Um ELISA baseada Encadernação e Método de competição de determinar rapidamente interacções ligando-receptor

Os objetivos deste método baseado em ELISA são, em primeiro lugar, determinar a afinidade de ligação de uma citocina ao seu receptor e, em segundo lugar, medir os efeitos de bloqueio de peptídeos inibitórios da interação ligante-receptor. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo das interações proteína-proteína, como a ligação citocina-receptor. As afinidades de ligação e o bloqueio destes podem aumentar a compreensão geral da dinâmica de interação.

A principal vantagem dessa técnica é que ela é fácil de executar, gera receptores de marcação e é relativamente barata, devido ao fácil acesso a dispositivos prontamente disponíveis, como o leitor ELISA. Embora esse método possa fornecer informações sobre a interação do receptor de citocinas, ele também pode ser aplicado a outros sistemas, como interações proteína-proteína gerais e o design de compostos bloqueadores para inibir as interações específicas. Prepare as soluções conforme descrito no protocolo de texto.

Certifique-se de filtrar o tampão de revestimento de carbonato com uma membrana PES de 0,22 mícron. Use um aspirador. Além disso, faça 10 concentrações diferentes de cada ligante ou peptídeo.

Existem dois ensaios descritos neste vídeo, o primeiro é a interação direta do receptor ligante, ELISA. Ele pode ser usado para medir a constante de dissociação receptor-ligante, que representa a afinidade de ligação receptor-ligante. O segundo ensaio é um ELISA de interação ligante-receptor de competição recentemente otimizado.

Isso permite a triagem de peptídeos e outros compostos bloqueadores, que atuam para interferir na interação receptor-ligante. Para maior eficiência, prepare-se para usar pipetas multicanal para placas de 96 poços e, ao decantar, apenas despeje seu conteúdo. Comece este procedimento revestindo a placa com um receptor recombinante.

Primeiro, dilua o receptor em tampão carbonato para 100 nanogramas por microlitro. Em seguida, carregue os poços da placa com 100 microlitros de solução receptora. Exclua as paredes externas para evitar lidar com o artefato da borda da placa.

Cubra a placa e incube-a a 4 graus Celsius durante a noite. Execute todas as incubações de placas com um giro suave. No dia seguinte, remova a solução de revestimento e lave a placa três vezes com a solução de lavagem, PBS com um toque de Tween 20.

Em seguida, bloqueie os locais de ligação do receptor livre adicionando 200 microlitros de 5% PSA. Deixe a placa incubar por duas horas em temperatura ambiente para completar o bloco. Mais tarde, esvazie os poços e lave o prato como antes.

Agora, carregue os poços com 100 microlitros das várias diluições do ligante recombinante his-tag. Carregue cada concentração em duplicata. Carregue os poços em branco apenas com PBS.

Em seguida, incube a placa por duas horas em temperatura ambiente. Após a incubação com os ligantes, lave a placa três vezes com solução de lavagem. Em seguida, pipetar alíquotas de 100 microlitros de anticorpo monoclonal primário de ratinho anti-HIS em cada poço e incubar a placa à temperatura ambiente durante duas horas.

Depois de lavar o anticorpo, a cada poço, adicione 100 microlitros de solução de anticorpo secundário IGG anti-camundongo de cabra acoplada a HRP. Enrole o prato com papel alumínio para evitar a luz. Em seguida, incube a placa por 45 minutos em temperatura ambiente.

Use a técnica de lavagem padrão para remover o anticorpo secundário. Agora, a cada poço, adicione 100 microlitros de TMB recém-preparado feito de quantidades iguais de soluções de substrato estoque A e B. Em seguida, mantenha a placa em temperatura ambiente por 15 a 30 minutos. Então, após o desenvolvimento de cor suficiente, adicione 50 microlitros de solução estoque a cada poço.

O protocolo é baseado na suposição de que o sinal da mensagem é gerado a partir de uma associação específica. Pode ser necessário estimar a contribuição da ligação não específica para o sinal. Em seguida, leia os valores de absorbância da placa em 450 nanômetros e prossiga com o cálculo do valor KD.

O procedimento de fiscalização territorial territorial da concorrência segue as mesmas etapas que o procedimento de fiscalização territorial territorial direta Depois de lavar o excesso de ligantes de revestimento da placa, bloqueie os poços da placa. Adicione 200 microlitros de solução de 5% BSA a cada poço e incube a placa por duas horas em temperatura ambiente.

Durante a incubação, preparar os ligantes recombinantes his-tag a uma concentração fixa de 10 nanogramas por mililitro em PBS. Em seguida, prepare o peptídeo bloqueador em diferentes concentrações em PBS, variando de 10 nanomolares a 100 micromolares para garantir uma curva dose-resposta. Assim, o valor IC50 para o peptídeo bloqueador pode ser encontrado.

Nos poços de controle, carregue a concentração fixa do ligante sem peptídeo para derivar a ligação máxima. Nos poços em branco, adicione apenas PBS sem ligante ou peptídeo. Nos demais poços, adicionar 50 microlitros dos ligantes e 50 microlitros de cada concentração de peptídeo.

Em seguida, incube a placa por duas horas em temperatura ambiente e proceda normalmente. As constantes de dissociação entre três peptídeos ligantes de interferon diferentes e a subunidade alfa do receptor IL28R-a foram determinadas usando o LRA direto, a fração de locais de ligação ocupados é plotada em relação ao logaritmo da respectiva concentração de interferon. Esses resultados ilustram uma curva de ligação que pode ser analisada para estimar o valor de KD, ajustando os dados à equação de Hill.

Um gráfico de Scatchard ilustra a cooperatividade na ligação do ligante, em última análise, o ligante 1 do interferon tem a maior afinidade de ligação, seguido pelo ligante 2 do interferon e pelo ligante 3 do interferon. O valor do coeficiente de Hill de mais de 1 sugere maior afinidade por ligantes adicionais após a interação inicial do receptor do ligante. Em seguida, o LRA competitivo foi usado para quantificar o impacto de um peptídeo bloqueador na interação entre os peptídeos ligantes de interferon e a subunidade receptora.

A fração de locais de ligação ocupados para um peptídeo ligante de interferon a 10 nanogramas por mililitro é plotada em relação ao log da concentração do peptídeo de interferon. A partir desses dados, foram estimados os valores de IC50. De acordo com os valores calculados, o peptídeo bloqueador inibiu a interação entre o ligante de interferon 3 e IL28R-a em maior extensão.

Uma vez dominada, esta técnica, pode ser feita em oito horas. Se for executado corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que cada concentração de saturação da ligação do receptor do ligante, seguindo este procedimento, os outros métodos podem ser realizados para obter valores de KD mais detalhados.

Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo das interações ligante-receptor explorarem substâncias inibitórias para bloquear essas interações.