Determinando os planos de ligação de gelo de proteínas anticongelantes pela afinidade do plano de gelo baseado em fluorescência

O objetivo geral do experimento a seguir é visualizar os planos de gelo ligados por proteínas anticongelantes marcadas com fluorescência. Isso é conseguido através do crescimento de cristais de gelo únicos aos quais as proteínas anticongelantes podem se ligar como uma segunda etapa. Cada cristal é visto através de polarizadores cruzados para estabelecer sua singularidade e orientação.

Em seguida, um cristal de gelo é montado em um dedo frio com temperatura controlada e formado em um hemisfério. Em seguida, é submerso em uma solução de proteínas anticongelantes marcadas com fluorescência para absorver a proteína anticongelante em planos de ligação específicos do hemisférico em crescimento. Os resultados do gelo são obtidos visualizando e visualizando imagens de gelo ligado por proteína anticongelante marcada com fluorescência, usando luz específica de comprimento de onda e filtros em uma câmara fria escura.

A principal vantagem desta técnica sobre os métodos existentes, como a gravação em gelo, é que as proteínas anticongelantes são marcadas com fluorescência Para permitir a visualização imediata dos planos de gelo ligados às proteínas, comece a cultivar cristais preparando um banho de etilenoglicol com temperatura controlada a menos 0,5 graus Celsius e encontrando uma panela de metal limpa que se encaixe e possa flutuar nela. Os cristais são formados em moldes. Use moldes cilíndricos de três a quatro centímetros de altura cortados de um tubo de cloreto de polivinila.

Cada molde deve ter um entalhe de um milímetro de largura e dois milímetros de altura de um lado. Aplique uma leve película de graxa a vácuo na lateral do anel de onde o entalhe foi cortado. Sele esta superfície entalhada untada na panela de metal com o entalhe orientado para longe do centro da panela.

Certifique-se de não encher ou obstruir os entalhes com graxa. Prepare quantos moldes puderem caber na panela. Em seguida, adicione Degas filtrado e água deionizada no centro da panela fora dos moldes.

Tenha cuidado para não introduzir bolhas. À medida que a camada de água é elevada para cinco milímetros, a água deve entrar lentamente nos moldes através dos entalhes. Quando terminar, coloque a panela perfeitamente nivelada no banho de etilenoglicol.

Depois que a panela e a água atingirem menos 0,5 graus Celsius, adicione um pequeno pedaço de gelo no meio da panela fora dos moldes. Incube durante a noite para formar uma camada de gelo nos próximos três dias. Volte ao banho para adicionar água aos moldes.

Deposite 13 mililitros de quatro graus Celsius, Degas e água deionizada em cada molde. Uma vez por dia após adicionar a água, reduza a temperatura do banho de etilenoglicol. No quarto dia, os moldes devem estar completamente preenchidos com gelo.

Recupere os moldes e prepare uma superfície limpa para o gelo. Puxe cada molde da assadeira e empurre o cristal de gelo para fora. Coloque a superfície limpa com os moldes em um freezer de 20 graus Celsius negativos por uma hora.

Antes do manuseio. Quando o gelo estiver pronto, leve-o a uma câmara frigorífica ou fria para determinar se é um único cristal. Coloque o gelo entre dois polarizadores cruzados.

Se o gelo for um único cristal, nenhuma rachadura ou descontinuidade deve ser vista e a direção da luz não deve mudar dentro do cristal. Com o polarizador ainda no lugar, determine a orientação do eixo C observando a luz transmitida quando o gelo é girado. Para determinar a orientação dos AEs A, enrole o gelo firmemente em papel alumínio.

Oriente uma agulha normal ao eixo do mar e faça um pequeno orifício na folha e no gelo. Em seguida, coloque o gelo em um vácuo de 0,5 milibar por 20 minutos. Assim que o cristal for recuperado, descubra-o na câmara fria.

Observe a gravação hexagonal no plano basal. Os AEs A percorrem os vértices da estrela de seis pontas. Este cristal será cortado ao meio ao longo de uma linha paralela a pontos opostos na estrela.

Para expor um plano de prisma primário, segure o cristal firmemente em uma bancada. Use uma serra para cortar o cristal ao meio. Colete as peças para montagem em um dedo frio.

O cristal de gelo deve ser preparado para montagem em um dedo frio, encontre duas hastes de alumínio com diâmetros ligeiramente diferentes, mas comparáveis em tamanho ao dedo frio. Alterne o uso das hastes para derreter uma cavidade no topo do batente de cristal quando houver uma cavidade na qual o dedo frio possa caber. Resfrie o dedo frio a menos 0,5 graus Celsius e coloque-o na cavidade de gelo.

Segure o cristal no lugar até que ele congele no metal. Em seguida, encha um copo hemisférico com aproximadamente o dobro do diâmetro do cristal de gelo com água deionizada filtrada resfriada a quatro graus Celsius. Submergido o cristal de gelo frio no copo, remova o excesso de água para que a parte superior do cristal de gelo fique aproximadamente nivelada com o líquido e o gelo não se toque.

As paredes do copo cobrem o copo com isolamento e reduzem a temperatura para menos cinco graus Celsius. Deixe o gelo formar um hemisfério por cerca de uma hora. Prepare-se para adicionar a proteína fluorescente.

Quando o hemisfério estiver pronto. Remova o cristal de gelo do copo, remova a água do copo. Em seguida, adicione 25 a 30 mililitros de solução de proteína marcada com fluorescência pré-resfriada na concentração desejada.

Mantendo o volume total de líquido inalterado, mergulhe o cristal de gelo no copo. Outra vez. Certifique-se de que a parte superior do cristal esteja nivelada com o líquido e não toque nas paredes do copo. Abaixe a temperatura fria do dedo para menos oito graus Celsius e deixe a solução de proteína congelar no cristal por duas a três horas.

Pare o crescimento do gelo quando pelo menos cinco milímetros de gelo se formarem a partir da solução proteica. Com o dedo frio ainda preso, remova o cristal de gelo do copo. Retire o dedo frio aquecendo o líquido de arrefecimento a um pouco acima de zero grau Celsius.

Espere até que o cristal de gelo derreta. Quando o cristal derreter do dedo frio, coloque-o com o lado plano voltado para baixo sobre uma superfície limpa. Tenha cuidado para não tocar no gelo recém-formado.

Armazene o cristal a menos 20 graus Celsius por pelo menos 20 minutos Antes de prosseguir para visualizar o trabalho de fluorescência em uma câmara fria que pode ser escurecida. Prepare lâmpadas com filtros de excitação específicos de comprimento de onda para excitar a etiqueta fluorescente e os filtros de emissão da câmera. Para bloquear a luz não específica, coloque o gelo com o lado plano voltado para baixo sob as lâmpadas, escureça a sala e observe os padrões no gelo iluminado.

Para estimar os planos de gelo que estão ligados pelas proteínas anticongelantes, compare uma imagem tradicional de gravação de gelo com a do plano de gelo baseado em fluorescência correspondente A análise de afinidade usando trixy mostra proteínas anticongelantes tipo um produzidas pelo linguado de inverno pseudo pectus Americana. A técnica pode ser usada para comparar simultaneamente os padrões de ligação ao gelo de diferentes proteínas anticongelantes. Nesse caso, a Pacific Blue marcou o tipo três com NFEA FP oito e a trixy marcou com a proteína anticongelante tipo um.

Este é o resultado da visualização apenas do tipo três, N-F-E-A-F-P, oito, aqui apenas a proteína anticongelante tipo um é visualizada nesta imagem. Os dois são visualizados juntos. Observe que o eixo C é o mesmo para cada imagem.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como cultivar e orientar cristais de gelo únicos e usar a análise de afinidade de planície de gelo baseada em fluorescência para avaliar os padrões de ligação de planícies de gelo de proteínas anticongelantes marcadas com fluorescência