Construção de Engineered Definido cardíaca humana Tecidos para estudar os mecanismos da terapia celular cardíaca

Este manuscrito descreve a criação de tecidos cardíacos projetados definidos usando expressão de marcadores de superfície e classificação celular. Os tecidos definidos podem então ser usados em um biorreator multitecido para investigar os mecanismos da terapia com células cardíacas, a fim de fornecer um sistema modelo funcional, mas controlado, do coração humano.

O objetivo geral deste procedimento é criar tecidos cardíacos projetados por humanos de uma composição celular definida. Este método pode abordar os principais desafios no campo da engenharia de tecidos cardíacos, incluindo o controle da variabilidade e eficiências de diferenciação cardíaca e a compreensão de como tipos específicos de células afetam a função contrátil cardíaca. A principal vantagem dessa técnica é que o resultado final é um tecido cardíaco projetado por humanos de composição controlada e definida.

As replicações dessa técnica se estendem à terapia para doenças cardíacas porque os tecidos definidos podem fornecer uma plataforma de triagem nova, biologicamente relevante e biomédica, capaz de avaliar intervenções terapêuticas. Embora esse método possa fornecer informações sobre novas terapias cardíacas, o sistema de tecido cardíaco projetado por humanos também pode ser usado para entender os mecanismos da terapia com células cardíacas. Começando com culturas de cardiomiócitos derivados de células-tronco embrionárias humanas, lave as células uma vez com PBS e adicione um mililitro de 0,04% de tripsina-EDTA.

Incube as células por 10 minutos a 37 graus Celsius e 5% de CO2. Quando as células estiverem incubando, adicione 12 microlitros de inibidor de ROCK a seis mililitros de solução de neutralização de tripsina. Remova as placas da incubadora e adicione um mililitro da solução de neutralização a cada poço da placa de seis poços.

Transfira todas as células de cada poço para um único tubo de centrífuga de 15 mililitros. Lave todos os seis poços com um volume de três mililitros de PBS e combine essa lavagem com as células do tubo. Centrifugue o tubo a 300 vezes G por cinco minutos a quatro graus Celsius para peletar as células.

Para preparar as células para a classificação de células vivas por FACS, prepare o tampão de coloração adicionando cinco mililitros de FBS e 50 microlitros de inibidor de ROCK a 45 mililitros de PBS no gelo. Remova o sobrenadante das células peletizadas e ressuspenda-as em 1,2 mililitros de tampão de coloração. Transfira 200 microlitros das células suspensas para um novo tubo de centrífuga pré-resfriado de 50 mililitros no gelo.

Em seguida, transfira o mililitro restante da suspensão celular para um novo tubo de centrífuga pré-resfriado de 50 mililitros no gelo e adicione dois microlitros de SIRP alfa-PE / Cy7 e quatro microlitros de anticorpos CD90-FITC. Misture suavemente a suspensão celular com uma pipeta de transferência e coloque o tubo no gelo. Incubar os dois tubos de 50 mililitros que contêm o controlo negativo e a amostra num agitador de balancim em gelo a quatro graus Celsius durante uma hora.

Enquanto as células estão incubando, transfira três mililitros de meio de diferenciação dois para cada um dos dois tubos de centrífuga de 15 mililitros. Em seguida, adicione três microlitros de inibidor de ROCK e armazene esses tubos de coleta de FACS no gelo antes do uso. Em seguida, pulverize as células coradas a 300 vezes G por cinco minutos a quatro graus Celsius.

E lave-os duas vezes com 10 mililitros de PBS gelado. Ressuspenda suavemente o pellet de amostra com um a três mililitros de tampão de coloração contendo DAPI. Adicione 500 microlitros de tampão de coloração sem DAPI ao pellet de controle negativo.

Filtre ambas as suspensões celulares através de um filtro de células de 40 mícrons para remover aglomerados de células e, em seguida, transfira-as para tubos FACS de poliestireno no gelo. Traga imediatamente as amostras para o classificador de células. Começando com a amostra de controle de coloração negativa, estabeleça os parâmetros de gating.

Em seguida, ao executar as células de amostra, selecione a população de células vivas negativas DAPI. Colete as populações de células FITC positivas e PE/Cy7 positivas independentemente a 20 PSI. Após a cultura e reagregação das células, conforme indicado no protocolo de texto, remova as placas de cultura de células da incubadora e transfira o meio para um tubo de centrífuga de 50 mililitros.

Lave as placas com três mililitros de PBS e transfira a lavagem para o mesmo tubo de centrífuga de 50 mililitros. Em seguida, adicione três mililitros de 0,04% de tripsina-EDTA às placas e incube a 37 graus Celsius e 5% de CO2. Após cinco minutos, examine as placas quanto ao descolamento celular usando um microscópio.

Depois que todas as células se separarem, adicione três mililitros de solução de neutralização de tripsina às placas. Misture suavemente e transfira as células para o tubo de centrífuga original de 50 mililitros. Lave as placas com cinco mililitros de PBS e adicione essa lavagem ao tubo também.

Pulverizar as células por centrifugação a 300 vezes G durante cinco minutos à temperatura ambiente. Remova o sobrenadante e ressuspenda o pellet em um mililitro de soro bovino neonatal ou meio NBS. Em seguida, transfira as células para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro.

Pulverizar as células a 300 vezes G durante cinco minutos à temperatura ambiente e remover o sobrenadante. Para começar a gerar os seis tecidos cardíacos projetados, dilua 60,0 microlitros do estoque de colágeno de cinco miligramas por mililitro para 3,125 miligramas por mililitro com 1,5 microlitros de hidróxido de sódio de um molar, 9,6 microlitros de PBS 10X e 24,9 microlitros de água ultrapura estéril. Aqui, é fundamental evitar a introdução de bolhas de ar na mistura de colágeno, pois as bolhas de ar demoram a se soltar da solução viscosa e podem interferir na formação do tecido durante a compactação do tecido.

Pipete pela lateral do tubo de 15 mililitros para adicionar 12,0 microlitros cada um de 10X MEM e 0,2 pilhas normais em pH 9 para diluir a mistura de colágeno. Em seguida, adicione a matriz da membrana basal à mistura de colágeno até uma concentração final de 0,9 miligramas por mililitro e misture delicadamente. Armazene esta mistura final de tecido no gelo.

Em seguida, transfira toda a mistura de tecidos para o pellet celular e adicione células suplementares conforme indicado no protocolo de texto. Encha o tubo até um volume final de 150 microlitros com meio NBS sem células e misture suavemente. Pipetar cuidadosamente 25 microlitros da suspensão celular em cada um dos seis poços da placa de base do biorreator.

Repita o procedimento de mistura entre cada poço para ressuspender quaisquer células que possam ter se acomodado. Pipetar apenas um tecido por alvéolo de cada vez para garantir um volume e número de células consistentes por tecido. Separadamente, empurre duas fileiras de polidimetilsiloxano, ou PDMS, sensores de força em ambos os lados da estrutura de polissulfona para formar seis pares de postes opostos.

Inverta a estrutura na parte superior da placa de base para que um par de postes entre em cada poço contendo a suspensão da célula. Em seguida, coloque o biorreator em um prato de 60 milímetros e coloque esse prato sem a tampa dentro de um prato de 10 centímetros. Coloque a tampa no prato de 10 centímetros e mova todo o conjunto do biorreator para a incubadora de cultura de tecidos.

Após duas horas de incubação, remova o conjunto do biorreator e adicione 14 mililitros de meio NBS para cobrir a placa de base. Retorne o biorreator para a incubadora de cultura de células e troque metade do meio todos os dias. Após 48 horas, remova a placa de base suavemente alguns milímetros de cada vez.

Em seguida, retorne o biorreator com o tecido voltado para o meio. Se um lenço cair de um poste ao remover a placa de base, recoloque cuidadosamente o lenço no poste. A diferenciação de células-tronco embrionárias humanas resulta em uma cultura mista principalmente de cardiomiócitos e fibroblastos que se auto-organizam em aglomerados e formam teias robustas em todo o prato.

A classificação FACS dessas culturas revelou que esse método de diferenciação resulta em uma população que contém pelo menos 65% de células alfa positivas para SIRP e 10% de células positivas para CD90. Depois de remover a placa de base, os tecidos cardíacos projetados por humanos, ou HECTs, podem se auto-montar dentro do biorreator. HECTs maduros e compactados desviam visivelmente os postes de detecção de força integrados com uma média de cinco a 15 micronewtons de força.

As medições da força de contração revelam como variáveis isoladas alteram a força contrátil nesses tecidos projetados definidos. Aqui, quando os tecidos são suplementados com células-tronco mesenquimais humanas a 10%, um aumento substancial da força contrátil é observado nas frequências de estimulação de um e dois hertz. Uma vez dominada, a diferenciação levará aproximadamente 20 dias, a classificação das células cerca de cinco horas e a construção do tecido cerca de três horas.

Outros sete dias serão necessários para a formação adequada do tecido após a construção. Após este procedimento, outros métodos, incluindo marcação celular e suplementação da mistura de tecidos, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais sobre os efeitos de interações célula-célula específicas ou para determinar os mecanismos da terapia celular. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como criar tecidos cardíacos projetados por humanos com uma composição celular conhecida e controlada.