Um ELISA baseada Encadernação e Método de competição de determinar rapidamente interacções ligando-receptor

Os objetivos deste método baseado em ELISA são, primeiro, determinar a afinidade de ligação de uma citocina ao seu receptor e, segundo, medir os efeitos de bloqueio dos peptídeos inibitórios da interação ligante-receptor. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo das interações proteína-proteína, como a ligação citocina-receptor. As afinidades de ligação e o bloqueio destes podem aumentar a compreensão geral da dinâmica da interação.

A principal vantagem desta técnica é que é fácil de realizar, gera receptores marcados e é relativamente barata, devido ao fácil acesso a equipamentos disponíveis como o leitor de ELISA. Embora este método possa fornecer insights sobre a interação ligante-receptor, também pode ser aplicado a outros sistemas, como interações proteína-proteína gerais e ao design de compostos de bloqueio para inibir interações específicas. Prepare as soluções conforme descrito no protocolo do texto.

Certifique-se de filtrar o tampão de revestimento de carbonato com uma membrana PES de 0,22 mícrons. Use um vácuo. Além disso, faça 10 concentrações diferentes de cada ligante ou peptídeo.

Há dois ensaios descritos neste vídeo, o primeiro é a interação direta entre ligante e receptor, ELISA. Pode ser usado para medir a constante de dissociação receptor-ligante, que representa a afinidade de ligação receptor-ligante. O segundo ensaio é uma interação ligante-receptor de competição ELISA recentemente otimizada.

Isso permite a triagem de peptídeos e outros compostos de bloqueio, que agem para interferir com a interação receptor-ligante. Para eficiência, prepare-se para usar pipetas multicanais para placas de 96 poços e, ao decantar, apenas jogue fora seu conteúdo. Comece este procedimento revestindo a placa com um receptor recombinante.

Primeiro, dilua o receptor em tampão de carbonato para 100 nanogramas por microlitro. Em seguida, carregue os poços da placa com 100 microlitros de solução do receptor. Exclua as paredes externas para evitar lidar com o artefato da borda da placa.

Cubra a placa e incube-a a 4 graus Celsius durante a noite. Realize todas as incubações da placa com oscilação suave. No dia seguinte, remova a solução de revestimento e lave a placa três vezes com a solução de lavagem, PBS com um toque de Tween 20.

Em seguida, bloqueie os locais de ligação do receptor livre adicionando 200 microlitros de 5%PSA. Deixe a placa incubar por duas horas à temperatura ambiente para completar o bloqueio. Mais tarde, esvazie os poços e lave a placa como antes.

Agora, carregue os poços com 100 microlitros das várias diluições do ligante recombinante his-tag. Carregue cada concentração em duplicata. Carregue os poços em branco com PBS sozinho.

Em seguida, incube a placa por duas horas à temperatura ambiente. Após a incubação com os ligantes, lave a placa três vezes com solução de lavagem. Então, pipete 100 microlitros de alíquotas do anticorpo monoclonal anti-his mouse primário em cada poço e incube a placa à temperatura ambiente por duas horas.

Após lavar o anticorpo, em cada poço, adicione 100 microlitros de solução de anticorpo secundário HRP acoplado anti-mouse IGG. Envolva a placa com papel alumínio para evitar a luz. Em seguida, incube a placa por 45 minutos à temperatura ambiente.

Use a técnica de lavagem padrão para remover o anticorpo secundário. Agora, para cada poço, adicione 100 microlitros de TMB recém-preparado feito de quantidades iguais de soluções de substrato estoque A e B. Então, mantenha a placa à temperatura ambiente por 15 a 30 minutos. Então, após desenvolvimento suficiente de cor, adicione 50 microlitros de solução estoque a cada poço.

O protocolo é baseado na suposição de que o sinal mensageiro se eleva a partir da ligação específica. Pode ser necessário estimar a contribuição da ligação não específica para o sinal. Em seguida, leia os valores de absorbância da placa a 450 nanômetros e prossiga com o cálculo do valor KD.

O procedimento LRA de competição segue os mesmos passos do procedimento LRA direto, exceto por algumas mudanças importantes. Após lavar os ligantes de revestimento em excesso da placa, bloqueie os poços da placa. Adicione 200 microlitros de solução de 5%BSA a cada poço e incube a placa por duas horas à temperatura ambiente.

Durante a incubação, prepare os ligantes recombinantes his-tag a uma concentração fixa de 10 nanogramas por mililitro em PBS. Em seguida, prepare o peptídeo de bloqueio em diferentes concentrações em PBS, variando de 10 nanomolar a 100 micromolar para garantir uma curva dose-resposta. Assim, o valor IC50 para o peptídeo de bloqueio pode ser encontrado.

Nos poços de controle, carregue a concentração fixa de ligante sem peptídeo para derivar a ligação máxima. Nos poços em branco, adicione apenas PBS sem ligante ou peptídeo. Nos outros poços, adicione 50 microlitros dos ligantes e 50 microlitros de cada concentração de peptídeo.

Em seguida, incube a placa por duas horas à temperatura ambiente e proceda como de costume. As constantes de dissociação entre três diferentes peptídeos de ligante interferon e o subunidade receptora alfa IL28R-a foram determinadas usando o LRA direto, a fração de locais de ligação ocupados é plotada contra o logaritmo da respectiva concentração de interferon. Estes resultados ilustram uma curva de ligação que pode ser analisada para estimar o valor KD ajustando os dados à equação de Hill.

Um gráfico de Scatchard ilustra a cooperatividade na ligação do ligante, em última análise, o ligante interferon 1 tem a maior afinidade de ligação, seguido pelo ligante interferon 2 e ligante interferon 3. O valor do coeficiente de Hill maior que 1 sugere maior afinidade por ligantes adicionais após a interação inicial ligante receptor. Em seguida, o LRA competitivo foi usado para quantificar o impacto de um peptídeo de bloqueio na interação entre os peptídeos de ligante interferon e a subunidade do receptor.

A fração de locais de ligação ocupados para um peptídeo de ligante interferon a 10 nanogramas por mililitro é plotada contra o log da concentração do peptídeo interferon. A partir desses dados, os valores IC50 foram estimados. De acordo com os valores calculados, o peptídeo de bloqueio inibiu a interação entre o ligante interferon 3 e IL28R-a na maior extensão.

Uma vez dominada, esta técnica pode ser feita em oito horas. Se for realizada adequadamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que cada concentração de saturação de ligação receptor de ligante, seguindo este procedimento, os outros métodos podem ser realizados para obter valores KD mais detalhados.

Após seu desenvolvimento, esta técnica abriu caminho para pesquisadores no campo das interações ligante-receptor explorarem substâncias inibitórias para bloquear essas interações.