Name: Seleção de Aptamer de DNA de ligação éster de ácido ftálico, caracterização e aplicação de um Aptasensor eletroquímica (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-21T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 33 s
Description: Aprenda a selecionar aptâmeros de DNA para moléculas hidrofóbicas e desenvolver um aptassensor eletroquímico sensível. Este método utiliza SELEX e caracterização de afinidade para detectar ésteres de ácido ftálico.

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Estamos gratos pelo apoio financeiro da Fundação Nacional de ciências naturais (21675112), projeto chave do plano de ciência e tecnologia da Comissão de educação de Beijing (KZ201710028027) e programa Yanjing jovem estudioso da Capital Normal University.

<ol><li>Vorkamp, K., Riget, F. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+new+and+current-use+contaminants+in+the+Arctic+environment%3A+Evidence+of+long-range+transport+and+indications+of+bioaccumulation%5BTitle%5D)+AND+%22Chemosphere%22%5BJournal%5D)">A review of new and current-use contaminants in the Arctic environment: Evidence of long-range transport and indications of bioaccumulation.</a> Chemosphere. 111, 379-395 (2014).</li>
<li>Net, S., Sempere, R., Delmont, A., Paluselli, A., Ouddane, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Occurrence%2C+fate%2C+behavior+and+ecotoxicological+state+of+phthalates+in+different+environmental+matrices%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Sci+Technol%22%5BJournal%5D)">Occurrence, fate, behavior and ecotoxicological state of phthalates in different environmental matrices.</a> Environ Sci Technol. 49 (7), 4019-4035 (2015).</li>
<li>Xie, Q. L., Liu, S. H., Fan, Y. Y., Sun, J. Z., Zhang, X. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+phthalate+esters+in+edible+oils+by+use+of+QuEChERS+coupled+with+ionic-liquid-based+dispersive+liquid-liquid+microextraction+before+high-performance+liquid+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+BioanalChem%22%5BJournal%5D)">Determination of phthalate esters in edible oils by use of QuEChERS coupled with ionic-liquid-based dispersive liquid-liquid microextraction before high-performance liquid chromatography.</a> Anal BioanalChem. 406 (18), 4563-4569 (2014).</li>
<li>Ierapetritis, I., Lioupis, A., Lampi, E. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s12161-013-9770-x">Determination of phthalates into vegetable oils by isotopic dilution gas chromatography mass spectrometry.</a> Food Anal Methods. 7 (7), 1451-1457 (2014).</li>
<li>Sun, J. Z., He, H., Liu, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+phthalic+acid+esters+in+Chinese+white+spirit+using+dispersive+liquid-liquid+microextraction+coupled+with+sweeping+beta-cyclodextrin-modified+micellar+electrokinetic+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22J+Sep+Sci%22%5BJournal%5D)">Determination of phthalic acid esters in Chinese white spirit using dispersive liquid-liquid microextraction coupled with sweeping beta-cyclodextrin-modified micellar electrokinetic chromatography.</a> J Sep Sci. 37 (13), 1679-1686 (2014).</li>
<li>Yilmaz, P. K., Ertas, A., Kolak, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+determination+of+seven+phthalic+acid+esters+in+beverages+using+ultrasound+and+vortex-assisted+dispersive+liquid-liquid+microextraction+followed+by+high-performance+liquid+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22J+Sep+Sci%22%5BJournal%5D)">Simultaneous determination of seven phthalic acid esters in beverages using ultrasound and vortex-assisted dispersive liquid-liquid microextraction followed by high-performance liquid chromatography.</a> J Sep Sci. 37 (16), 2111-2117 (2014).</li>
<li>Sun, R., Zhuang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ultrasensitive+gold+nanoparticles+improved+real-time+immuno-PCR+assay+for+detecting+diethyl+phthalate+in+foodstuff+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">An ultrasensitive gold nanoparticles improved real-time immuno-PCR assay for detecting diethyl phthalate in foodstuff samples.</a> Anal Biochem. 480, 49-57 (2015).</li>
<li>Sun, R. Y., Zhuang, H. S. <a target="_blank" href="http://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2014/ay/c4ay02088j">A sensitive heterogeneous biotin-streptavidin enzyme-linked immunosorbent assay for the determination of di-(2-ethylhexyl)phthalate (DEHP) in beverages using a specific polyclonal antibody.</a> Anal Methods. 6 (24), 9807-9815 (2014).</li>
<li>Zhou, L., Lei, Y., Zhang, D., Ahmed, S., Chen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ultra-sensitive+monoclonal+antibody-based+enzyme-linked+immunosobent+assay+for+dibutyl+phthalate+in+human+urinary%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Total+Environ%22%5BJournal%5D)">An ultra-sensitive monoclonal antibody-based enzyme-linked immunosobent assay for dibutyl phthalate in human urinary.</a> Sci Total Environ. 541, 570-578 (2016).</li>
<li>Shen, J., Li, Y., Gu, H., Xia, F., Zuo, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+development+of+sandwich+assay+based+on+the+nanobiotechnologies+for+proteins%2C+nucleic+Acids%2C+small+Molecules%2C+and+ions%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Rev%22%5BJournal%5D)">Recent development of sandwich assay based on the nanobiotechnologies for proteins, nucleic Acids, small Molecules, and ions.</a> Chem Rev. 114 (15), 7631-7677 (2014).</li>
<li>Yin, X. -B. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0165993612000040">Functional nucleic acids for electrochemical and electrochemiluminescent sensing applications.</a> TrAC, Trends Anal Chem. 33, 81-94 (2012).</li>
<li>Nguyen, V. -T., Kwon, Y. S., Gu, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aptamer-based+environmental+biosensors+for+small+molecule+contaminants%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Aptamer-based environmental biosensors for small molecule contaminants.</a> Curr Opin Biotechnol. 45, 15-23 (2017).</li>
<li>Groher, F., Suess, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+selection+of+antibiotic-binding+aptamers%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">In vitro selection of antibiotic-binding aptamers.</a> Methods. 106, 42-50 (2016).</li>
<li>Yang, K. -A., Pei, R., Stojanovic, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+selection+and+amplification+protocols+for+isolation+of+aptameric+sensors+for+small+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">In vitro selection and amplification protocols for isolation of aptameric sensors for small molecules.</a> Methods. 106, 58-65 (2016).</li>
<li>Jing, M., Bowser, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+measuring+aptamer-protein+equilibria%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chim.+Acta%22%5BJournal%5D)">Methods for measuring aptamer-protein equilibria: a review.</a> Anal. Chim. Acta. 686 (1-2), 9-18 (2011).</li>
<li>Mehta, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+and+characterization+of+PCB-binding+DNA+aptamers%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Selection and characterization of PCB-binding DNA aptamers.</a> Anal Chem. 84 (3), 1669-1676 (2012).</li>
<li>Matsumoto, M., Hirata-Koizumi, M., Ema, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+adverse+effects+of+phthalic+acid+esters+on+human+health%3A+A+review+of+recent+studies+on+reproduction%5BTitle%5D)+AND+%22Regul+Toxicol+Pharm%22%5BJournal%5D)">Potential adverse effects of phthalic acid esters on human health: A review of recent studies on reproduction.</a> Regul Toxicol Pharm. 50 (1), 37-49 (2008).</li>
<li>Goodchild, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conjugates+of+oligonucleotides+and+modified+oligonucleotides%3A+a+review+of+their+synthesis+and+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjug+Chem%22%5BJournal%5D)">Conjugates of oligonucleotides and modified oligonucleotides: a review of their synthesis and properties.</a> Bioconjug Chem. 1 (3), 165-187 (1990).</li>
<li>Brown, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+brief+history+of+oligonucleotide+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Protocols+for+Oligonucleotides+and+Analogs%3A+Synthesis+and+Properties%22%5BJournal%5D)">A brief history of oligonucleotide synthesis.</a> Protocols for Oligonucleotides and Analogs: Synthesis and Properties. , 1-17 (1993).</li>
<li>Reese, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligo-and+poly-nucleotides%3A+50+years+of+chemical+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Org+Biomol+Chem%22%5BJournal%5D)">Oligo-and poly-nucleotides: 50 years of chemical synthesis.</a> Org Biomol Chem. 3 (21), 3851-3868 (2005).</li>
<li>Sproat, B., Colonna, F., Mullah, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.tandfonline.com/doi/abs/10.1080/15257779508014668">An efficient method for the isolation and purification of oligoribonucleotides.</a> Nucleos Nucleot Nucl. 14 (1-2), 255-273 (1995).</li>
<li>Han, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+of+group-specific+phthalic+acid+esters+binding+DNA+aptamers+via+rationally+designed+target+immobilization+and+applications+for+ultrasensitive+and+highly+selective+detection+of+phthalic+acid+esters%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Selection of group-specific phthalic acid esters binding DNA aptamers via rationally designed target immobilization and applications for ultrasensitive and highly selective detection of phthalic acid esters.</a> Anal Chem. 89 (10), 5270-5277 (2017).</li>
<li>Bartlett, J. M. S., Stirling, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+short+history+of+the+polymerase+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22PCR+protocols%22%5BJournal%5D)">A short history of the polymerase chain reaction.</a> PCR protocols. , 3-6 (2003).</li>
<li>Saiki, R. K., Scharf, S., Faloona, F., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/2999980">Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia.</a> Science. 230, 1350-1354 (1985).</li>
<li>Albright, L. M., Slatko, B. E. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18428223">Denaturing polyacrylamide gel electrophoresis.</a> Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry. , A. 3B 1-A. 3B 5 (2001).</li>
<li>Summer, H., Grämer, R., Dröge, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Denaturing+urea+polyacrylamide+gel+electrophoresis+%28Urea+PAGE%29%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">Denaturing urea polyacrylamide gel electrophoresis (Urea PAGE).</a> JoVE. (32), e1485(2009).</li>
<li>Jing, M., Bowser, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+measuring+aptamer-protein+equilibria%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chim+Acta%22%5BJournal%5D)">Methods for measuring aptamer-protein equilibria: a review.</a> Anal Chim Acta. 686 (1), 9-18 (2011).</li>
<li>Sharma, T. K., Bruno, J. G., Dhiman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ABCs+of+DNA+aptamer+and+related+assay+development%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Adv%22%5BJournal%5D)">ABCs of DNA aptamer and related assay development.</a> Biotechnol Adv. 35 (2), 275-301 (2017).</li>
<li>Liu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S001346861530551X">Signaling-probe displacement electrochemical aptamer-based sensor (SD-EAB) for detection of nanomolar kanamycin A.</a> Electrochim Acta. 182, 516-523 (2015).</li>
<li>Mendonsa, S. D., Bowser, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+evolution+of+functional+DNA+using+capillary+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">In vitro evolution of functional DNA using capillary electrophoresis.</a> J Am Chem Soc. 126, 20-21 (2004).</li>
<li>Lou, X. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micromagnetic+selection+of+aptamers+in+microfluidic+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Micromagnetic selection of aptamers in microfluidic channels.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 106 (9), 2989-2994 (2009).</li>
<li>Cho, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+selection+of+DNA+aptamers+through+microfluidic+selection+and+high-throughput+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Quantitative selection of DNA aptamers through microfluidic selection and high-throughput sequencing.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 15373-15378 (2010).</li>
<li>Cho, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+selection+and+parallel+characterization+of+aptamers%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Nat+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Quantitative selection and parallel characterization of aptamers.</a> Proc Nat Acad Sci USA. 110 (46), 18460-18465 (2013).</li>
<li>Song, K. -M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gold+nanoparticle-based+colorimetric+detection+of+kanamycin+using+a+DNA+aptamer%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Gold nanoparticle-based colorimetric detection of kanamycin using a DNA aptamer.</a> Anal Biochem. 415 (2), 175-181 (2011).</li>
<li>Yang, Z., Ding, X., Guo, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0925400517313278">Second generation of signaling-probe displacement electrochemical aptasensor for detection of picomolar ampicillin and sulfadimethoxine.</a> Sens Actuators B. 253 (2017), 1129-1136 (2017).</li>
<li>Lou, X., Zhao, T., Liu, R., Ma, J., Xiao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembled+DNA+monolayer+buffered+dynamic+ranges+of+mercuric+electrochemical+sensor%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Self-assembled DNA monolayer buffered dynamic ranges of mercuric electrochemical sensor.</a> Anal Chem. 85 (15), 7574-7580 (2013).</li>
<li>Zhao, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoprobe-enhanced%2C+split+aptamer-based+electrochemical+sandwich+assay+for+ultrasensitive+detection+of+small+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Nanoprobe-enhanced, split aptamer-based electrochemical sandwich assay for ultrasensitive detection of small molecules.</a> Anal Chem. 87 (15), 7712-7719 (2015).</li>
<li>Lou, X., He, L. A. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0925400507006181">Surface passivation using oligo(ethylene glycol) in ATRP-assisted DNA detection.</a> Sens Actuators,B. 129 (1), 225-230 (2008).</li>
</ol>

Os autores não declaram nenhum interesse financeiro concorrente.

Um excelente benefício de aptamers é que são identificados por meio do método em vitro SELEX, enquanto os anticorpos são gerados através de immunoreactions na vivo . Portanto, aptamers pode ser selecionado com a especificidade do alvo desejado sob condições experimentais bem projetadas, Considerando que os anticorpos estão limitados às condições fisiológicas.
Para facilitar a separação de sequências de limite de sequências gratuito, vários SELEX modificados recentemente foram...

Juntamente com o rápido desenvolvimento econômico, a aceleração da industrialização e a construção urbana, poluição ambiental é mais grave do que nunca. Poluentes ambientais típicos incluem íons de metais pesados, toxinas, antibióticos, pesticidas, Disruptores endócrinos e poluentes orgânicos persistentes (POPs). Íons metálicos e toxinas, além de outros poluentes são pequenas moléculas que muito frequentemente consistem em uma variedade de congêneres. Por exemplo, os POPs mais tóxicos incluem bifenilos policlorados (PCBs), hidrocarbonetos aromáticos policíclicos (HAP), éteres de bifenil polibromados (PBDEs), polychlorinated dibenzo-p-dioxina (PCDD), Dibenzofurano policlorados (PCDF) e anidridos ftálico ésteres do ácido (PAEs)1,2, compostas de muitos congéneres. Principalmente a detecção de pequena molécula tem sido executada por técnicas baseadas em espectrometria de cromatografia de massa devido a sua diversidade de aplicações3,4,5,6. Para a detecção no local, métodos baseados em anticorpos foram recentemente desenvolvidos7,8,9. No entanto, uma vez que esses métodos são altamente específicos para um determinado congénere, vários testes devem ser executados. O mais grave é que o romance congêneres crescerem tão rápido que seus anticorpos não podem ser gerados em tempo. Portanto, o desenvolvimento de biossensores de grupo específicas para monitorar os níveis totais de todos os congêneres em um teste pode fornecer uma métrica inestimável para avaliação do estado de poluição ambiental.
Recentemente, aptamers de ácido nucleico foram aplicados extensamente como elementos de reconhecimento em várias plataformas biosensing devido à sua capacidade de reconhecer uma grande variedade de destinos, de íons e pequenas moléculas de proteínas e células10,11 ,12. Aptamers são identificados através de um método em vitro chamado evolução sistemática de ligantes pelo enriquecimento exponencial (SELEX)13,14. SELEX começa com biblioteca aleatória sintético único fio do oligonucleotide, que contém aproximadamente 10 sequências15 14-10. O tamanho da biblioteca aleatória assegura a diversidade das estruturas de candidato de RNA ou DNA. Processo SELEX típico consiste de várias rodadas de enriquecimento até a biblioteca é enriquecida em sequências com alta afinidade e especificidade para o alvo. A piscina enriquecida final então é sequenciada, e as constantes de dissociação (Kd) e seletividade contra potencial substâncias interferentes são determinadas por diferentes técnicas tais como filtram binding, cromatografia de afinidade, superfície Plasmon ressonância (SPR), etc. 15
Devido a solubilidade em água extremamente pobre e falta de grupos funcionais para a imobilização de superfície, a seleção de aptamer de POPs é teoricamente difícil. Avanços significativos para SELEX aceleraram a descoberta de aptamers. No entanto, a seleção do grupo específico aptamers de POPs não ainda foi relatada. Até agora, apenas PCB-ligação DNA aptamers com elevada especificidade para um determinado congénere foram identificados16. PAEs são usados principalmente em materiais de policloreto de vinila, mudando de cloreto de polivinila de um plástico duro para um plástico elástico, agindo assim como um plastificante. Alguns PAEs foram identificados como desreguladores endócrinos, pode causar graves danos ao fígado e rins, reduzir a motilidade do esperma masculina e pode resultar em morfologia do esperma anormal e câncer testicular17. O composto - nem aptamers de PAE-obrigatórias específicas do grupo têm sido relatados.
O objetivo deste trabalho é fornecer um protocolo representativo para a seleção de aptamers de DNA específicas do grupo de altamente hidrofóbicas moléculas pequenas tais como PAEs, um grupo representativo de POPs. Podemos também demonstrar a aplicação do aptamer selecionado para a deteção de poluição ambiental. Este protocolo fornece orientação e insights para a descoberta de aptamer de outras pequenas moléculas hidrofóbicas.

<table><tbody><tr><td>UV-2550</td><td>Shimadzu, protocolo do Japão</td><td></td><td>, seção 3.8.2</td></tr><tr><td>DNA Engnine Termociclador, PTC0200</td><td>seção BIO-RAD</td><td></td><td>3.5.1.2 e 3.5.2</td></tr><tr><td>C1000 Touch</td><td>BIO-RAD</td><td></td><td>seção 5.3.6 e 6.3</td></tr><tr><td>VMP3 potenciostato multicanal</td><td>Bio-Logic Science, Claix, França</td><td></td><td>seção 7.4,7.8 e 7.11</td></tr><tr><td>Sepharose 6B</td> <td>ativada por epóxiGE Healthcare (Piscataway, NJ, EUA)</td><td>10220020</td><td>grânulos de argarose, seção 2.3 e 3.3</td></tr><tr><td>Dynabeads M-270 grânulos magnéticos de ácido carboxílico</td><td>Invitrogen, EUA</td><td>420420</td><td>grânulos magnéticos, seção 5.2. e 5.3</td></tr><tr><td>Premix Taq Hot Start Version</td><td>Takara, Dalian, China</td><td>R028A</td><td>polimerase, seção 3.5.1.1</td></tr><tr><td>Membrana de vedação PARAFILM</td><td>Bemis, EUA</td><td>PM-996</td><td>seção 3.6.5</td></tr><tr><td>Lambda Exonuclease</td><td>Invitrogen, EUA</td><td>EN0561</td><td>section3.7.1.2.O tampão de reação de 10 &vezes; é fornecido junto com a exonuclease &lambda; pelo provedor.</td></tr><tr><td>Dr. GenTLE Portador de precipitação</td><td>Takara, Dalian, China</td><td>9094</td><td>seção 3.6.2 e 3.8.1</td></tr><tr><td>UNIQ-10 PÁGINA Kit de recuperação de DNA</td><td>Sangon Biotech (Xangai)</td><td>B511135</td><td>seção 4.2</td></tr><tr><td>Coloração de gel de ácido nucleico SYBR Gold</td><td>Invitrogen, EUA</td><td>1811838</td><td>corante de mancha de ácido nucélico, seção 3.5.1.5</td></tr><tr><td>SYBR Premix Ex Taq II</td><td>Takara, Dalian, China</td><td>RR820A</td><td>mistura de polimerase contendo polimerase e dNTPs, seção 5.3.5</td></tr><tr><td>Ácido 2-(N-morfolino)etanossulfônico (MES)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CAS: 1132-61-2</td><td>seção 5.2.1</td></tr><tr><td>Cloridrato de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC)</td><td>Invitrogen, EUA</td><td>CAS: 25952-53-8</td><td>seção 5.2.2</td></tr><tr><td>N-hidroxisuccinimida (NHS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>6066-82-6</td><td>seção 5.2.3</td></tr><tr><td>mercaptohexanol (MCH)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>CAS: 1633-78-9</td><td>seção 7.7</td></tr><tr><td>Eletrodo de ouro</td><td>Shanghai Chenhua</td><td>CHI101</td><td>seção 7.4. - 7.11</td></tr><tr><td>cloridrato de tris (2-carboxietil) fosfina (TCEP)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>CAS: 51805-45-9</td><td>seção 7.5</td></tr><tr><td>O- (2-mercaptoetil) -O'-metil-hexa- (etilenoglicol)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>CAS: 651042-82-9</td><td>seção 7.7</td></tr><tr><td>ftalato de dietilexil (DEHP)</td><td>Instituto Nacional de Metrologia, China</td><td>CAS: 117-81-7</td><td>seção 7.11</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CAS: 9005-64-5</td><td>polioxietileno(20) monolaurato de sorbaitano</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CAS: 9002-93-1</td><td>agente tensoativo não iônico</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5368</td><td>tampão fosfato 10 mM contendo 1 M NaCl, pH 7,4</td></tr></tbody></table>

seleção de aptamer de dna de ligação éster de ácido ftálico, caracterização e aplicação de um aptasensor eletroquímica

Phthalic Acid Ester-Binding DNA Aptamer Selection, Characterization, and Application to an Electrochemical Aptasensor

Ácido ftálico ésteres (PAEs) é um dos principais grupos de poluentes orgânicos persistentes. A detecção de grupo específico de PAEs é altamente desejada devido ao rápido crescimento de congêneres. Aptamers de DNA foram cada vez mais aplicadas como elementos de reconhecimento em plataformas biosensor, mas selecionando aptamers em direção a alvos altamente hidrofóbicos pequena molécula, como PAEs, é raramente relatada. Este trabalho descreve um método baseado em talão projetado para selecionar aptamers de DNA específicas do grupo de PAEs. O grupo amino acrescida Dibutilftalato (DBP-NH2) como o alvo de âncora foi sintetizado e imobilizado sobre os grânulos de agarose epóxi-ativado, permitindo que a exibição do grupo éster anidridos ftálico na superfície da matriz de imobilização, e por conseguinte, a seleção dos fichários do grupo específico. Determinamos as constantes de dissociação dos candidatos aptamer pela reacção em cadeia quantitativa polimerização juntamente com separação magnética. O relativas afinidades e seletividade da aptamers a outros PAEs foram determinadas por ensaios competitivos, onde os candidatos aptamer foram previamente delimitados ao DBP-NH2 anexado grânulos magnéticos e lançado para o sobrenadante após incubação com os PAEs testados ou outras substâncias interferentes potenciais. O ensaio do competidor foi aplicado porque permitia uma comparação facile afinidade entre PAEs que não tinha nenhum grupos funcionais para a imobilização de superfície. Finalmente, demonstrou a fabricação de um aptasensor eletroquímico e usou para detecção ultra-sensível e seletiva de ftalato de bis(2-ethylhexyl). Este protocolo fornece insights para a descoberta de aptamer de outras pequenas moléculas hidrofóbicas.

Projetamos e sintetizado o grupo amino acrescido Dibutilftalato (DBP-NH2) como o destino de âncora (Figura 1F). Em seguida, realizamos a seleção de aptamer do DNA de PAEs usando DBP-NH2 como o destino de âncora e seguindo o método baseado em imobilização clássica do alvo (Figura 2). Em cada rodada, um piloto PCR foi realizada usando a página desnaturada para otimizar o número de ciclo de PCR (<strong class="...

É apresentado um protocolo para a seleção em vitro e caracterização de aptamers de DNA de ligação éster ácido ftálico de grupo específico. A aplicação do aptamer selecionado em um aptasensor eletroquímico também está incluída.

Seleção de Aptamer de DNA de ligação éster de ácido ftálico, caracterização e aplicação de um Aptasensor eletroquímica

Phthalic acid esters (PAEs) areone of the major groups of persistent organic pollutants. The group-specific detection of PAEs is highly desired due to the ...

O objetivo geral deste procedimento é selecionar aptâmeros de DNA específicos do grupo para moléculas pequenas altamente hidrofóbicas e usar o aptâmero selecionado para desenvolver um biossensor eletroquímico sensível. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo de seleção de aptâmeros, sobre como selecionar e caracterizar aptâmeros específicos de grupos quando os alvos são moléculas altamente hidrofóbicas. Enquanto a parte mais útil deste método é o desenvolvimento de biossensores eletroquímicos, para a detecção de títulos.Esses biossensores também devem funcionar para nossas medições de afinidade de aptâmeros. Para iniciar a reação, adicione 100 microlitros de água livre de RNase ao produto purificado de aptâmero PCR. Vortex a mistura até que o precipitado se dissolva.A reação de exonuclease lambda é sensível à concentração de sal e é um produto que deve ser proliferado por precipitação de etanol, mas outro isopropanol. Coloque em cada um dos cinco tubos de microcentrífuga, cinco microlitros da solução de aptâmero, 11 microlitros de água livre de Rnase e dois microlitros de tampão de reação 10x. Adicione dois microlitros de água livre de Rnase e soluções de duas

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Chemistry

Química

Protocolos SELEX compreendem várias rodadas de seleção, cada um dos que exigem a regeneração de ligantes vinculado, que por sua vez requerem seqüências de primers que flanqueiam as regiões fixo biblioteca aleatória. Essas seqüências de primers fixo pode interferir com o processo de seleção (falsos positivos e negativos). Aqui apresentamos um primer sem protocolo.

Primer-Free Seleção Aptamer usando uma biblioteca de DNA Aleatório

"E-DNA" sensores, reagentless, biossensores eletroquímicos que um bom desempenho, mesmo quando desafiados diretamente no sangue e outras matrizes complexas, foram adaptados para a detecção de uma ampla gama de ácido nucléico, proteínas e moléculas pequenas analitos. Aqui apresentamos um procedimento geral para a fabricação e uso de tais sensores.

Fabricação de Eletroquímica-DNA Biossensores para Detecção Reagentless de ácidos nucléicos, proteínas e pequenas moléculas

Recentemente, relatou uma nova abordagem para a geração de sondas DNAzyme fluorogênicos que podem ser aplicadas para criar um simples, "mistura-e-ler" teste de fluorescência para a detecção bacteriana. Estas sondas de DNA especiais catalisar a clivagem de um cromóforo-modificado substrato DNA-RNA quimérico, na presença de mistura extracelular em bruto (CEM) produzida por uma bactéria específica, assim, traduzindo a detecção de bactérias em geração do sinal de fluorescência. Neste relatório, irá...

Detecção de bactérias utilizando DNAzymes fluorogénicas

Um protocolo é fornecido para selecionar aptâmeros de comutação de estrutura para alvos de moléculas pequenas com base em um método de seleção de esferas magnéticas de rigor ajustável. Os aptâmeros selecionados com propriedades de comutação de estrutura são benéficos para ensaios que requerem uma mudança conformacional para sinalizar a presença de um alvo, como o ensaio de nanopartículas de ouro descrito.

Um método para selecionar Aptamers de comutação Estrutura Aplicado a um colorimétrico nanopartículas de ouro Assay

A termoforese em microescala (MST) é uma tecnologia sensível para caracterizar as interações aptâmero-alvo. Este manuscrito descreve um protocolo MST para caracterizar as interações aptâmero-pequenas moléculas.

Mapear o sítio de ligação de um Aptamer no ATP Usando MicroScale termoforese

Um protocolo para o desenvolvimento de um biosensor eletroquímico de DNA composta por um eletrodo de carbono ácido-estável, ouro de nanopartículas-modificado, serigrafado polilático para detectar o Vibrio parahaemolyticus é apresentado.

Desenvolvimento de um Biosensor eletroquímico do DNA para detectar um patógeno de origem alimentar

Aqui, apresentamos um protocolo para a detecção e quantificação de baixas moléculas abundantes em soluções complexas usando molecular imprinting em combinação com um biossensor de capacitância.

Detecção ultra-sensível de biomarcadores usando um Imprinting Molecular baseado Biosensor capacitivo

A atividade de nuclease alterada tem sido associada a diferentes condições humanas, subjacentes ao seu potencial como biomarcador. A metodologia modular e fácil de implementar a triagem apresentada neste artigo permite a seleção de sondas de ácido nucleico específico para aproveitar a atividade de nuclease como biomarcador da doença.

Triagem cinética da atividade da nuclease usando sondas de ácido nucleico

O presente protocolo descreve o uso da Calorimetria de Titulação Isotérmica (ITC) para analisar a cinética de associação e dissociação da ligação entre um aptâmero de DNA e tetraciclina, incluindo a preparação de amostras, padrões de corrida e amostras, e a interpretação dos dados resultantes.

Determinando a associação termodinâmica e cinética de um aptamer de DNA e tetraciclina usando calorimetria de titulação isotérmica

O presente protocolo demonstra o uso de um ensaio rápido de amplificação exponencial baseado em aptâmeros de 3 estágios para detectar alvos. A preparação da amostra, a amplificação do sinal e o desenvolvimento da cor são abordados para implementar este sistema para reconhecer a presença de teofilina sobre a cafeína.

Detecção de alvos baseada em aptâmero facilitada por uma reação de amplificação exponencial isotérmica G-quadruplex de 3 estágios

Este protocolo descreve o projeto de sondas de hibridização dividida utilizando o aptâmero de luz fluorescente DAP-10-42 como repórter de sinal e sua aplicação para detecção de ácido nucleico e diferenciação entre alvos com substituições de nucleotídeo único.

Sonda de hibridização dividida utilizando um aptâmero de luz fluorescente de DNA como repórter de sinal para análise de ácido nucleico de sequência específica

Aprenda a selecionar aptâmeros de DNA para moléculas hidrofóbicas e desenvolver um aptassensor eletroquímico sensível. Este método utiliza SELEX e caracterização de afinidade para detectar ésteres de ácido ftálico.

Seleção de Aptamer de DNA de ligação éster de ácido ftálico, caracterização e aplicação de um Aptasensor eletroquímica

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