Seleção de Aptamer de DNA de ligação éster de ácido ftálico, caracterização e aplicação de um Aptasensor eletroquímica

O objetivo geral deste procedimento é selecionar aptâmeros de DNA específicos do grupo para moléculas pequenas altamente hidrofóbicas e usar o aptâmero selecionado para desenvolver um biossensor eletroquímico sensível. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo de seleção de aptâmeros, sobre como selecionar e caracterizar aptâmeros específicos de grupos quando os alvos são moléculas altamente hidrofóbicas. Enquanto a parte mais útil deste método é o desenvolvimento de biossensores eletroquímicos, para a detecção de títulos.

Esses biossensores também devem funcionar para nossas medições de afinidade de aptâmeros. Para iniciar a reação, adicione 100 microlitros de água livre de RNase ao produto purificado de aptâmero PCR. Vortex a mistura até que o precipitado se dissolva.

A reação de exonuclease lambda é sensível à concentração de sal e é um produto que deve ser proliferado por precipitação de etanol, mas outro isopropanol. Coloque em cada um dos cinco tubos de microcentrífuga, cinco microlitros da solução de aptâmero, 11 microlitros de água livre de Rnase e dois microlitros de tampão de reação 10x. Adicione dois microlitros de água livre de Rnase e soluções de duas, cinco, oito e 10 unidades de exonuclease lambda em água livre de Rnase a um tubo cada.

Misture bem com pipetagem suave. Incube os tubos a 37 graus Celsius por 35 minutos e a 80 graus Celsius por 15 minutos. Em seguida, segure os tubos a quatro graus Celsius e prepare um gel de página nativa a 12%.

Adicione a cada tubo um microlitro de corante de carga e quatro microlitros de água livre de Rnase. Execute as misturas no gel de página nativa a 150 volts por 45 minutos. Identifique a menor quantidade de exonuclease lambda necessária para gerar completamente o DNA de fita simples.

Execute uma reação em grande escala para gerar DNA de fita simples. Para cada alvo de ligação a ser testado, incube 10 microlitros de esferas magnéticas codificadas por DBP funcionalizadas médias com 500 microlitros de uma solução micromolar de DBP-1 por uma hora em temperatura ambiente durante a rotação. Em seguida, descarte o sobrenadante.

Lave os grânulos quatro vezes com porções de 200 microlitros de tampão de ligação PAE e ressuspenda os grânulos em 10 microlitros de tampão de ligação PAE. Obtenha 10 dispersões de teste de alvo de ligação micromolar no tampão de ligação PAE. É ótimo ir para a dispersão dos alvos hidrofóbicos no tampão de ligação PAE.

Para garantir que haja enriquecimento da biblioteca, foram selecionados em testes de afinidade. Adicione 10 microlitros de grânulos codificados DBP-1 a 110 microlitros de cada solução de teste alvo. Incubar as misturas durante uma hora e recolher os sobrenadantes por separação magnética.

Dilua os sobrenadantes 100 vezes e use três microlitros para cada PCR quantitativo. Calcule as afinidades relativas dividindo o número de DBP-1 liberado na presença da amostra de teste pelo número de DBP-1 liberado apenas no buffer de ligação PAE. Antes de realizar as medições, sintetize e purifique a sonda de sequência de núcleo tiolada baseada em DBP-1 e a sonda de sinalização.

Reconstituir a sonda tiolada e a sonda de sinalização e como soluções micromolares de 100 em água livre de nuclease. Em seguida, polir um eletrodo de ouro de dois milímetros de diâmetro em uma superfície espelhada com um pó de alumina de 0,3 e 0,5 mícron e um pano de microfibra por cinco minutos cada. Sonicar o eletrodo em água ultrapura por cinco minutos após cada polimento.

Mergulhe o eletrodo polido em uma solução molar de 0.5 de ácido sulfúrico. Limpe o eletrodo com 35 varreduras sucessivas de voltametria cíclica de menos 0,4 a 1,2 volts positivos versus calomelano de mercúrio a 100 milivolts por segundo. Em seguida, prepare em um tubo de centrífuga de parede fina uma mistura de sonda tiolada 0,5 micromolar DBP-1.

E 0,5 micromolar FC modificou DBP-1 em 100 microlitros de PBS. Aqueça a mistura em banho-maria regulado para 95 graus Celsius por 10 minutos. Em seguida, deixe a mistura esfriar até a temperatura ambiente no banho-maria.

Adicionar um microlitro de uma solução-mãe de TCEP a 10 milimolares à mistura arrefecida e manter à temperatura ambiente durante uma hora. Em seguida, mergulhe o eletrodo de ouro limpo na mistura por 12 horas em temperatura ambiente. Enxágue o eletrodo com PBS e, em seguida, mergulhe o eletrodo em uma solução milimolar de PEG tiolado em PBS por uma hora.

Enxágue bem o eletrodo com tampão de ligação PAE livre alvo e mergulhe o eletrodo no tampão. Em seguida, sonicar células eletrolíticas de contra-eletrodo de platina e um eletrodo de referência de calomelano saturado por dois minutos cada em água ultrapura e tampão de ligação PAE em sequência. Abra o software do instrumento de onda quadrada de voltametria e insira os parâmetros do experimento.

Encha uma célula eletrolítica limpa com tampão de ligação PAE livre alvo. Conecte os três eletrodos limpos a um potenciostato e mergulhe os eletrodos no tampão. Adquira uma varredura SWV em segundo plano.

Em seguida, mergulhe o eletrodo de trabalho de ouro em uma solução de DEHP 10 picamolar em tampão de ligação PAE por 30 minutos em temperatura ambiente. Enxágue bem o eletrodo com tampão de ligação PAE. Mergulhe todos os três eletrodos em um novo tampão de ligação PAE e colete outra curva SWV usando os mesmos parâmetros de antes.

Repita este processo com concentrações crescentes de DEHP para obter uma curva de titulação. A quantidade mínima de exonuclease lambda necessária para obter apenas DNA de fita simples foi encontrada em duas unidades com base em reações de pequena escala. O candidato aptâmero DBP-1 foi identificado por SELEX seguido de sequenciamento de alto rendimento.

DBP-1 mostrou boa especificidade de grupo para congêneres de PAE. Um aptasensor eletroquímico usando DBP-1 respondeu seletivamente ao DEHP em relação a outros poluentes ambientais comuns. O aptasensor foi altamente sensível ao DEHP com a resposta em concentrações tão baixas quanto 10 picamolar.

Partícula laser onde seleção e caracterização de aptâmeros para pequenas moléculas hidrofóbicas de risco. A caracterização e volatilização de aptâmeros de pequenas moléculas hidrofóbicas como PAE é geralmente bastante desafiadora, devido à solubilidade em água extremamente limitada e ao baixo peso molecular dos PAEs. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como fazer um aptassensor eletroquímico e como usá-lo para detectar os títulos.