Name: Imagem tridimensional e análise de mitocôndrias dentro as fibras nervosas intraepidérmicas humana (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-29T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 31 s
Description: Aprenda a visualizar e quantificar mitocôndrias específicas de nervos em biópsias de pele humana usando imagem tridimensional e imunohistoquímica de fluorescência. Este método isola sinais específicos de fundos complexos para estudar doenças neurológicas.

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Este trabalho foi financiado pelos institutos nacionais de saúde subsídios K08 NS061039-01A2, o programa de pesquisa de Neurologia &#38; descoberta e o r. Alfred Taubman Medical Research Institute da Universidade de Michigan. Este trabalho usou a morfologia e o núcleo de análise de imagem do Michigan Diabetes Research Center, financiado pelos institutos nacionais de saúde Grant 5P 90 DK-20572 do Instituto Nacional de Diabetes e doenças renais e digestivo. Os autores gostaria de agradecer a J. Robinson Singleton e a Gordon Smith (Universidade de Utah), por sua generosa doação de amostras de pele humana.

biópsias de pele soco foram obtidas a partir de temas que foram recrutados a partir de uma rede de grandes cuidados primários baseada na Comunidade, no centro de Diabetes da Universidade de Utah (Salt Lake City, UT). Este estudo foi aprovado pelo Conselho de revisão institucional da Universidade de Michigan e respeitado os princípios da declaração de Helsinque. Escrito consentimento informado foi obtido de cada assunto antes do teste.
 1. imuno-histoquímica da fluorescência <ol><li>preparar ponche biópsias para fibras nervosas intraepidérmicas imuno-histoquímica: <ol><li>pele de 3mm de realizar biópsias por médico pessoal e coloque a biópsia toda em 1.5 mL Zamboni &#39; s solução fixador (2% paraformaldeído, 0,3% saturada ácido pícrico em solução salina tamponada fosfato (PBS), pH 7,4) a 4 ° C durante a noite.</li>
		<li>Enxaguar amostras com uma solução de sacarose a 30% em PBS a 4 ° C por 16-24 h ou até que a amostra afunda.</li>
		<li>Incorporar amostras em temperatura ideal corte composto (OCT) usando um cryomold. Coloque a biópsia de toda 3 mm com a epiderme virado para baixo no molde e encher o molde com cerca de 2 mL de outubro Freeze o molde em gelo seco. Loja a-80 ° C até que esteja pronto para usar.</li>
		<li>Cortar 50 µm de espessura utilizando um criostato de secções transversais e armazenar em poços individuais de uma placa de 96 poços, usando a solução de armazenamento de anticongelante µ l 180 por alvéolo (30% de etileno glicol, glicerol 30% em PBS). As instruções seguintes são para 8 poços de uma placa bem 96. Mancha de seções de cada local de biopsia que são 200 a 300 µm longe um do outro.</li>
	</ol></li></ol> dia 1: <ol start="2"> <li>Quench não-específicas de rotulagem do estrato córneo: <ol><li>placa de 96 rótulo conforme mostrado na Figura 1.</li>
		<li>Pipetar 150 µ l de solução de potenciador sinal das ações para reduzir a ligação não específica de anticorpos secundários 34 , 35 em cada poço. Transferir as seções para solução de potenciador de sinal usando um loop inoculando. 
		Nota: tenha cuidado ao trabalhar com o tecido para evitar danificar ou rasgar as secções de tecido. Manter em solução de potenciador de sinal por 30 minutos em temperatura ambiente em um balancim plana.</li>
		<li>Preparar enxágue poços nas linhas 2 e 3 da placa de 96 poços, adicionando 150 µ l de 1 x salina tampão fosfato (PBS) para cada poço.</li>
		<li>Transferir com cuidado as seções para linha 2 e enxágue em 1X PBS durante 10 minutos à temperatura ambiente.</li>
		<li>Enxaguar uma segunda vez em 1X PBS durante 10 minutos à temperatura ambiente (linha 3).</li>
	</ol></li> <li>Preparar 5% albumina de soro bovino (BSA) obstrui a solução: <ol><li>preparar 5% obstrui a solução que contém 5% BSA e 0,3% Triton X 100 (TX-100) em 0.1 M PBS (ver quadro 1) enquanto seções estão incubando em solução de potenciador de sinal. BSA não entra facilmente em solução. Solução de vórtice até BSA dissolve-se completamente.</li>
		<li>Prepare poços de bloqueio na linha 4 da placa de 96 poços, acrescentando 150 µ l de BSA de 5%, solução de bloqueio para cada poço.</li>
		<li>Transferir seções em poços individuais de BSA de 5%, solução de bloqueio e incubar seções em 5% BSA obstrui a solução para 1-2 h à temperatura ambiente em um balancim plana.</li>
	</ol></li> <li>Preparar 1% BSA enxaguar a solução e a diluição de anticorpos primários: <ol><li>preparar 1% solução de lavagem que contém 1% de BSA e 0,3% TX-100 em 0.1 M PBS (ver quadro 2) enquanto as seções são incubação em solução a 5% BSA bloqueio. BSA não entra facilmente em solução. Solução de vórtice até BSA dissolve-se completamente.</li>
		<li>Diluir os anticorpos primários na solução de lavagem 1% BSA enquanto seções estão incubando em solução a 5% BSA bloqueio.
		<ol><li>Fazer 1.500 µ l da solução de anticorpo primário e adicionar a cada bem na linha 5.</li>
			<li>Diluir os anticorpos primários: usar o rótulo de nervo específico, produto de polyclonal antiproteína do gene coelho 9.5 (PGP9.5) em 1:1, 000. Use o rótulo de mitocôndrias específicos, mouse anticorpo de E2/E3bp de anticorpo monoclonal antipiruvato desidrogenase (PDH) a 1: 100 em BSA 1%, solução de lavagem.</li>
		</ol></li></ol></li> <li>Anticorpo primário de preparar: <ol><li>Pipetar 150 µ l de anticorpo primário em cada bem na linha 5 da placa de 96 poços.</li>
		<li>Usando a ferramenta de laço, transferir seções a partir da solução de bloqueio (linha 4) para a linha 5, que contêm o anticorpo primário.</li>
		<li>Embrulhar a placa firmemente com parafilm para mantê-lo sequem.</li>
		<li>Local amostras plana basculante à temperatura ambiente durante 1 h e então incubar amostras a 4 ° c em um balancim plano durante a noite.</li>
	</ol></li></ol> dia 2: <ol start="6"> <li>enxaguar amostras: <ol><li>poços de enxaguamento preparar nas linhas 6, 7 e 8 da placa de 96 poços, adicionando 150 µ l de BSA 1%, solução de lavagem em cada poço.</li>
		<li>Transferir seções para a primeira solução a 1% BSA lavagem (linha 6) e incube por 1h à temperatura ambiente. Repita o enxágue duas vezes mais por seções em 1% de BSA enxaguar solução nas linhas 7 e 8 para 1 h cada à temperatura de incubação.</li>
	</ol></li> <li>Diluir a anticorpos secundários em BSA 1%, solução de lavagem: <ol><li>fazer 1.500 µ l da solução de anticorpo secundário enquanto seções estão incubando na última lavagem de 1% de BSA enxaguar solução (linha 8).</li>
		<li>Diluir a anticorpos secundários: para PGP9.5 (anticorpo antiverde-fluorescente cabra conjugados, 1: 1000), para PDH (vermelho-fluorescente conjugado cabra anti-rato, 1:1, 000) em BSA 1%, solução de lavagem.</li>
	</ol></li> <li>Anticorpo secundário preparar: <ol><li>Pipetar 150 µ l de anticorpo secundário na linha 9 da placa de 96 poços.</li>
		<li>Transferir suavemente as seções de 1% de BSA enxaguar solução (linha 8), em poços de anticorpo secundário (linha 9).</li>
		<li>Usando parafilm, enrole a placa firmemente para evitar que sequem. Cubra com papel alumínio. Colocar as amostras de basculante plana à temperatura ambiente durante 1 h e então incubar as amostras no 4 ˚ c um basculante plana durante a noite.</li>
	</ol></li></ol> dia 3: <ol start="9"> <li>preparar limpar 1X PBS pela filtragem através de um filtro de 0,22 µm: <ol><li>Pipetar 150 µ l de filtrado 1X PBS em linha 10, 11 e 12.</li>
		<li>Amostras de transferência para linha 10 e enxaguar em 1X PBS por 1h à temperatura ambiente. Cobrir a placa de 96 poços com papel alumínio e coloque sobre um roqueiro plano durante a lavagem. Repetição filtrado 1 x lavagem PBS duas vezes mais para 1 h à temperatura ambiente em linhas 11 e 12.</li>
	</ol></li> <li>Preparar corrediças do microscópio para cortes histologicos da montagem: <ol><li>colocar 50 µ l de filtrado 1X PBS em um slide.</li>
		<li>Seção de transferência de 1X PBS (linha 12), em 50 µ l drop. Posicione cuidadosamente a seção na gota de PBS desdobramento do tecido e achatamento-lo suavemente a lâmina de vidro. Remova o excesso PBS com uma pipeta de vidro para evitar diluir o reagente de montagem. Não toque em seções com o bulbo de vidro.</li>
		<li>Pipetar 1 - 2 gotas de reagente de montagem contendo DAPI diretamente sobre a seção sobre como usar o slide de microscópio cuidados para não perturbar a orientação da seção. Delicadamente, coloque uma lamela de vidro de microscópio de 50 x 24 mm #1.5 sobre a seção.</li>
		<li>Limpar quaisquer bolhas de ar que se formou ao colocar a lamela e limpe o excesso de líquido fora das bordas da lamela. Preparar um novo slide e repetir a montagem process para cada seção.</li>
		<li>Seco-cura os meios de montagem, colocando os slides na noite escura à temperatura ambiente. Transferir os slides para 4 ° C para curto prazo (1-2 semanas) ou a-20 ° C para armazenamento a longo prazo (mais de 2 semanas). 
		Nota: Controlos negativos omitido os anticorpos primários para PGP9.5 ou PDH na etapa 1.4.2.2 e exibida sem rotulagem distinguíveis de nervos ou mitocôndria na epiderme. Positivo de controles foram realizadas para o PDH anticorpo para provar rótulos todas as mitocôndrias (dados não mostrados). Controles positivos foram realizados em neurônios de gânglio de raiz dorsal culta mouse principal que foram transformados com um baculovirus para mitocôndrias rótulo com um sinal de proteína fluorescente verde (GFP) fixo e manchados com o anticorpo do PDH e vermelho fluorescente anticorpo secundário. Todas as mitocôndrias que estavam expressando GFP foram co rotuladas com a etiqueta vermelha para imuno-histoquímica PDH (dados não mostrados).</li>
	</ol></li></ol> 2. Imagem latente confocal <ol><li>executar imagem latente confocal: <ol><li>coletar imagens usando um laser confocal microscópio com um 40 X objetivo de óleo-imersão (abertura numérica de 1.25 (N.A.)) em um microscópio invertido.
		<ol><li>Em cada plano focal sequencialmente adquirir sinais fluorescentes: núcleos: excitação λ = 405 nm, emissão espectral filtro λ = 420-480 nm fibras nervosas: excitação λ = 488 nm, emissão espectral filtro λ = 505-560 nm Mitoch ondria: excitação λ = 543 nm, emissão espectral filtro λ = 606-670 nm</li></ol></li> <li>Insira os seguintes parâmetros de verificação dentro do software de microscópio: taxa de varredura de 600 Hz, com uma média de quadro 2 e zoom de 2.2; resolução de intensidade de 12 bits (4096 cinza níveis).
		<ol><li>Definir o software microscópio para resolução lateral otimizada (varredura resolução = 1.024 x 1.024) e seccionamento óptico/resolução axial (confocal abertura = 1 unidade arejada (AU) com tamanho de z-etapa de 210 nm). 
			Nota: A resolução XYZ resultante é 172.2 nm x 172.2 nm, x 210 nm, com um tamanho de imagem de 176.1 µm x 176.1 µm x 30-50 µm.</li>
		</ol></li> <li>Ativar um scan ao vivo para o sinal do nervo (verde-fluorescência) e ajuste o controle de foco-z para encontrar e definir a parte superior e inferior focais aviões no software microscópio que englobam o sinal do nervo dentro da seção de tecido. O z-gama total é tipicamente 30-50 µm para uma secção de tecido de 50 µm.</li>
		<li>Girar o campo de digitalização com o software microscópio durante um scan ao vivo para que a epiderme é posicionada horizontalmente ou verticalmente na imagem.</li>
		<li>Scan cada sinal separadamente e ajuste o detector (tubo fotomultiplicador, pgto) tensão e deslocamento para minimizar ou remover qualquer sobre e sob pixels saturados. 
		Nota: Tempos de verificação com os parâmetros acima leva cerca de 20-40 min, dependendo do número de fatias de z.</li>
	</ol></li></ol> 3. 3D visualização e análise de mitocôndrias dentro humano fibras nervosas intraepidérmicas <ol><li>isolar a epiderme 3D: <ol><li>duplicar a imagem original e usar a intensidade máxima projeção (estendido vista foco) da imagem para identificar e isolar a epiderme.</li>
		<li>Usar uma ferramenta de interesse para o rastreamento ao longo das bordas superiores e inferiores da epiderme da região para remover áreas indesejadas, como o estrato córneo e derme que estão ausentes das fibras nervosas de intra-epidérmica. Colheita para esta selecção.</li>
	</ol></li> <li>Deconvolução de uso sobre o nervo e sinais fluorescentes mitocondriais: Nota: deconvolução ajuda a restaurar a integridade dos sinais fluorescentes. A restauração usada neste protocolo é chamada deconvolução cega porque ele usa os sinais fluorescentes nas imagens para determinar o quanto os sinais spread a partir de sua fonte original (ponto de espalhar função). O processo de melhora a resolução do sinal reatribuindo o sinal espalhado volta para seu local de origem.
	<ol><li>Calcular um ponto de espalhar função (PSF) para o sinal verde nervo fluorescente (verde-fluorescência) com os seguintes parâmetros: <ol><li>conjunto PSF calculado para confocal. Conjunto médio índice de refração para abertura de 1.515 e numérica de 1.25. Conjunto pinhole detector para 1 unidade arejada (U.A.). Comprimento de onda de excitação conjunto do laser de 488 nm e emissão de comprimento de onda a 515 nm.</li>
		</ol></li> <li>Calcular um PSF para o sinal mitocondrial fluorescente vermelho (vermelho-fluorescência) com os seguintes parâmetros: <ol><li>conjunto calculado PSF para confocal. Conjunto médio índice de refração para abertura de 1.515 e numérica de 1.25. Conjunto de pinhole detector para 1 AU. Conjunto da excitação comprimento de onda de 543 nm e emissão de comprimento de onda de 617 nm.</li>
		</ol></li> <li>Otimizar o nervo e mitocôndrias sinais fluorescentes por deconvolução usando o PSF correspondente listados acima e recurso de restauração iterativa definida em 100% de confiança e limite de uma iteração de 10 ciclos.</li>
	</ol></li> <li>Criar superfícies específicas do nervo: <ol><li>uso o &#34; criar superfície &#34; ferramenta para fazer uma superfície sólida dos nervos da deconvolved verde-fluorescente secundário rotulagem do PGP9.5 identificado nervos.</li>
		<li>Desmarque a &#34; suave &#34; apresentam e usar o recurso de intensidade absoluta para definir o limite para o sinal do nervo, uma vez que é significativamente mais brilhante do que a fluorescência de fundo.</li>
		<li>Usar o recurso de intensidade absoluta para definir o limite para o sinal do nervo, uma vez que é significativamente mais brilhante do que a fluorescência de fundo. Definir o valor de limiar baixo o suficiente para identificar com precisão os nervos.</li>
		<li>Filtro superfícies pequenas, não-nervo com base no tamanho. 
		Nota: Se necessário, edite manualmente adicionais não-nervo superfícies dentro o &#34; editar &#34; guia mantendo a tecla CONTROL para destacar vários objetos e em seguida, excluí-los com a tecla Delete.</li>
	</ol></li> <li>Isolar nervo específico fluorescente mitocondrial sinal: <ol><li>Selecione a guia Editar da superfície do nervo para exibir o &#34; Propriedades máscara &#34; característica. A superfície de nervo criada em passos 3.3 é usada para isolar as mitocôndrias dentro desses nervos longe sinais mitocondriais associados com os queratinócitos.</li>
		<li>Como o &#34; máscara todos &#39; botão abre um &#34; canal de máscara &#34; janela, escolher a puxar para baixo o menu sob o sinal vermelho-fluorescente deconvolved &#34; seleção de canal &#34; pelo sinal mitocondrial.</li>
		<li>Clique na caixa para colocar uma marca de seleção &#34; canal duplicado antes de aplicar a máscara &#34; opção.</li>
		<li>Clique no rádio botão na parte frontal o &#34; constante dentro/fora &#34; opção de máscara de configurações e clique na caixa para colocar uma marca de verificação &#34; definir voxel fora da superfície para &#34; opção e digite 0,00 para o valor. Botão de Okey clique para criar o novo canal que representa mitocondriais sinais dentro da superfície de nervo.</li>
	</ol></li> <li>Criar superfícies específicas de mitocôndrias: <ol><li>uso o &#34; criar superfície &#34; ferramenta para fazer uma superfície sólida das mitocôndrias do recém-criado canal fluorescente dos sinais específicos do nervo mitocondriais de passos 3.4.</li>
		<li>Desmarque o &#34; suave &#34; apresentam e selecione o &#34; fundo subtração &#34; característica para definir o limite. Esse recurso usa o contraste local ao redor do sinal mitocondrial para identificar mitocôndrias de fundo.</li>
		<li>Conjunto de valor de limite baixo o suficiente para identificar com precisão as mitocôndrias. Neste exemplo, o limite inferior foi fixado em 2.000 para uma escala de 16 bits (65.536).</li>
		<li>Filtro mitocondriais superfícies com base no tamanho. Neste exemplo, que o limite de voxel foi definido como 1,0 voxels, que é o mais baixo limite possível. Se necessário, edite manualmente superfícies não-mitocôndrias dentro o &#34; editar &#34; guia, mantendo a tecla CONTROL para selecionar vários objetos e em seguida, excluí-los com a tecla Delete. 
		Nota: Ocasionalmente, o software irá criar superfícies que não estão associadas com um sinal mitocondrial fluorescente distinguível. Nesses casos, é possível removê-los com o &#34; editar &#34; Tab</li>
	</ol></li> <li>De exportação e calcular valores morfométricos para análise: <ol><li>Exportar valores de nervo e superfícies mitocondriais do &#34; estatísticas &#34; guia para posterior análise com o software de planilha eletrônica.</li>
		<li>Exportar os valores de volume para o nervo e superfícies mitocondriais.</li>
		<li>Contar o número de fibras nervosas individuais presentes em cada imagem e gravar o valor na planilha eletrônica.</li>
		<li>Para cada imagem, calcular os seguintes valores de potenciais para análise na planilha eletrônica: <ol><li>soma dos volumes de todas as superfícies de nervo.</li>
			<li>Filtro específico nervo mitocondrial superfícies abaixo um volume de menos de 0,02 µm 3 e bin as superfícies pelo tamanho. Por exemplo, usar caixotes como 0,02 - 0,04 0,04 - 0.08 0.08 - 0,16, 0.16 - 0.32, 0.32 - 0,64, 0,64 - 1.28, 1.28-2,56, superior a 2,56 µm 3. 
			Nota: O limite inferior do volume mitocondrial foi definido como 0,02 µm 3 com base nos volumes publicados anteriormente de mitonchodria 36 , 37 , 38.</li>
			<li>Contar o número de superfícies mitocondriais de nervo específico dentro de cada bin e o número total das superfícies sobre as lixeiras (0,02 - superior a 2,56 µm 3).</li>
			<li>Calcular a proporção das superfícies mitocondriais de nervo específico em cada bin. Usa a contagem por bin dividido pelo número total de superfícies de mitocôndrias.</li>
			<li>Somar os volumes para todas as superfícies mitocondriais nervo específico.</li>
			<li>Calcular a proporção de nervo com sinal mitocondrial dividindo o volume de superfície total do nervo pela soma de todos os volumes de superfície mitocondriais.</li>
			<li>Calcular o número de mitocôndrias por volume de nervo dividindo o volume de superfície total do nervo pela contagem de todas as superfícies mitocondriais.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

Não há conflitos de interesse para declarar.

Este protocolo é projetado para isolar, quantificar e analisar o tamanho e a distribuição de mitocôndrias de nervo específico dentro IENFs em 3D de biópsias de pele humana. Existem vários passos críticos no protocolo. A imuno-histoquímica da fluorescência flutuante é projetada para manchar e analisar vários sinais em cada amostra, fornecendo uma metodologia mais versátil para pesquisa exploratório44,45. Este procedimento permite a penetração dos anticorpos no tec...

As mitocôndrias servem as funções celulares vitais que incluem a produção de energia celular, tampão cálcio e regulando necrótico e apoptose celular morte1,2,3. O sistema nervoso tem uma alta taxa metabólica, em comparação com o corpo4 , sugerindo que os neurônios geram um alto grau de energia celular na forma de adenosina trifosfato (ATP) através da respiração mitocondrial. Um monte de documentos de prova que funções neuronais são dependentes de ATP5, especialmente no sinapses6. Portanto, a distribuição de mitocôndrias dentro neurônios é importante.
Nos últimos 10 anos que um monte de informações mostrou que o tráfico e encaixe de mitocôndrias neuronais é altamente regulamentados. Proteínas do motor estão envolvidas na distribuição de mitocôndrias de compartimentos celulares específicos ao longo do neurônio. Tráfico de mitocôndrias é particularmente importante porque os neurônios projeto axônios e dendritos, longe do soma. Motor proteínas cinesina direto principalmente anterógrada (afastando-se da soma) tráfico de mitocôndrias ao longo dos microtúbulos, enquanto Dineína proteínas motor direto da motilidade retrógrada (em direção o soma)7,8,9 , 10. existem sinais de celulares como um potencial de membrana mitocondrial e condução do impulso que influenciam a presença e a direção de mitocondrial de tráfico11,12,13.
Além de transportar as mitocôndrias, existem proteínas especializadas para localizar as mitocôndrias de compartimentos celulares específicos que têm demandas de alta energia, tais como nós de Ranvier e sinapses8,14, 17. na verdade, a maioria das mitocôndrias dentro axônios são non-motile9,13,18. Proteínas especializadas como mitocôndrias de âncora syntaphilin de microtúbulos ao longo do axónio enquanto outras mitocôndrias de âncora de proteínas para o citoesqueleto de actina19–21. Íons como cálcio e fatores de crescimento têm sido relatados para apoiar a cessação do movimento de mitocôndrias localizá-los para regiões onde eles são necessários21,22,23.
Tomados em conjunto, o tráfico e o encaixe da mitocôndria são vitais para o bom funcionamento dos neurônios. Para apoiar isso, interrupção no tráfico mitocondrial tem sido associada com várias condições neurológicas, incluindo a doença de Alzheimer, esclerose lateral amiotrófica, doença de Charcot-Marie-Tooth, doença de Huntington, espástica hereditária paraparesia e atrofia óptica15,24,25,26,27. Estudos recentes têm-se centrado na disfunção mitocondrial e patologia como um mecanismo potencial para neuropatia diabética, a perda sensorial associada com diabetes28,29,30,31 de32, ,33. A hipótese é que o diabetes altera a distribuição de mitocôndrias dentro as projeções sensoriais do nervo cutâneo. Portanto, uma técnica foi desenvolvida para visualizar e quantificar as mitocôndrias dentro as fibras nervosas intraepidérmicas (IENFs), as pontas distais da raiz dorsal gânglio sensorial afferents. A técnica combina fluorescência immunohistochemistry específicos mitocondrial e rótulos de fibras nervosas com aquisição de z-series de microscopia confocal de sinais com software de análise de imagem 3D poderosa para medir a distribuição do nervo específico mitocôndrias de biópsias de soco cutâneo humano para atingir esse objetivo.

<table><tbody><tr><td>2% Zamboni's Fixative</td><td>Newcomer Supply, Middleton, WI&nbsp;</td><td>1459A</td><td>2% de paraformaldeído, 0,2% de ácido pícrico saturado em solução salina tamponada com fosfato (PBS), pH 7,4</td></tr><tr><td>10x solução salina tamponada com fosfato (PBS)&nbsp;</td><td>Fisher Scientific, Pittsburgh, PA</td><td>BP399-4</td><td>Para compor 1x PBS</td></tr><tr><td>Image-iT FX Signal Enhancer</td><td>ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts</td><td>I36933</td><td>aprimora os sinais de corante Alexa Fluor reduzindo a ligação inespecífica</td></tr><tr><td>Anti-Protein Gene Product 9.5 Antibody (Rabbit Polyclonal)</td><td>Proteintech Group Inc. Rosemont, IL</td><td>14730-1-AP</td><td>abreviado como PGP9.5, substitui o AbD Serotec descontinuado (Cat. No. 7863-0504) anticorpo</td></tr><tr><td>antipiruvato desidrogenase E2/E3bp anticorpo (monoclonal de camundongo)</td><td>abcam, Cambridge, MA</td><td>ab110333</td><td>abreviado como PDH</td></tr><tr><td>Cabra anti-camundongo Anticorpo secundário Alexa Fluor 594 conjugado</td><td>ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts</td><td>A-11034</td><td>anticorpo secundário conjugado vermelho-fluorescente</td></tr><tr><td>Cabra anticorpo secundário Alexa Fluor 488 conjugado</td><td>ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts</td><td>A-11032</td><td>anticorpo secundário conjugado verde-fluorescente</td></tr><tr><td>Albumina, do soro bovino</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>A7906-100</td><td>abreviado como BSA</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>T9284</td><td>abreviado como TX-100</td></tr><tr><td>0,22 &micro; m Filtro</td><td>EMD Millipore, Billerica MA</td><td>MILLEX GP SLGP 033NS</td><td>0.22 &micro; m Filtro Millipore</td></tr><tr><td>Parafilm M</td><td>Fisher Scientific, Pittsburgh, PA</td><td>13-374-10</td><td>Curwood Wisconsin LLC Parafilm M (PM-996)</td></tr><tr><td>Loop não calibrado</td><td>Fisher Scientific, Pittsburgh, PA</td><td>22-032092</td><td>inoculando Loop por Decon LeLoop (MP 199-25)</td></tr><tr><td>Placa de ensaio de 96 poços</td><td>Corning Incorporated, Corning, NY</td><td>3603</td><td>Placa de fundo plano de 96 poços</td></tr><tr><td>Prolong Gold reagente antidesbotamento com DAPI</td><td>ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts</td><td>P-36931</td><td>Coloração DAPI de núcleos Vidro de cobertura do</td></tr><tr><td>microscópio 50 x 24 mm</td><td>Fisher Scientific, Pittsburgh, PA</td><td>12-544E</td><td>Lamínulas</td></tr><tr><td>Superfrost Plus Lâminas de microscópio</td><td>Fisher Scientific, Pittsburgh, PA</td><td>12-550-15 Lâminas de</td><td>microscópio</td></tr><tr><td>Leica SP5 Microscópio confocal de varredura a laser</td><td>Leica Microsystems, Buffalo Grove, IL</td><td>SP5</td><td>Microscópio Confocal</td></tr><tr><td>Volocity x64 Software&nbsp;</td><td>Perkin Elmer, Waltham, MA</td><td>versão 4.4.0</td><td>O software Volocity é usado para as etapas 3.1 e 3.2 no protocolo para processamento de imagens</td></tr><tr><td>Imaris x64 3 Dimensional Analysis Software</td><td>Bitplane, Concord, MA</td><td>versão 7.7.1</td> O <td>software Imaris é usado para as etapas 3.3 a 3.5 no protocolo para análise de imagens</td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft, Redmond, WA</td><td>versão Office 2013</td><td>O software de planilha Excel é usado para a Etapa 3.6 no protocolo para resumir as características morfométricas</td></tr><tr><td>Composto de temperatura de corte ideal</td><td>Sakura Finetek USA, Inc., Torrance, CA</td><td>4583</td><td>abreviado como OCT</td></tr><tr><td>Leica Cryostat</td><td>Leica Biosystems, Buffalo Grove, IL</td><td>CM1850</td><td>Cryostat para corte 50 &micro; m seções</td></tr><tr><td>CellLight Mitocôndrias-GFP, BacMam 2.0</td><td>ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts</td><td>C10600</td><td>Usado como um controle positivo para marcar mitocôndrias com um sinal fluorescente verde</td></tr></tbody></table>

imagem tridimensional e análise de mitocôndrias dentro as fibras nervosas intraepidérmicas humana

Three-dimensional Imaging and Analysis of Mitochondria within Human Intraepidermal Nerve Fibers

O objetivo do presente protocolo é estudar as mitocôndrias dentro as fibras nervosas intraepidérmicas. Portanto, desenvolveram-se técnicas de análise e geração de imagens 3D para isolar o nervo específico mitocôndrias e avaliar alterações induzida por doença da mitocôndria na ponta distal dos nervos sensoriais. O protocolo combina imuno-histoquímica da fluorescência, microscopia confocal e técnicas de análise de imagem 3D para visualizar e quantificar mitocôndrias nervo específico. Parâmetros detalhados são definidos em todos os procedimentos a fim de fornecer um exemplo concreto de como usar essas técnicas para isolar o nervo específico mitocôndrias. Anticorpos foram usados para rotular o nervo e mitocondriais sinais dentro de seções de tecido da pele soco biópsias, que foi seguido por imunofluorescência indireta para visualizar os nervos e as mitocôndrias possuem um sinal fluorescente verde e vermelho, respectivamente. Z-série imagens foram adquiridas com microscopia confocal e software de análise 3D foi usado para processar e analisar os sinais. Não é necessário seguir os parâmetros exatos descritos dentro, mas é importante ser consistente com os escolhidos durante a coloração, etapas de aquisição e análise. A força deste protocolo é que é aplicável a uma ampla variedade de circunstâncias onde um sinal fluorescente é usado para isolar outros sinais que seriam impossíveis estudar sozinho.

Visualização e quantificação das mitocôndrias dentro de IENFs humanas
Imuno-histoquímica da fluorescência permite a marcação simultânea de múltiplos sinais dentro de biópsias de pele humana para visualizar os nervos, mitocôndrias e núcleos. Uma placa de 96 poços é uma maneira conveniente de organizar as etapas do procedimento de imuno-histoquímica. A Figura 1 mostra que este contas ...

Este protocolo usa tridimensional (3D) de imagem e análise técnicas para visualizar e quantificar mitocôndrias nervo específico. As técnicas são aplicáveis a outras situações onde um sinal fluorescente é usado para isolar um subconjunto de dados de outro sinal fluorescente.

Imagem tridimensional e análise de mitocôndrias dentro as fibras nervosas intraepidérmicas humana

The goal of this protocol is to study mitochondria within intraepidermal nerve fibers. Therefore, 3D imaging and analysis techniques were developed to ...

O objetivo geral dessa técnica de imagem e análise é isolar informações específicas de um sinal complexo. Especificamente, este protocolo descreve como visualizar e quantificar mitocôndrias específicas de nervos juntamente com outras mitocôndrias dentro da epiderme. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de neurologia, como, por exemplo, como as mitocôndrias presentes nas fibras nervosas intraepidérmicas de indivíduos saudáveis se comparam às mitocôndrias específicas de nervos de pacientes com complicações neurológicas.A principal vantagem desta técnica é que tomamos um sinal complexo e extraímos informações específicas a partir dele. Este protocolo nos ajuda a isolar um sinal específico, como o sinal nestes canudos, dos sinais ao seu redor. Prepare-se para a coloração de imunohistoquímica por fluorescência de biópsias de pele rotulando primeiro uma placa de 96 poços de acordo com este esquema.Em seguida, pipete 150 microlitros da solução estoque do potenciador de sinal para reduzir a ligação inespecífica dos anticorpos secundários em cada poço da linha superior. Prepare os poços de lavagem adicionando 150 microlitros de solução salina tamponada com fosf

three-dimensional-imaging-analysis-mitochondria-within-human

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Fonte: Hamid, H. S., et al. Imagem tridimensional e análise de mitocôndrias dentro de fibras nervosas intraepidérmicas humanas. J. Vis. Exp. (2017) Este vídeo demonstra o método para visualizar mitocôndrias específicas do nervo usando imagens tridimensionais. Ele descreve o processo de aquisição de varreduras sequenciais de fibras nervosas intraepidérmicas pré-marcadas e geração de imagens de superfície 3D para isolar e exibir mitocôndrias em relação às estruturas nervosas.

Visualização de mitocôndrias dentro das fibras nervosas intraepidérmicas

A fim de estudar as alterações de fibras nervosas intra-epidérmica nociceptivos (IENFs) em neuropatias dolorosas (PN), protocolos que nós desenvolvemos pode examinar directamente as alterações morfológicas observadas tridimensionais em IENFs nociceptivos. Análise tridimensional de IENFs tem o potencial de avaliar as alterações morfológicas de IENF na PN.

Imagem tridimensional de nociceptivos Fibras Nervosas intraepidérmicos em biópsias de pele humana

O protocolo para a imagem latente longitudinal dinâmico e lesão seletiva a laser de terminações nervosas em repórter camundongos transgênicos é apresentado.

In Vivo Two-Photon Microscopia de terminações nervosas individuais em Pele

Quadridimensional (4D) de imagem é utilizada para estudar o comportamento e as interacções entre os dois tipos de endossomas em terminais nervosos vertebrado vivo. O movimento destas pequenas estruturas é caracterizado em três dimensões, permitindo a confirmação de eventos, tais como a fusão do endossoma e exocitose.

Visualização de endosome Dynamics em Viver terminais nervosos com quatro-dimensional imagens de fluorescência

A visualização e análise mitocondrial do tecido cerebral de mamíferos é uma tarefa desafiadora. Aqui, descrevemos como a análise de reconstrução tridimensional (3D) da microscopia eletrônica de varredura serial (SBFSEM) pode ser usada para obter insights sobre a análise morfológica e volumétrica dessa organela geradora de energia crítica.

Análise do Cérebro mitocôndrias Usando Serial Block-cara Scanning Electron Microscopy

Transporte mitocondrial prejudicado e morfologia estão envolvidos em várias doenças neurodegenerativas. O protocolo apresentado usa neurônios cerebrais derivados de células-tronco pluripotentes induzidas para avaliar o transporte mitocondrial e a morfologia em paraplegia espástica hereditária. Este protocolo permite a caracterização do tráfico mitocondrial ao longo de axônios e análise de sua morfologia, o que facilitará o estudo de doenças neurodegenerativas.

Analisando o Transporte Mitocondrial e a Morfologia em neurônios derivados de células-tronco pluripotentes induzidos por humanos em Paraplegia Espástica Hereditária

Descrevemos métodos de fotoativação de fluorescência para analisar o transporte axonal de neurofilamentos em axônios mieliados únicos de nervos periféricos de camundongos transgênicos que expressam uma proteína de neurofilamento fotoativavel.

Imagem e Análise do Transporte de Neurofilamento em Nervo Tibial de Camundongo Excised

Usando camundongos fluorescentes transgênicos, protocolos detalhados são descritos para avaliar o transporte in vivo axonal de endosários e mitocôndrias dentro de axônios motores e sensoriais do nervo ciático intacto em animais vivos.

Expansão do Kit de Ferramentas para Imagens In Vivo do Transporte Axonal

Este protocolo descreve como reconstruir cristas mitocondriais para obter imagens 3D com alta precisão, alta resolução e alto rendimento.

Uma técnica tridimensional para a visualização de alterações ultraestruturais mitocondriais em células cancerosas pancreáticas

Este estudo apresenta uma abordagem in vivo de imagem de dois fótons para visualizar as estruturas dos terminais axônicos de mecanorreceptores de baixo limiar (LTMR) na pele da pata dianteira de camundongos. Utilizando imagens repetidas e de alta resolução de axônios individuais, esse método oferece uma nova plataforma para estudar a estrutura e a função do circuito sensorial cutâneo durante o desenvolvimento e em adultos.

Imagem Intravital de Dois Fótons da Morfologia do Axônio Sensorial de Toque em Pele de Camundongos

Injeções locais de um corante mitocondrial marcando mitocôndrias da célula terminal de Schwann in vivo para microscopia confocal. Esse método utiliza prova de conceito demonstrada em tecido muscular esquelético de camundongos com músculo saudável ou doente para fornecer visualização mitocondrial de alta resolução.

Métodos para Quantificação In Situ da Morfologia Mitocondrial em Células Musculares e Terminais de Schwann de Camundongos

Aprenda a visualizar e quantificar mitocôndrias específicas de nervos em biópsias de pele humana usando imagem tridimensional e imunohistoquímica de fluorescência. Este método isola sinais específicos de fundos complexos para estudar doenças neurológicas.

Imagem tridimensional e análise de mitocôndrias dentro as fibras nervosas intraepidérmicas humana

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