Isolamento de Frações Sub-nuclear Viral Replication Compartimento enriquecidas de Adenovirus-infectados células normais Humanos

O objetivo geral deste procedimento é obter uma fração não nuclear enriquecida com compartimentos de replicação formados em células infectadas por adenovírus, para o estudo detalhado de sua composição, ultraestrutura e atividades associadas. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de virologia de DNA, como o estudo dos mecanismos moleculares que controlam a replicação e expressão do genoma viral, os quais, por sua vez, dependem dos compartimentos de replicação para regular as interações entre o vírus e a célula hospedeira. A principal vantagem desta técnica é que se trata de um procedimento simples, baseado em gradiente de velocidade, que permite estabelecer um sistema livre de células, passível de ser utilizado no estudo dos mecanismos que permitem aos vírus de DNA que se replicam no núcleo assumirem o controle da célula infectada.

Para realizar este ensaio, primeiramente, prepare o adenovírus tipo cinco ou D cinco e fibroblastos de prepúcio humano ou HFF conforme descrito no protocolo textual complementar para infectar 10 elevado à sétima HFF em placas de cultura tecidual de 100 milímetros utilizando um mililitro de 85 e DMM por placa com uma MOI de 30 unidades formadoras de foco ou FFU por célula. Incube as células por duas horas em um incubador de cultura celular umidificado a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono, agitando cuidadosamente as placas a cada 15 minutos para garantir uma distribuição homogênea do inóculo viral sobre as células. Após a incubação, remova o meio e adicione dmem fresco.

Suplementado com 10% de FBS, então incubar as células por 16, 24 ou 36 horas usando uma espátula para células. Coletar suavemente as células infectadas e as células controle após a infecção e reunir a suspensão celular em tubos de centrífuga estéreis sobre gelo. Contar as células utilizando uma câmara de Neubauer e, em seguida, centrifugar as células a 220 × g durante cinco minutos a quatro graus Celsius.

Em seguida, re-suspenda o pellet celular em cinco mililitros de PBS gelado e centrifugue, lavando as células três vezes em cinco mililitros de PBS gelado, descartando os sobrenadantes das lavagens, a fim de lisar as células. Re-suspenda o pellet celular em 700 microlitros de tampão hipotônico gelado com inibidores de protease e deixe as células incharem no gelo por três horas. Usando um pistilo de teflon tipo A, homogeneíze as células com 10 a 20 movimentos para baixo.

Verifique o lisado ao microscópio periodicamente a cada 20 golpes para monitorar a lise celular. Repita o processo por cerca de 80 golpes até que todas as células sejam rompidas com sucesso. Em seguida, centrifugue o homogenato a 300 vezes G a quatro graus Celsius por cinco minutos.

Armazene o sobrenadante a menos 20 graus Celsius em um tubo como fração citoplasmática para remover detritos celulares dos núcleos reus. Suspenda o precipitado em 750 microlitros de solução de sacarose 0,25 molar um, pipete 750 microlitros de solução de sacarose 0,35 molar dois em um tubo de centrífuga e delicadamente sobreponha o homogeneizado ressuspendido sobre a solução dois. Centrifugue o colchão de sacarose a 1400 × g a quatro graus Celsius por cinco minutos e, em seguida, descarte o sobrenadante.

Re-suspenda o pellet em 750 microlitros da solução dois para lisar. Soneque a suspensão nuclear em um banho ultrassônico, mantido a ou abaixo de quatro graus Celsius, com dois pulsos de cinco minutos. Verifique a lise nuclear em um microscópio de campo claro entre os pulsos e continue a sonicação até que os núcleos estejam completamente lisados.

A seguir, pipete 750 microlitros da solução de sacarose 0,88 molar, solução três, em um tubo de centrífuga e sobreponha a solução do lisado nuclear sobre a solução três. Centrifugue o lisado a 3000 × g a quatro graus Celsius por 10 minutos. O sobrenadante de 1,5 mililitro obtido é a fração nucleoplasmática, que é armazenada a menos 70 graus Celsius.

Em seguida, ressuspenda o pellet em 700 microlitros da solução dois. Esta é a fração do compartimento de replicação 85 ou RCF do núcleo do hospedeiro, que também é armazenada a menos 70 graus Celsius. Para iniciar a análise de imunofluorescência, adicione uma gota de cinco microlitros da RCF a uma lâmina de vidro revestida com salina.

Deixe a gota secar ao ar em temperatura ambiente. Em seguida, adicione 500 microlitros de PBS em uma gota ao lado do ponto e incline a lâmina para fazer o PBS fluir sobre o ponto. Remova o PBS da lâmina.

A seguir, bloquee o ponto da amostra com 500 microlitros de PBS contendo 5% de albúmina sérica bovina por duas horas à temperatura ambiente. Para remover o excesso de solução de bloqueio, adicione cuidadosamente 500 microlitros de PBS à amostra depositada na lâmina, sem pipetar diretamente sobre a amostra. Realize a lavagem três vezes.

Em seguida, adicione 20 microlitros de anticorpo primário diluído contra a proteína de ligação ao DNA E duas A viral no local da amostra. Cubra a lâmina para evitar evaporação e incube em câmara umidificada à temperatura ambiente por duas horas. Agora, lave a amostra suavemente três vezes com PBS contendo 0,02% de tween 20.

Evite pipetar diretamente sobre a amostra após essas lavagens. Adicione 20 microlitros de anticorpo secundário conjugado com fluoro quatro de camundongo diretamente sobre a amostra, e incube a quatro graus Celsius por uma hora. Em uma câmara umidificada, adicione 500 microlitros de PBS com 0,02% de Tween 20 às lâminas, novamente evitando pipetar diretamente sobre a amostra.

Em seguida, adicione dois microlitros de solução de montagem e inverta uma lamínula sobre a amostra. Sobre as bordas da lamínula, aplique esmalte para unhas para selar. Visualize a lâmina em um microscópio de fluorescência com objetivo de 63 x no comprimento de onda desejado, específico para o fluoróforo quatro utilizado. Como resultado, mostra-se aqui a imunofluorescência da proteína de ligação ao DNA E dois A de adenovírus, ou DBP.

As estruturas contendo DBP são rc virais subnucleares; observe que a DBP E dois A está localizada dentro do rc e aparece em verde. Além disso, o enriquecimento de DNA viral na fração rc foi confirmado por PCR, comparando a fração rc com a fração nucleoplasmática ou NPL em 24 e 36 horas após a infecção. O DNA viral foi seletivamente encontrado na fração rc e não na NPL, conforme consulta.

O texto complementar fornece evidências adicionais de MNA adenoviral no RCF. Uma vez dominada esta técnica, ela pode ser realizada em seis horas, desde a colheita das células infectadas até o isolamento do RCF, se for realizada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar-se de manter sempre as amostras em gelo e monitorar, por microscopia de campo claro, as etapas de homogeneização do núcleo, isolamento, sonicação e isolamento de frações subnucleares. Após este procedimento.

Outros métodos, como R-T-P-C-R e microscopia eletrônica de transmissão, podem ser realizados para estudar a regulação da expressão gênica viral associada aos compartimentos de replicação viral e à ultraestrutura dessas partículas. Esta técnica tem o potencial de abrir caminho para pesquisadores na área da virologia de tumores virais de DNA explorarem mecanismos moleculares que alteram a regulação do ciclo celular e promovem a replicação viral em células humanas. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como isolar compartimentos de replicação viral de núcleos celulares infectados para realizar estudos morfológicos, funcionais e composicionais dessas estruturas induzidas pelo vírus.

Não se esqueça de que trabalhar com um indicador de SAN pode ser perigoso, e precauções, como o uso de protetores auriculares, devem sempre ser tomadas ao realizar este procedimento.