Controle óptico de células vivas atividade elétrica por conjugados Polymers

O objetivo geral deste método é controlar o potencial da membrana celular após a estimulação por pulsos de luz visível. O processo de fototransdução é mediado por um polímero conjugado sensível à luz. Este método fornece uma nova ferramenta no campo das tecnologias, pois representa uma alternativa valiosa aos métodos existentes, como optogenética e estimulação térmica para controle óptico da atividade de células vivas.

As principais vantagens desta técnica são a pronta integrabilidade com qualquer tipo de eletrofisiologista, a resolução especial e temporal potencialmente alta, reduzem a invasividade. Além disso, permite evitar uma transferência de genes que é exigida pela optogenética. Nosso método é descrito aqui para fotoestimulação de cultura de células in vitro.

Mas também pode abrir oportunidades interessantes para aplicações in vivo. Demonstrando o procedimento estarão Caterina Bossio e Susana Vaquero Morata para pós-doutorandos de nossos laboratórios com formação em química biológica e física, respectivamente. Para começar, prepare uma solução do polímero conjugado sensível à luz misturando P3HT e PCBM em clorobenzina a uma concentração relativa de um para um.

Misture a solução com um agitador magnético por pelo menos quatro horas a 60 graus Celsius. Em seguida, limpe as lâminas de vidro revestidas com óxido de índio e estanho com banhos consecutivos de 10 minutos de água deionizada, acetona e isopropanol em um sonicador. Seque as lamínulas com uma pistola de nitrogênio e, em seguida, trate os substratos com um limpador de plasma.

Depois de limpo, coloque a corrediça no mandril de um spincoater, com o lado revestido com ITO voltado para cima. Em seguida, adicione 150 microlitros da solução P3HT PCBM à lâmina e gire a amostra. Depois que o spincoater for finalizado, remova a amostra e use um cotonete de sala limpa embebido em acetona para limpar a parte de trás do substrato.

Esterilize os substratos fotoativos colocando-os em um recipiente coberto resistente ao calor e aquecendo-os a 120 graus Celsius por duas horas. Em seguida, transfira as amostras para um capuz estéril e deixe esfriar. A partir deste ponto, mantenha a esterilidade das amostras.

Coloque os substratos fotoativos em uma placa de seis poços. Dada a hidrofobicidade da camada de polímero conjugado, faça um poço de polidimetilsiloxano para fixar a amostra e confine as soluções conforme descrito no protocolo de texto que acompanha. Em seguida, coloque os substratos fotoativos nos poços da placa e cubra toda a superfície de cada amostra com 500 a 750 microlitros de uma solução de dois miligramas por litro de fibronectina em PBS.

Incubar as amostras a 37 graus Celsius por pelo menos uma hora. Após a incubação, use uma pipeta de vidro para remover a solução de fibronectina e, em seguida, lave os substratos uma vez com dois mililitros de PBS. Primeiro, adicione um volume total de 750 a 1.000 microlitros de meio de crescimento completo por poço.

Em seguida, coloque 15.000 células AGK293 por centímetro quadrado de substrato fotoativo em cada poço. Em seguida, incube as células por 24 a 48 horas. As células podem ser facilmente cultivadas nos substratos fotoativos, desde que uma camada de adesão adequada, como a fibronectina, seja depositada.

Para começar, prepare as soluções extracelular e intracelular conforme descrito no protocolo de texto que acompanha. Esterilize as soluções passando-as por um filtro de 0,2 mícron. Em seguida, pré-aqueça a solução extracelular colocando-a em banho-maria a 37 graus Celsius.

Além disso, encha uma seringa de um mililitro com a solução intracelular e equipe-a com uma agulha de calibre 34. Mantenha a solução intracelular em contato com o gelo para evitar a degradação do ATP. Em seguida, pegue um substrato revestido de célula da incubadora e remova cuidadosamente o poço PDMS.

Em seguida, remova o meio de crescimento com uma pipeta de vidro e lave a amostra lentamente com solução extracelular para evitar o descolamento celular. Adicione três mililitros de solução extracelular a cada poço e, em seguida, transfira a placa para o suporte de amostra da estação de eletrofisiologia. Uma vez no lugar, coloque o eletrodo de referência no poço a ser testado.

Em seguida, prepare uma micropipeta de vidro fresco para patch clamp usando um extrator de micropipeta. Encha metade da pipeta com solução intracelular. Use o micromanipulador para posicionar a pipeta de remendo próxima à membrana celular selecionada.

Durante o posicionamento, aplique sobrepressão na pipeta para evitar que a sujeira grude na ponta. Com a pipeta alguns mícrons acima da célula, comece a abaixar a pipeta em direção à membrana celular enquanto controla a resistência da pipeta no software de controle de patch. Quando a resistência da pipeta aumentar cerca de um megaohm, remova a sobrepressão e aplique uma sucção suave para formar o gigaseal entre a pipeta e a membrana celular.

Em seguida, aplique um potencial negativo de 40 milivolts negativos à pipeta para ajudar a estabilizar a vedação. Compense a transitoriedade capacitiva devido à capacitância da pipeta com os respectivos comandos no patch amplifier e/ou no software de controle de patch. Aplique um impulso de sucção breve e intenso na pipeta para romper a membrana e permitir o acesso elétrico ao citoplasma da célula.

Em seguida, defina o patch amplifier para o modo de pinça de corrente para que nenhuma corrente seja injetada na célula. No modo de pinça atual, rastreie o potencial da membrana celular e aguarde alguns minutos para que ele se estabilize. Uma vez estável, aplique o protocolo de iluminação desejado à célula, iluminando a membrana fotoativa sob a célula com luz na faixa de 450 a 600 nanômetros.

Registre o efeito da luz no potencial de membrana. Pulsos curtos de luz em torno de 10 a 20 milissegundos resultam em uma despolarização transitória da célula, enquanto com iluminação prolongada na ordem de centenas de milissegundos são sustentadas, a hiperbolização é observada até que a luz seja desligada. A estimulação óptica das células mediada pelos substratos fotoativos pode resultar em diferentes efeitos na membrana celular, dependendo da duração do estímulo luminoso.

Um pico rápido, como o mostrado aqui, é seguido por uma despolarização transitória da ordem de dezenas de milissegundos. Para pulsos curtos de luz quando a luz é desligada, observa-se um comportamento oposto. Esses sinais foram atribuídos a uma variação na capacitância da membrana devido ao aquecimento local após a absorção de luz.

Para iluminação prolongada, a despolarização inicial se transforma em uma hiperpolarização celular. Este fenômeno tem novamente uma origem térmica, mas, neste caso, está relacionado a uma variação do potencial de equilíbrio da membrana devido a uma mudança nas condutividades do canal iônico induzida pelo aumento da temperatura. É importante notar que esta técnica é bastante flexível e pode ser adaptada às necessidades particulares de um experimento específico, por exemplo, alterando o polímero fotóxico, o processo de fabricação ou o protocolo de iluminação.

No entanto, antes de alterar o protocolo, deve-se primeiro verificar as propriedades importantes do polímero ativo, como sua biocompatibilidade, adequação ao processo de esterilização, estabilidade eletroquímica e temporal. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como realizar uma interface híbrida entre polímeros conjuntivos e células vivas e como usá-la para controle óptico da atividade celular. Acreditamos que esta técnica também promete se tornar uma ferramenta complementar em neurociência para investigações in vitro e também abrir uma nova perspectiva de aplicações in vivo.

Para refinar o protocolo, no entanto, é necessário um esforço forte e conjunto de cientistas de materiais e neurocientistas, físicos e médicos.