Mass Spectrometric Abordagens para estudar a estrutura das proteínas e interacções em liofilizados Pós

O objetivo geral deste procedimento é monitorar a estrutura de uma proteína em alta resolução usando troca de hidrogênio deutério e marcação lítica de cadeia lateral acoplada à espectrometria de massa. Isso é feito primeiro liofilizado, a proteína na presença de diferentes excipientes. Na troca de hidrogênio deutério no estado sólido, a proteína liofilizada é exposta ao vapor de óxido de deutério em um dessecador selado sob umidade relativa e temperatura controladas.

Para a marcação lítica, a proteína é liofilizada com excipientes e um agente fotorreativo. O frasco é então irradiado com a luz UV para ligar covalentemente o agente à proteína. Para cada método, as amostras são reconstituídas e analisadas usando um espectrômetro de massa com resolução de nível de proteína intacta e peptídeo.

Esses dois métodos fornecem informações complementares. As formulações nas quais a estrutura da proteína é altamente retida apresentam diminuição da captação de deutério e aumento da marcação lítica, enquanto aquelas com estrutura perturbada apresentam aumento da captação de deutério e diminuição da marcação lítica. A marcação química, como troca de deutério de hidrogênio e reticulação de fotos, juntamente com a análise espectrométrica de massa, foi recentemente adaptada para estudar a estrutura e as interações de proteínas em suportes vivos.

A principal vantagem dessas técnicas sobre os métodos existentes, como a espectroscopia CD e FDIR, é que a estrutura e o ambiente da proteína podem ser sondados com alta resolução no estado sólido. Para começar, coloque 200 mililitros de óxido de deutério no compartimento inferior de um dessecador e adicione 400 gramas de carbonato de potássio Para fazer uma solução saturada, coloque a placa de dessecação de porcelana dentro e feche o dessecador hermeticamente. Deixe-o equilibrar a cinco graus Celsius para atingir uma umidade relativa estável próxima a 43%Em seguida, coloque os frascos sem tampa contendo proteína liofilizada no compartimento superior do dessecado, sele o dessecador e incube a cinco graus Celsius.

Para iniciar a reação de troca de deutério de hidrogênio para coletar uma amostra, tampe o frasco imediatamente após removê-lo do dessecador e, em seguida, resfrie a reação congelando rapidamente o frasco e o nitrogênio líquido. Conservar o frasco para injetáveis a 80 graus Celsius negativos até à análise por espectrometria de massa. Use espectrometria de massa de alta resolução para analisar as amostras para minimizar a troca reversa.

Como é o sistema de cromatografia líquida dentro de uma caixa refrigerada? Para configurar o instrumento primeiro, conecte o sample loop e o coletor de proteínas à válvula que controla os processos de dessalinização e eluição. Em seguida, calibre o sistema injetando a mistura de ajuste de baixa concentração no espectrômetro de massa e definindo a faixa de relação massa/carga de 200 a 3.200.

Em seguida, resfrie o sistema refrigerado a uma temperatura operacional estável de cerca de zero graus Celsius. Prepare o tampão de têmpera contendo 0,2% de ácido fórmico e 5% de metanol em água e resfrie-o no gelo. Depois de transferir as amostras para nitrogênio líquido, remova cuidadosamente um frasco e reconstitua a amostra com a adição de dois mililitros de tampão de têmpera.

Em seguida, carregar um método adequado de HPLC e de espectrometria de massa. Para analisar a amostra aqui, dessalinize 20 picomoles de mioglobina na armadilha de proteínas por 1,7 minutos com 5% de acetil nitrilo e 0,1% de ácido fórmico. Em seguida, elua a proteína em um gradiente de 3,3 minutos, aumentando para 80% de aceto nitrilo e 0,1% de ácido fórmico.

Injetar a amostra e recolher os espectros de massa numa gama de 200 a 3 200 massas/cargas. Para determinar a massa da proteína intacta como referência, use o mesmo método com uma amostra de proteína classificada indevidamente. Obtenha a massa da proteína desconvoluindo os espectros brutos usando o software de análise de dados Para análise de amostra de mioglobina, defina a faixa de massa de 15 a 18, kilodaltons a resolução de massa para um Dalton e o pico de pipa para 90%Para análise de peptídeos, prepare as amostras usando o mesmo protocolo das proteínas intactas.

Quando as amostras estiverem prontas para serem analisadas, conecte uma coluna de pepina imobilizada e uma coluna analítica à válvula e substitua a armadilha de proteína por uma armadilha de peptídeos. Calibrar o sistema para peptídeos foi executado para proteínas intactas, mas definindo a faixa de proporção de massa para carga de 100 a 1700 e, em seguida, resfrie o sistema refrigerado a uma temperatura operacional estável de cerca de zero grau. Uma vez calibrado o sistema, programe o método de HPLC e de espectrometria de massa adequados.

Aqui, digerir 20 picomoles de mioglobina na coluna de Pepina com 0,1% de ácido fórmico em água, programar o método para prender e dessalinizar os peptídeos na armadilha de peptídeos por 1,7 minutos com 10% de acetil nitrilo e 0,1% de ácido fórmico, e para eluir os peptídeos em quatro minutos com um gradiente aumentando para 60% de acetil nitrilo e 0,1% de ácido fórmico. Em seguida, injete a amostra e colete os espectros de massa em uma faixa de relação massa/carga de 100 a 1700. Analise uma amostra de peptídeo não datada com espectrometria de massa em tandem para identificar os fragmentos pépticos.

Em seguida, verifique o fragmento determinado experimentalmente com as massas previstas geradas por software. Em seguida, defina o corte de massa para 10 partes por milhão para eliminar massas com alto erro para peptídeos com correspondências. Observe o estado de carga da sequência de peptídeos e o tempo de retenção.

Use os dados peptídicos compilados para calcular o número médio de deuteros incorporados por fragmento péptico Usando o software de análise de dados Primeiro, liofilize a proteína com o excipiente e a lucina, conforme indicado no protocolo de texto. Depois de preparar as amostras, ligue um reticulador UV contendo lâmpadas UV de 365 nanômetros. Deixe as lâmpadas aquecerem por cinco minutos.

Depois que as lâmpadas estiverem aquecidas, desligue-as e coloque os frascos sem tampa contendo a formulação dentro da câmara de reticulação. Irradiar as amostras com luz UV durante 40 minutos e incluir amostras sem fotoleucina como controlo Após a irradiação, tampar e armazenar os frascos a 20 graus Celsius negativos até à análise espectrométrica de massa. Preparar as amostras para análise adicionando água destilada de grau de espectrometria de massa para obter uma concentração final de proteína de dois micromolares.

Em seguida, analise as amostras usando o mesmo método de espectrometria de massa das proteínas deuteradas intactas. Mas não use o sistema lc refrigerado. Adquira dados de espectrometria de massa para uma amostra de proteína não marcada para determinar a massa nativa da proteína.

Realize a análise de dados como para as amostras DERATED para análise do nível de peptídeos. Primeiro, execute a marcação fotolítica de estado sólido com proteínas intactas e armazene-as a 20 graus Celsius negativos. Em seguida, reconstitua a amostra com tampão de bicarbonato de amônio de 100 milimolares para obter uma concentração final de proteína de 10 micromolar.

Misture a amostra com tripsina em uma proporção de 10 para um molar de proteína para tripsina e incube essa mistura a 60 graus Celsius por 16 horas. Enquanto isso, conecte o loop de amostra, o coletor de peptídeos e a coluna analítica à válvula do sistema HPLC. Depois de digerir a proteína, extinguir a reação adicionando 0,1% de ácido fórmico em água para obter uma concentração final de proteína de dois micromolares.

Em seguida, programe o sistema com os métodos de HPLC e espectrometria de massa. Aqui, injete e dessalinize 20 picomoles da mioglobina digerida na armadilha de peptídeos por 1,5 minutos com 5% de aceto nitrilo e 0,1% de ácido fórmico, elua os peptídeos aumentando o gradiente em 22 minutos para 55% de acetil nitrilo e colete os espectros de massa em uma faixa de 100 a 1700 massa para taxa de carga. Use a ferramenta online para calcular a massa teórica do peptídeo.

Aduto de fotoleucina com os números de fotoleucina previamente obtidos a partir da análise de proteínas intactas. Inclua pelo menos quatro clivagens perdidas. Crie uma lista de massa no Excel para aduto de peptídeo de fotoleucina.

Em seguida, combine a lista de massa teórica com massas observadas experimentalmente, definindo um ponto de corte para identificar massas com baixo erro. Durante a troca de deutério de hidrogênio, o desdobramento da proteína permite a substituição de hidrogênio por proteínas de deutério que retêm sua estrutura são menos propensas à troca de deutério. Quando a espectrometria de massas de troca de deutério de hidrogênio no estado sólido foi realizada em formulações contendo talose e contendo sorbitol contendo mioglobina, a formulação contendo sorbitol mostrou 46% maior captação de deutério, sugerindo que a estrutura da mioglobina no sorbitol é mais perturbada durante o processo lítico.

A fotoleucina se liga a cadeias laterais de aminoácidos acessíveis. A análise por espectrometria de massa fotolítica em estado sólido das formulações de sorbitol e TLOs contendo mioglobina mostrou mais absorção de fotoeína na formulação de TLOs do que em sua contraparte. Isso sugere que as cadeias laterais permaneceram acessíveis na formulação de TLOs.

Tanto a troca de deutério de hidrogênio quanto a marcação lítica usam regiões comercialmente disponíveis e instrumentação de MS prontamente disponível para caracterizar proteínas no estado sólido para qualquer formulação. O registro de tempo total desde a preparação da amostra até a análise completa dos dados é inferior a duas semanas. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como obter informações de alta resolução sobre a estrutura da proteína e sua importância no projeto de formulações de proteínas liofilizadas estáveis.