Imagem tridimensional e análise de mitocôndrias dentro as fibras nervosas intraepidérmicas humana

O objetivo geral desta técnica de imagem e análise é isolar informações específicas de um sinal complexo. Especificamente, este protocolo descreve como visualizar e quantificar mitocôndrias específicas do nervo com outras mitocôndrias dentro da epiderme. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da neurologia, como como as mitocôndrias dentro das fibras nervosas intraepidérmicas de indivíduos saudáveis se comparam às mitocôndrias específicas do nervo de pacientes com complicações neurológicas.

A principal vantagem dessa técnica é que pegamos um sinal complexo e extraímos informações específicas dele. Este protocolo nos ajuda a isolar um sinal específico, como o sinal nesses canudos, dos sinais ao seu redor. Prepare-se para a coloração imuno-histoquímica de fluorescência de biópsias de pele rotulando primeiro uma placa de 96 poços de acordo com este esquema.

Em seguida, pipete 150 microlitros de solução intensificadora de sinal de estoque para reduzir a ligação inespecífica de anticorpos secundários em cada poço da linha superior. Prepare os poços de enxágue adicionando 150 microlitros de solução salina tamponada com fosfato 1x em cada poço nas fileiras dois e três da placa de 96 poços. Em seguida, adicione 150 microlitros de solução de bloqueio de 5% BSA nos poços da linha quatro.

Dilua os anticorpos primários PGP9.5 e PDH em 1.500 microlitros de solução de enxágue a 1% BSA e adicione 150 microlitros a cada poço na linha cinco. Use um loop de inoculação para transferir as seções para a solução intensificadora de sinal na linha um. Uma vez que as seções estejam na solução primária de anticorpos na linha cinco, envolva a placa firmemente com filme de laboratório para evitar a evaporação e, em seguida, agite as amostras em um balancim plano em temperatura ambiente por uma hora.

Incubar com balanço durante a noite a quatro graus Celsius. Comece o segundo dia do procedimento pipetando 150 microlitros de solução de enxágue 1% BSA para os poços nas fileiras seis, sete e oito da placa de 96 poços. Adicione os anticorpos secundários conjugados com fluoróforo a 1.500 microlitros de 1% BSA.

Em seguida, pipetar 150 microlitros da solução de anticorpos secundários em cada poço da linha nove. Enxágue as seções passando pelos poços seis, sete e oito. Assim que as seções estiverem na solução de anticorpo secundário na linha nove, embrulhe a placa em parafilme e cubra com papel alumínio para proteger os sinais de fluorescência.

Incube com balanço como antes. No terceiro dia, pipete 150 microlitros de PBS 1x filtrado estéril nas fileiras 10, 11 e 12. Transfira as amostras para a linha 10 e cubra a placa com papel alumínio.

Enxágüe por uma hora em temperatura ambiente com balanço. Em seguida, prepare uma lâmina de microscópio para montar as seções pipetando 50 microlitros de 1x PBS filtrado na lâmina. Quando os enxágues estiverem concluídos, transfira uma seção da linha 12 para a lâmina e adicione uma a duas gotas de reagente de montagem contendo DAPI diretamente na parte superior da seção.

Coloque suavemente uma lamínula de vidro de microscópio de 50 milímetros por 24 milímetros 1,5 sobre a seção. Coloque as lâminas no escuro durante a noite em temperatura ambiente para curar o meio de montagem antes de armazenar ou criar imagens das lâminas. Selecione a objetiva de imersão em óleo 40X em um microscópio confocal de varredura a laser invertido.

Selecione os lasers e detectores apropriados para obter imagens dos núcleos, fibras nervosas e mitocôndrias. Insira os seguintes parâmetros de varredura no software do microscópio, resolução de intensidade de 12 bits, taxa de varredura de 500 Hertz com média de dois quadros e zoom de 2,2. Defina o software do microscópio para resolução lateral otimizada selecionando uma resolução de varredura de 1024 por 1024.

Otimize a resolução axial e o corte óptico selecionando uma abertura confocal de uma unidade de ar com um tamanho de passo Z de 210 nanômetros. Varra cada sinal separadamente e ajuste a tensão e o deslocamento do detector para remover quaisquer pixels saturados demais e insuficientes. Ative uma varredura ao vivo para o sinal nervoso e ajuste o controle de foco Z para encontrar e definir os planos focais superior e inferior no software do microscópio que abrangem o sinal nervoso dentro da seção de tecido.

Digitalize a série Z final com varredura sequencial para eliminar a diafonia do sinal de fluorescência. Isole a epiderme do estrato córneo e da derme desenhando uma região ao redor da epiderme usando uma ferramenta de seleção em uma imagem duplicada da imagem original. Em seguida, corte a imagem para a seleção.

Calcule as funções de dispersão de pontos para os sinais confocais de fluorescência verde e vermelho usando o recurso calcular função de propagação. Em seguida, defina os parâmetros para o índice de refração médio para óleo em 1,515 e a abertura numérica para a objetiva de óleo 40X em 1,25. Defina o orifício do detector em uma unidade de ar e escolha um comprimento de onda de excitação do laser.

Use a restauração iterativa definida como 100% de confiança, limite de iteração de 10 ciclos e os PSFs verde e vermelho para a desconvulação dos sinais de fluorescência verde e vermelho. Use a ferramenta criar superfície para criar uma superfície ao redor dos sinais nervosos deconvolvidos selecionando desmarcar recurso suave, intensidade absoluta para limiar, um limite inferior de 3.000 e um limite superior de 65.535. Mantenha as superfícies acima de 10 voxels.

Remova as superfícies não nervosas usando a guia editar na superfície do nervo para selecionar superfícies não nervosas únicas ou mantenha pressionada a tecla Control para selecionar várias superfícies não nervosas. Exclua as superfícies não nervosas selecionadas pressionando o botão Excluir. Use a guia de edição na superfície do nervo e pressione o botão mascarar tudo nas propriedades da máscara.

Na nova janela, selecione o canal cinco mitocôndrias deconvolvidas sob a seleção de canal e, em seguida, marque o canal duplicado antes de aplicar a máscara. Pressione o botão de opção para dentro/fora constante e verifique a superfície externa dos voxels definidos para 0.0 e pressione o botão OK. Por fim, crie superfícies específicas para mitocôndrias usando a ferramenta criar superfície para criar uma superfície ao redor dos sinais mitocondriais desconvolutivos mascarados, selecionando desmarcar recurso suave e usando a subtração de fundo para limite.

Defina o diâmetro da esfera maior para 1,50 micrômetros, o limite inferior para 2.000 e o limite superior para o máximo de 65.535. Certifique-se de manter as superfícies acima de 1,0 voxels. Esta imagem representativa de microscopia confocal 3D ilustra o sinal de fluorescência verde específico do nervo.

Uma superfície 3D mostrada em ciano é criada para o sinal nervoso. Em seguida, o sinal mitocondrial específico do nervo é isolado do resto dos sinais mitocondriais epidérmicos usando a superfície do nervo como uma ferramenta de mascaramento. O sinal de fluorescência vermelha mitocondrial específico do nervo resultante é usado para criar superfícies mostradas como magenta ao redor das mitocôndrias dentro da superfície do nervo, que é mostrada em ciano.

Isso permite que as mitocôndrias nas fibras nervosas sejam vistas em detalhes. Aqui, os dados da superfície mitocondrial são apresentados como um histograma de frequência de tamanho para visualizar a porcentagem de mitocôndrias que estão presentes em cada uma das várias curvas de acordo com seu volume. Ao tentar este procedimento, é importante cuidar do tecido durante o processo de coloração para garantir que o tecido esteja totalmente submerso nas soluções para fornecer uma coloração uniforme e consistente em todas as seções.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como visualizar e quantificar as mitocôndrias nas fibras nervosas intraepidérmicas humanas. Nosso protocolo detalhado foi projetado para ensinar outros investigadores a colorir, visualizar, processar e analisar biópsias de pele humana com o objetivo de entender os mecanismos subjacentes à patogênese de doenças neurológicas mitocondriais, como a neuropatia.