Imagem tridimensional e análise de mitocôndrias dentro as fibras nervosas intraepidérmicas humana

O objetivo geral dessa técnica de imagem e análise é isolar informações específicas de um sinal complexo. Especificamente, este protocolo descreve como visualizar e quantificar mitocôndrias específicas de nervos juntamente com outras mitocôndrias dentro da epiderme. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de neurologia, como, por exemplo, como as mitocôndrias presentes nas fibras nervosas intraepidérmicas de indivíduos saudáveis se comparam às mitocôndrias específicas de nervos de pacientes com complicações neurológicas.

A principal vantagem desta técnica é que tomamos um sinal complexo e extraímos informações específicas a partir dele. Este protocolo nos ajuda a isolar um sinal específico, como o sinal nestes canudos, dos sinais ao seu redor. Prepare-se para a coloração de imunohistoquímica por fluorescência de biópsias de pele rotulando primeiro uma placa de 96 poços de acordo com este esquema.

Em seguida, pipete 150 microlitros da solução estoque do potenciador de sinal para reduzir a ligação inespecífica dos anticorpos secundários em cada poço da linha superior. Prepare os poços de lavagem adicionando 150 microlitros de solução salina tamponada com fosfato 1x em cada poço das linhas dois e três da placa de 96 poços. Em seguida, adicione 150 microlitros da solução bloqueadora de BSA 5% nos poços da linha quatro.

Dilua os anticorpos primários PGP9.5 e PDH em 1.500 microlitros de solução de lavagem com BSA 1% e adicione 150 microlitros a cada poço da linha cinco. Use um alça de inoculação para transferir as seções para a solução de realce de sinal na linha um. Assim que as seções estiverem na solução de anticorpo primário na linha cinco, envolva a placa firmemente com filme plástico laboratorial para evitar evaporação e, em seguida, agite as amostras em um agitador horizontal à temperatura ambiente por uma hora.

Incubar com agitação durante a noite a quatro graus Celsius. No segundo dia do procedimento, pipetar 150 microlitros de solução de lavagem contendo 1% de BSA nos poços das linhas seis, sete e oito da placa de 96 poços. Adicionar os anticorpos secundários conjugados a fluoróforo a 1.500 microlitros de BSA a 1%.

Em seguida, pipete 150 microlitros da solução de anticorpo secundário em cada poço da linha nove. Lave as seções passando pelos poços seis, sete e oito. Uma vez que as seções estejam na solução de anticorpo secundário na linha nove, envolva a placa com parafilm e cubra com folha de alumínio para proteger os sinais de fluorescência.

Incubar com agitação, como antes. No terceiro dia, pipetar 150 microlitros de PBS 1x estéril filtrado para as fileiras 10, 11 e 12. Transferir as amostras para a fileira 10 e, em seguida, cobrir a placa com papel alumínio.

Lave durante uma hora à temperatura ambiente com agitação. Em seguida, prepare uma lâmina de microscópio para montar as seções pipetando 50 microlitros de PBS 1x filtrado sobre a lâmina. Após a conclusão das lavagens, transfira uma seção da linha 12 para a lâmina e adicione uma a duas gotas de meio de montagem contendo DAPI diretamente sobre a seção.

Coloque suavemente uma lamínula de vidro microscópica 1.5 de 50 milímetros por 24 milímetros sobre a seção. Coloque as lâminas em local escuro durante a noite à temperatura ambiente para curar o meio de montagem antes de armazená-las ou imagiá-las. Selecione a objetiva de imersão a óleo de 40X em um microscópio confocal invertido com varredura a laser.

Selecione os lasers e detectores apropriados para imagens dos núcleos, fibras nervosas e mitocôndrias. Insira os seguintes parâmetros de varredura no software do microscópio: resolução de intensidade de 12 bits, taxa de varredura de 500 hertz com média de dois quadros e aumento de 2,2. Configure o software do microscópio para obter resolução lateral otimizada, selecionando uma resolução de varredura de 1024 por 1024.

Otimize a resolução axial e o seccionamento óptico selecionando uma abertura confocal de uma unidade de ar com um tamanho de passo Z de 210 nanômetros. Digitalize cada sinal separadamente e ajuste a voltagem e o deslocamento do detector para remover quaisquer pixels superexpostos ou subexpostos. Ative uma varredura em tempo real para o sinal do nervo e ajuste o controle de foco Z para encontrar e definir os planos focais superior e inferior no software do microscópio, abrangendo o sinal do nervo dentro da seção tecidual.

Realize a varredura da série Z final com varredura sequencial para eliminar a interferência do sinal de fluorescência. Isole a epiderme do estrato córneo e da derme desenhando uma região ao redor da epiderme usando uma ferramenta de seleção em uma imagem duplicada da imagem original. Em seguida, recorte a imagem de acordo com a seleção.

Calcule as funções de espalhamento de ponto para os sinais de fluorescência confocal verde e vermelho utilizando a função calcular espalhamento. Em seguida, defina os parâmetros para o índice de refração do meio do óleo em 1,515 e a abertura numérica do objetivo de 40X a óleo em 1,25. Ajuste o pinhole do detector em uma unidade de abertura e escolha um comprimento de onda de excitação a laser.

Utilize a restauração iterativa definida em 100% de confiança, limite de iteração de 10 ciclos e as PSFs verde e vermelha para a desconvolução dos sinais de fluorescência verde e vermelha. Utilize a ferramenta de criação de superfície para gerar uma superfície ao redor dos sinais nervosos desconvoluídos, selecionando a opção de não suavizar características, intensidade absoluta para limiarização, um limite inferior de 3.000 e um limite superior de 65.535. Mantenha as superfícies acima de 10 vóxeis.

Remova as superfícies não nervosas utilizando a guia editar na superfície nervosa para selecionar superfícies não nervosas individuais ou mantenha pressionada a tecla Control para selecionar múltiplas superfícies não nervosas. Exclua as superfícies não nervosas selecionadas pressionando o botão Excluir. Utilize a guia editar na superfície nervosa e pressione o botão mascarar tudo nas propriedades da máscara.

Na nova janela, selecione o canal cinco mitocôndrias desconvoluído na seleção de canais e marque a opção duplicar canal antes de aplicar a máscara. Pressione o botão de rádio para constante dentro/fora e marque definir vóxeis fora da superfície como 0,0 e pressione o botão OK. Por fim, crie superfícies específicas para mitocôndrias usando a ferramenta criar superfície para formar uma superfície ao redor dos sinais mitocondriais desconvoluídos e mascarados, desmarcando a opção suavizar característica e utilizando subtração de fundo para limiarização.

Defina o diâmetro da esfera maior como 1,50 micrômetros, o limite inferior como 2.000 e o limite superior como o máximo de 65.535. Certifique-se de manter as superfícies acima de 1,0 vóxel. Esta imagem representativa de microscopia confocal 3D ilustra o sinal de fluorescência verde específico para o nervo.

Uma superfície 3D mostrada em ciano é criada para o sinal nervoso. Em seguida, o sinal mitocondrial específico do nervo é isolado a partir dos demais sinais mitocondriais epidérmicos utilizando a superfície do nervo como ferramenta de máscara. O sinal de fluorescência vermelha mitocondrial específico do nervo resultante é usado para criar superfícies exibidas em magenta ao redor das mitocôndrias dentro da superfície nervosa, que é mostrada em ciano.

Isso permite visualizar em detalhes as mitocôndrias nas fibras nervosas. Aqui, os dados da superfície mitocondrial são apresentados como um histograma de frequência de tamanho para mostrar a porcentagem de mitocôndrias presentes em cada uma das várias curvaturas de acordo com seu volume. Ao realizar este procedimento, é importante cuidar do tecido durante o processo de coloração para garantir que o tecido esteja completamente submerso nas soluções, proporcionando uma coloração uniforme e consistente em todas as seções.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como visualizar e quantificar mitocôndrias em fibras nervosas intraepidérmicas humanas. Nosso protocolo detalhado foi elaborado para ensinar a outros pesquisadores como corar, imagens, processar e analisar biópsias de pele humana com o objetivo de compreender os mecanismos subjacentes à patogênese de doenças neurológicas baseadas em mitocôndrias, como a neuropatia.