Purificação por afinidade de Complexos de Influenza Virus ribonucleoproteína da cromatina de células infectadas

Lyco negativo, vírus de RNA. O genoma dos vírus da gripe é empacotado na forma de complexos de proteínas nucleares de costelas virais, ou VR nps, nos quais o genoma de fita simples é encapsulado pela proteína nuclear e associado ao complexo polimerase de açafrão que consiste nas subunidades PA PB um e PB dois para purificar complexos intactos de células de mamíferos infectadas. As células Hela são incubadas com vírus influenza recombinante marcado com strept.

Uma vez que o vírus entra nas células, o RNA viral é sintetizado nos núcleos após a infecção, as células são mentidas usando um detergente e fracionadas em frações nucleares e cromatinas citoplasmáticas usando centrifugação e protocolo de fração de cromatina baseado em agressão. Finalmente, os VRPs marcados com strept são purificados por afinidade a partir de cada fração A análise da composição de proteína e RNA do VR NPS purificado por coloração de prata demonstra que, usando este protocolo, mesmo firmemente, os VRPs ligados à cromatina podem ser isolados. Intacto. Portanto, uma das principais vantagens do nosso protocolo quando comparado aos métodos padrão para purificação de afinidade de complexos de proteínas nucleares de costelas do vírus influenza é que, usando nosso método, é possível purificar VR NPS da cromatina de células infectadas, que é conhecido por ser o local de síntese de mRNA do vírus influenza.

Portanto, nosso método pode ser usado para responder a perguntas relacionadas à regulação da replicação e transcrição viral, como, por exemplo, quais fatores virais ou celulares, mas também quais modificações pós-traducionais são necessárias para, por exemplo, a síntese de mRNA viral ou também a síntese de RNA genômico viral. Portanto, os pesquisadores novos neste método podem ter alguma dificuldade porque o fracionamento subnuclear é muito sensível às condições bioquímicas e também pode variar muito entre as diferentes linhagens celulares. Comece este protocolo com curar nossas células que foram infectadas com o vírus influenza, RWSN PB dois estreptococos, que tem uma marca estreptocócica geneticamente fundida ao terminal C da subunidade PB dois em uma multiplicidade de infecção de três.

Lave as células uma vez com PBS frio, adicione 12 mililitros de PBS frio e retire-as do prato. Usando um raspador de borracha. Transfira as células para um tubo cônico de 50 mililitros e pelete-as por centrifugação.

O aspecto mais difícil deste procedimento é o protocolo de fracionamento celular. Os núcleos celulares são muito sensíveis aos procedimentos de homogeneização e mistura e, se forem realizados incorretamente, podem facilmente arruinar um extrato de cromatina. Portanto, é muito importante seguir não apenas as técnicas de homogeneização, mas também o manuseio geral dos lisados, como mostramos aqui.

Após o aspirado de spin, o PBS e o Resus suspendem o pellet celular em 10 mililitros de tampão de sacarose frio. Conecte uma ponta de pipeta de 200 microlitros a uma pipeta de soro de plástico de 10 mililitros e passe as células por ela para quebrar os aglomerados de células. Incube a suspensão no gelo por 10 minutos.

Invertendo periodicamente as células suavemente para ressuspendê-las. Em seguida, adicione não IET P 40 a uma concentração final de 0,5% e vórtice em alta velocidade por 15 segundos centrifugue imediatamente por 10 minutos a 3.500 vezes G a quatro graus Celsius em uma centrífuga de mesa. Após a centrifugação, retire o supinato e transfira-o para um tubo de 15 mililitros para cónico.

Armazene o supinato a quatro graus Celsius. Esta é uma fração citoplasmática. O pellet deve ser menor e mais branco do que o pellet de célula original, conforme mostrado aqui.

Se o protocolo for concluído posteriormente, armazene o pellet celular a quatro graus Celsius. Caso contrário, continue lavando o pellet em cinco mililitros de sacarose fria, tampão e centrifugando como antes. Uma vez concluída a rotação, descarte o supinato e ressuspenda o pellet, que contém os núcleos em 1,5 mililitros de tampão de extração plasmática nuclear fria.

Transfira o pellet ressuspenso para um homogeneizador de dança de quatro mililitros de vidro resfriado com um pilão bem ajustado e homogeneize os núcleos com 20 pinceladas. Evitando a formação de espuma, a resistência deve aumentar após aproximadamente 10 golpes. Para confirmar a homogeneização eficiente, examine a amostra em um microscópio de contraste de fase.

Os núcleos não devem mais ser redondos, mas ter formas irregulares e parecer que estouraram. Uma vez homogeneizados os núcleos, transfira-os para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro. Incubar o homogeneizado numa roda rotativa a quatro graus Celsius durante 20 minutos.

Em seguida, centrifugue a 16.000 vezes G em uma microcentrífuga por 10 minutos a quatro graus Celsius. Após a rotação, transfira o supinato, que é a fração plasmática nuclear, para um tubo de 1,5 mililitro, e armazene-o a quatro graus Celsius. Em seguida, Reese suspende o pellet em 1,5 mililitros de digestão, tampão pré-aquecido a 37 graus Celsius.

Em seguida, incube a fração por 10 minutos a 37 graus Celsius. Em seguida, adicione 42 microlitros de cloreto de sódio de cinco molares para trazer a concentração final de cloreto de sódio para 150 milimolares e incube por 20 minutos no gelo. Centrifugue a 16.000 vezes, G em uma microcentrífuga de quatro graus Celsius por 10 minutos.

Após a centrifugação, retire o supinato e guarde-o a quatro graus Celsius. Esta é a fração CH one 50. Reeses dobra o pellet em 1,5 mililitros de tampão frio com alto teor de sal e incuba por 20 minutos no gelo.

Centrifugue a 16.000 vezes, G em uma microcentrífuga a quatro graus Celsius por 10 minutos. Após a centrifugação, retire o líquido e guarde-o a quatro graus Celsius. Esta é a fração CH 500.

Retire as frações salvas durante o protocolo de fracionamento e coloque-as no gelo. Em seguida, à fração citoplasmática, adicione 300 microlitros de cloreto de sódio de cinco molares. Em seguida, transfira 100 microlitros de estreptococos T embalados em grânulos Sphero por fração para um tubo cônico de 15 mililitros.

Adicione 10 volumes de tampão de lavagem de estreptococos aos grânulos. Inverta o tubo para misturar e centrifugue por cinco minutos a 1000 vezes. G em uma centrífuga de mesa, descarte o sna.

Repita a lavagem do tampão duas vezes e, em seguida, Reese dobre o pellet em um volume igual de tampão de lavagem de estreptococos, adicione 200 microlitros de estreptococos lavados Aja na pasta do grânulo para cada fração. Gire os tubos por uma hora a quatro graus Celsius. Em seguida, centrifugue os tubos por um minuto a 1000 vezes G de quatro graus Celsius, descarte o supinato.

Em seguida, adicione um mililitro de tampão de lavagem aos grânulos para grânulos incubados com a fração citoplasmática em um tubo de 15 mililitros. Adicione o tampão de lavagem e transfira as contas para um tubo de 1,5 mililitro. Lave as contas por um minuto e, em seguida, centrifugue os tubos por um minuto a 1000 vezes G a quatro graus Celsius.

Repita duas vezes após a última etapa de lavagem. Remova todos os vestígios do tampão de lavagem usando uma ponta de pipeta plana. Em seguida, adicione 100 microlitros de tampão eluciano e misture delicadamente e coloque os tubos no gelo por 15 minutos.

Durante a incubação, misture ocasionalmente as contas batendo suavemente no fundo dos tubos. Após 15 minutos passaram a centrífuga para escolher por um minuto a 1000 vezes G a quatro graus Celsius. Colete o Senna contendo os VRPs marcados com estreptococos eluídos.

Ele, nossas células foram infectadas com a cepa do vírus influenza, WSN por nove horas, e os lisados fracionados foram analisados por florescimento ocidental como mostrado aqui. O isolamento nuclear suave extrai com eficiência proteínas citoplasmáticas, como a tubulina, evitando a liberação de proteínas nucleares abundantes. Observe que a fração de cromatina extraída com baixo teor de sal é enriquecida em proteínas importantes para a transcrição.

Enquanto a fração com alto teor de sal contém principalmente nucleossomos para determinar a composição proteica da fração citoplasmática eluída, V NPS de células R infectadas por nove horas com vírus não marcado, RWSN ou RWSN PB dois estreptococos foram analisados por coloração de prata, conforme mostrado para um eluato citoplasmático. Aqui há uma alta proporção de NP para PA PB um, PB dois, como evidenciado pela banda principal acima de 55 kilodaltons em comparação com as bandas entre 95 e 100 kilodaltons, sugerindo que a maioria dos estreptococos PB dois é purificada como parte de um VRNP totalmente formado, ou em outras palavras, pouca polimerase solúvel é capturada para comparar os rendimentos relativos. VR NPS purificado após nove horas de infecção com RWSN PB dois estreptococos ou RWSN ou corado com prata, como mostrado neste gel de coloração de prata v RMPs podem ser purificados de todas as quatro frações celulares após nove horas de infecção.

A maior concentração de v RMPs é encontrada no plasma nuclear, embora porções consideráveis também possam ser purificadas do citoplasma e da cromatina. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como purificar altos rendimentos de complexos de ribonucleoproteínas intactos do vírus influenza do núcleo das células infectadas. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar de usar tampões limpos e evitar expor as amostras desnecessariamente à temperatura ambiente, pois assim você pode evitar a degradação do RNA e da proteína, além de evitar a desmontagem do complexo proteico.

E não se esqueça de que trabalhar com um vírus infeccioso da gripe pode ser perigoso. Todas as etapas devem ser realizadas sob uma bancada de nível de biossegurança dois até que NP 40 tenha sido adicionado aos lisatos.