Isolamento de Frações Sub-nuclear Viral Replication Compartimento enriquecidas de Adenovirus-infectados células normais Humanos

O objetivo geral deste procedimento é obter uma fração não nuclear enriquecida com compartimentos de replicação formados em células infectadas por adenovírus para o estudo detalhado de sua composição, ultraestrutura e atividades associadas. Este método pode ajudar a abordar questões-chave no campo da virologia do DNA, como um estudo de mecanismos moleculares que controlam a replicação e expressão do genoma viral que, por sua vez, dependem de compartimentos de replicação para regulação das interações da célula hospedeira do vírus. A principal vantagem dessa técnica é que é um procedimento simples baseado em gradiente de velocidade para estabelecer um sistema livre de células que seja passível de estudo dos mecanismos que permitem que os vírus de DNA replicantes nucleares assumam o controle da célula infectada.

Para realizar este ensaio, primeiro, prepare o adenovírus tipo cinco ou D cinco e fibroblastos do prepúcio humano ou HFF conforme descrito no protocolo de texto que acompanha para começar a infectar 10 a sétimo HFF em placas de cultura de tecidos de 100 milímetros usando um mililitro de 85 e DMM por placa em um MOI de 30 unidades formadoras de foco ou FFU por célula incubar as células por duas horas em uma incubadora de cultura de células umidificada a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Balançar cuidadosamente os pratos a cada 15 minutos para garantir uma distribuição homogênea do inóculo do vírus sobre as células. Após a incubação, remova o meio e adicione dmem fresco.

Suplementado com 10% de FBS, em seguida, incube as células por 16, 24 ou 36 horas usando um raspador de células. Colha suavemente as células infectadas e de controle após a infecção e colete a suspensão celular em tubos de centrífuga estéreis no gelo. Conte as células usando uma câmara de neubauer e, em seguida, centrifugue as células a 220 vezes G por cinco minutos a quatro graus Celsius.

Em seguida, ressuspenda o pellet celular em cinco mililitros de centrífuga PBS gelada e lave as células três vezes em cinco mililitros de PBS gelado, descartando os sobrenadantes de lavagem para piolhos nas células. Resus, suspenda o pellet celular em 700 microlitros de tampão hipotônico gelado com inibidores de protease e deixe as células incharem no gelo por três horas. Usando um pilão de teflon tipo A, homogeneizar as células com 10 a 20 movimentos para baixo.

Verifique o lisado ao microscópio periodicamente a cada 20 golpes para monitorar a lise celular. Repita o processo por cerca de 80 golpes até que todas as células sejam rompidas com sucesso. Em seguida, centrifugue o homogenato a 300 vezes G a quatro graus Celsius por cinco minutos.

Armazene o sobrenadante a menos 20 graus Celsius em um tubo como a fração citoplasmática para remover os detritos celulares dos núcleos reus. Suspenda o pellet em 750 microlitros de solução de sacarose 0,25 molar um, pipete 750 microlitros de solução de sacarose 0,35 molar dois em um tubo de centrífuga e coloque cuidadosamente o homogeneizado ressuspenso sobre a solução dois. Gire a almofada de sacarose a 1400 vezes G a quatro graus Celsius por cinco minutos e, em seguida, descarte o sobrenadante.

Suspenda novamente o pellet em 750 microlitros de solução dois para piolhos. Os núcleos sonicam a suspensão nuclear em um banho ultrassônico, mantido a quatro graus Celsius ou abaixo dele em dois pulsos de cinco minutos. Verifique a lise nuclear sob um microscópio de campo brilhante entre os pulsos e sonice ainda mais até que os núcleos estejam completamente deitados.

Em seguida, pipeta 750 microlitros de sacarose 0,88 molar Solução três em um tubo de centrífuga coloque a solução de lisado nuclear sobre a solução três. Centrifugue o lisado a 3000 vezes G a quatro graus Celsius por 10 minutos. O S de 1,5 mililitro nomeado é a fração nucleoplasmática, que é armazenada a 70 graus Celsius negativos.

Em seguida, ressuspenda o pellet em 700 microlitros da solução dois. Esta é a fração de 85 compartimentos de replicação ou RCF do núcleo hospedeiro, que também é armazenado a menos 70 graus Celsius. Para iniciar a análise de imunofluorescência, adicione uma gota de cinco microlitros do RCF a uma lâmina de vidro revestida com solução salina.

Deixe a gota secar ao ar em temperatura ambiente. Em seguida, adicione 500 microlitros de PBS em uma gota ao lado do local e incline a lâmina para fluir o PBS sobre o local. Drene o PBS da lâmina.

Em seguida, bloqueie o local da amostra com 500 microlitros de PBS contendo 5% de albumina de soro bovino por duas horas em temperatura ambiente. Para remover o excesso de solução de bloqueio, adicione 500 microlitros de PBS suavemente à amostra manchada na lâmina sem pipetar diretamente na amostra. Realize a lavagem três vezes.

Em seguida, adicione 20 microlitros de anticorpo primário diluído contra a proteína de ligação ao DNA viral E dois A no local da amostra. Cubra a lâmina para evitar a evaporação e incube em uma câmara umidificada em temperatura ambiente por duas horas. Agora, lave a amostra três vezes suavemente com PBS contendo 0,02% entre 20.

Evite pipetar diretamente na amostra após essas lavagens. Adicione 20 microlitros de anticorpo secundário de camundongo acoplado a quatro fluoro diretamente na amostra, incube a quatro graus Celsius por uma hora. Em uma câmara umidificada, adicione 500 microlitros de PBS com 0,02% Tween 20 às lâminas, novamente, evitando pipetar diretamente na amostra.

Em seguida, adicione dois microlitros de solução de montagem e inverta uma lamínula sobre a amostra. Sele as laterais das lamínulas com esmalte. Veja a lâmina sob um microscópio de fluorescência com uma objetiva de 63 x no comprimento de onda desejado específico para o fluoro quatro usado um resultado da imunofluorescência do adenoviral E dois A DNA

As estruturas contendo DBP são rc virais subnucleares, observe que o DBP E dois A está localizado dentro do RC e aparece em verde. Além disso, o enriquecimento do DNA viral no RCF foi confirmado por PCR comparando o RCF e a fração nucleoplasmática ou NPL 24 e 36 horas após a infecção. O GNA viral foi encontrado seletivamente no RCF e não na consulta de NPL.

O texto que acompanha para evidências adicionais de MNA adenoviral no RCF Uma vez dominado, esta técnica pode ser feita em seis, desde o momento em que as células infectadas são colhidas até o isolamento do RCF, se for realizada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de sempre manter as amostras no gelo e monitorar as etapas de homogeneização do núcleo, isolamento, sonicação e isolamento da fração subnuclear por microscopia de campo claro. Seguindo este procedimento.

Outros métodos como R-T-P-C-R e microscopia eletrônica de transmissão podem ser realizados para estudar a regulação da expressão gênica viral associada aos compartimentos de replicação viral e a ultraestrutura dessas partículas. Essa técnica tem o potencial de abrir caminho para pesquisadores no campo da virologia tumoral de DNA explorarem mecanismos moleculares que alteram a regulação do ciclo celular e promovem a replicação viral em células humanas. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como isolar compartimentos de replicação viral de núcleos de células infectadas para realizar estudos morfológicos, funcionais e composicionais dessas estruturas induzidas por vírus.

Não se esqueça de que trabalhar com um indicador SAN pode ser perigoso, e percussões, como usar bocas auriculares, devem sempre ser tomadas durante a execução deste procedimento.