estudo do RC adenoviral e potencialmente de outros vírus de DNA que se replicam no núcleo da célula, adaptamos um procedimento simples baseado em gradientes de velocidade para isolar o Ad RC e estabelecemos um sistema livre de células passível de conduzir estudos morfológicos, funcionais e composicionais dessas estruturas subnucleares induzidas por vírus, bem como estudar seu impacto nas interações hospedeiro-célula.

Uma vez que os compartimentos de replicação virai (RC) são estruturas virais induzidas subnucleares compostas por proteínas e ácidos nucleicos, semelhante a outros domínios nucleares, elas provaram ser passíveis de isolamento por gradientes de velocidade com base nas características bioquímicas. As etapas críticas no protocolo de fraccionamento são ilustrados na Figura 1. Em cada passo, as amostras devem ser monitorizada por microscopia de campo brilhante para assegurar a integridade da...

Fornecemos uma nova estratégia para isolar compartimentos de replicação viral (RC) de células humanas infectadas com adenovírus (Ad). Essa abordagem representa um sistema livre de células que pode ajudar a elucidar os mecanismos moleculares que regulam a replicação e expressão do genoma viral, bem como a regulação das interações viral-hospedeiro estabelecidas no RC.

Isolamento de Frações Sub-nuclear Viral Replication Compartimento enriquecidas de Adenovirus-infectados células normais Humanos

During infection of human cells by adenovirus (Ad), the host cell nucleus is dramatically reorganized, leading to formation of nuclear microenvironments ...

O objetivo geral deste procedimento é obter uma fração não nuclear enriquecida com compartimentos de replicação formados em células infectadas por adenovírus, para o estudo detalhado de sua composição, ultraestrutura e atividades associadas. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de virologia de DNA, como o estudo dos mecanismos moleculares que controlam a replicação e expressão do genoma viral, os quais, por sua vez, dependem dos compartimentos de replicação para regular as interações entre o vírus e a célula hospedeira. A principal vantagem desta técnica é que se trata de um procedimento simples, baseado em gradiente de velocidade, que permite estabelecer um sistema livre de células, passível de ser utilizado no estudo dos mecanismos que permitem aos vírus de DNA que se replicam no núcleo assumirem o controle da célula infectada.Para realizar este ensaio, primeiramente, prepare o adenovírus tipo cinco ou D cinco e fibroblastos de prepúcio humano ou HFF conforme descrito no protocolo textual complementar para infectar 10 elevado à sétima HFF em placas de cultura tecidual de 100 milímetros utilizando um mililitro de 85 e DMM por placa com uma MOI de 30 unidades formadoras de foco ou FFU por célula. Incube as células por duas horas em um incubador de cultura celular umidificado a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono, agitando cuidadosamente as placas a cada 15 minutos para garantir uma distribuição homogênea do inóculo viral sobre as células. Após a incubação, remova o meio e adicione dmem fresco.Suplementado com 10% de FBS, então incubar as células por 16, 24 ou 36 horas usando uma espátula para células. Coletar suavemente as células infectadas e as células controle após a infecção e reunir a suspensão celular em tubos de centrífuga estéreis sobre gelo. Contar as células utilizando uma câmara de Neubauer e, em seguida, centrifugar as células a 220 × g durante cinco minutos a quatro graus Celsius.Em seguida, re-suspenda o pellet celular em cinco mililitros de PBS gelado e centrifugue, lavando as células três vezes em cinco mililitros de PBS gelado, descartando os sobrenadantes das lavagens, a fim de lisar as células. Re-suspenda o pellet celular em 700 microlitros de tampão hipotônico gelado com inibidores de protease e deixe as células incharem no gelo por três horas. Usando um pistilo de teflon tipo A, homogeneíze as células com 10 a 20 movimentos para baixo.Verifique o lisado ao microscópio periodicamente a cada 20 golpes para monitorar a lise celular. Repita o processo por cerca de 80 golpes até que todas as células sejam rompidas com sucesso. Em seguida, centrifugue o homogenato a 300 vezes G a quatro graus Celsius por cinco minutos.Armazene o sobrenadante a menos 20 graus Celsius em um tubo como fração citoplasmática para remover detritos celulares dos núcleos reus. Suspenda o precipitado em 750 microlitros de solução de sacarose 0,25 molar um, pipete 750 microlitros de solução de sacarose 0,35 molar dois em um tubo de centrífuga e delicadamente sobreponha o homogeneizado ressuspendido sobre a solução dois. Centrifugue o colchão de sacarose a 1400 × g a quatro graus Celsius por cinco minutos e, em seguida, descarte o sobrenadante.Re-suspenda o pellet em 750 microlitros da solução dois para lisar. Soneque a suspensão nuclear em um banho ultrassônico, mantido a ou abaixo de quatro graus Celsius, com dois pulsos de cinco minutos. Verifique a lise nuclear em um microscópio de campo claro entre os pulsos e continue a sonicação até que os núcleos estejam completamente lisados.A seguir, pipete 750 microlitros da solução de sacarose 0,88 molar, solução três, em um tubo de centrífuga e sobreponha a solução do lisado nuclear sobre a solução três. Centrifugue o lisado a 3000 × g a quatro graus Celsius por 10 minutos. O sobrenadante de 1,5 mililitro obtido é a fração nucleoplasmática, que é armazenada a menos 70 graus Celsius.Em seguida, ressuspenda o pellet em 700 microlitros da solução dois. Esta é a fração do compartimento de replicação 85 ou RCF do núcleo do hospedeiro, que também é armazenada a menos 70 graus Celsius. Para iniciar a análise de imunofluorescência, adicione uma gota de cinco microlitros da RCF a uma lâmina de vidro revestida com salina.Deixe a gota secar ao ar em temperatura ambiente. Em seguida, adicione 500 microlitros de PBS em uma gota ao lado do ponto e incline a lâmina para fazer o PBS fluir sobre o ponto. Remova o PBS da lâmina.A seguir, bloquee o ponto da amostra com 500 microlitros de PBS contendo 5% de albúmina sérica bovina por duas horas à temperatura ambiente. Para remover o excesso de solução de bloqueio, adicione cuidadosamente 500 microlitros de PBS à amostra depositada na lâmina, sem pipetar diretamente sobre a amostra. Realize a lavagem três vezes.Em seguida, adicione 20 microlitros de anticorpo primário diluído contra a proteína de ligação ao DNA E duas A viral no local da amostra. Cubra a lâmina para evitar evaporação e incube em câmara umidificada à temperatura ambiente por duas horas. Agora, lave a amostra suavemente três vezes com PBS contendo 0,02% de tween 20.Evite pipetar diretamente sobre a amostra após essas lavagens. Adicione 20 microlitros de anticorpo secundário conjugado com fluoro quatro de camundongo diretamente sobre a amostra, e incube a quatro graus Celsius por uma hora. Em uma câmara umidificada, adicione 500 microlitros de PBS com 0,02% de Tween 20 às lâminas, novamente evitando pipetar diretamente sobre a amostra.Em seguida, adicione dois microlitros de solução de montagem e inverta uma lamínula sobre a amostra. Sobre as bordas da lamínula, aplique esmalte para unhas para selar. Visualize a lâmina em um microscópio de fluorescência com objetivo de 63 x no comprimento de onda desejado, específico para o fluoróforo quatro utilizado. Como resultado, mostra-se aqui a imunofluorescência da proteína de ligação ao DNA E dois A de adenovírus, ou DBP.As estruturas contendo DBP são rc virais subnucleares; observe que a DBP E dois A está localizada dentro do rc e aparece em verde. Além disso, o enriquecimento de DNA viral na fração rc foi confirmado por PCR, comparando a fração rc com a fração nucleoplasmática ou NPL em 24 e 36 horas após a infecção. O DNA viral foi seletivamente encontrado na fração rc e não na NPL, conforme consulta.O texto complementar fornece evidências adicionais de MNA adenoviral no RCF. Uma vez dominada esta técnica, ela pode ser realizada em seis horas, desde a colheita das células infectadas até o isolamento do RCF, se for realizada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar-se de manter sempre as amostras em gelo e monitorar, por microscopia de campo claro, as etapas de homogeneização do núcleo, isolamento, sonicação e isolamento de frações subnucleares. Após este procedimento.Outros métodos, como R-T-P-C-R e microscopia eletrônica de transmissão, podem ser realizados para estudar a regulação da expressão gênica viral associada aos compartimentos de replicação viral e à ultraestrutura dessas partículas. Esta técnica tem o potencial de abrir caminho para pesquisadores na área da virologia de tumores virais de DNA explorarem mecanismos moleculares que alteram a regulação do ciclo celular e promovem a replicação viral em células humanas. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como isolar compartimentos de replicação viral de núcleos celulares infectados para realizar estudos morfológicos, funcionais e composicionais dessas estruturas induzidas pelo vírus.Não se esqueça de que trabalhar com um indicador de SAN pode ser perigoso, e precauções, como o uso de protetores auriculares, devem sempre ser tomadas ao realizar este procedimento.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

O genoma do vírus influenza A é composto por oito complexos separada de RNA e proteínas, denominadas complexos de ribonucleoproteínas viral (vRNPs). Este artigo descreve a purificação gradiente glicerol e transmissão de visualização microscopia eletrônica de influenza A vRNPs.

Purificação e Visualização de Influenza A complexos de ribonucleoproteínas Viral

Adulto miócitos cardíacos são células primárias que podem ser isoladas de corações de animais e cultivados por vários dias. Dentro deste período a cultura de transferência de gene adenoviral podem ser usadas para expressar biossensores geneticamente codificado (GEBS) ou proteínas de fusão fluorescente. Ambas as abordagens permitem investigações celular por meio de microscopia confocal.

Isolamento e manipulação genética de adultos miócitos cardíacos for Imaging Confocal

Descrevemos o processo de isolamento de DNA de alta pureza herpesvirus nucleocapsídeo das células infectadas. O DNA final capturada a partir de solução é de alta concentração e pureza, tornando-a ideal para high-throughput seqüenciamento de alta fidelidade reações PCR e transfections para produzir novos recombinantes viral.

Preparação de DNA viral a partir nucleocapsids

Descrevemos aqui um protocolo baseado apenas em infecção de células, o que melhora a eficiência da produção de parvovírus recombinante por mais de 100 vezes em comparação com outros protocolos em uso. Este protocolo assenta na utilização de um adenovírus romance 5-base auxiliar contendo o parvovírus unidade de transcrição VP (Ad-VP).

Produção Parvovirus eficiente recombinante com a ajuda de Adenovirus sistemas derivados

Os vírus da gripe replicar seu genoma de RNA em associação com a célula hospedeira da cromatina. Aqui, apresentamos um método para purificar intactos os complexos de ribonucleoproteínas virais da cromatina das células infectadas. Purificou complexos virais podem ser analisados ​​por Western blot e tanto de extensão do primer de proteína e do conteúdo de ARN, respectivamente.

Purificação por afinidade de Complexos de Influenza Virus ribonucleoproteína da cromatina de células infectadas

Adenoviral de transferência do gene em células T CD4 naive com a expressão transgénica do receptor de adenovirus Coxsackie possibilita a análise molecular da diferenciação de células T...

Transdução de adenovírus Naive CD4 células T para estudar a diferenciação Treg

Um protocolo para geração de vetores adenovirais de alta capacidade sem todas as sequências codificadoras virais é apresentado. A clonagem de transgenes contidos no genoma do vetor é baseada em endonucleases homing. A amplificação do vírus em células produtoras cultivadas como células aderentes e em suspensão depende de um vírus auxiliar que fornece genes virais em trans.

Clonagem e produção em larga escala de alta capacidade vetores adenovirais com base no tipo adenovírus humano 5

Aqui, apresentamos um protocolo para a produção de adenovírus usando o sistema pAdEasy. A tecnologia inclui a recombinação dos plasmídeos pAdEasy-1, a embalagem e amplificação do adenovírus, a purificação das partículas adenovirais do meio de cultura e lise celular, a titulação viral e o teste funcional do adenovírus.

Um método eficiente para a produção de adenovírus

O vírus adenoassociado é produzido em cultura de células de suspensão e purificado por centrifugação com duplo gradiente de densidade de iodixanol. Etapas são incluídas para aumentar o rendimento total do vírus, diminuir o risco de precipitação do vírus e concentrar ainda mais o produto final do vírus. Os títulos finais esperados atingem 10a 12 partículas virais/mL e são adequados para uso pré-clínico in vivo .

Produção e purificação de vírus adenoassociados em cultura de suspensão por centrifugação por gradiente de densidade de iodixanol para aplicações in vivo

Este manuscrito descreve um protocolo detalhado para a geração e purificação de vetores virais adeno-associados usando um método otimizado de cromatografia de afinidade à base de heparina. Apresenta uma abordagem simples, escalável e econômica, eliminando a necessidade de ultracentrifugação. Os vetores resultantes exibem alta pureza e atividade biológica, comprovando seu valor em estudos pré-clínicos.

Isolamento de vetores virais adeno-associados por meio de um protocolo de cromatografia de afinidade de heparina de etapa única e semiautomatizada

Aprenda a isolar compartimentos de replicação viral de células humanas infectadas por adenovírus usando gradiente de velocidade. Este método simples permite estudar mecanismos moleculares da replicação do genoma viral e interações hospedeiro-patógeno.

Isolamento de Frações Sub-nuclear Viral Replication Compartimento enriquecidas de Adenovirus-infectados células normais Humanos

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