Name: A quantificação da expressão da proteína e co-localização Usando multiplexada Imuno-histoquímica Coloração e Multispectral Imagiologia (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 40 s
Description: Aprenda a quantificar expressão proteica e co-localização usando imuno-histoquímica multiplexada e imagiologia multiespectral. Este método elimina a subjetividade do operador, melhorando a reprodutibilidade em pesquisa e diagnóstico patológico.

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Os autores agradecem à Universidade de Wisconsin Translational iniciativas de investigação no laboratório de patologia, em parte apoiado pelo Departamento de Patologia e Medicina Laboratorial UW e concessão UWCCC P30 CA014520, para o uso de suas instalações e serviços.

<ol><li>Valdman, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+redox+pathway+enzymes+in+human+prostatic+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Quant+Cytol+Histol%22%5BJournal%5D)">Expression of redox pathway enzymes in human prostatic tissue.</a> Anal Quant Cytol Histol. 31 (6), 367-374 (2009).</li>
<li>Rimm, D. L., Camp, R. L., Charette, L. A., Olsen, D. A., Provost, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amplification+of+tissue+by+construction+of+tissue+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Mol+Pathol%22%5BJournal%5D)">Amplification of tissue by construction of tissue microarrays.</a> Exp Mol Pathol. 70 (3), 255-264 (2001).</li>
<li>Jonmarker, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+PDX-1+in+prostate+cancer%2C+prostatic+intraepithelial+neoplasia+and+benign+prostatic+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22APMIS%22%5BJournal%5D)">Expression of PDX-1 in prostate cancer, prostatic intraepithelial neoplasia and benign prostatic tissue.</a> APMIS. 116 (6), 491-498 (2008).</li>
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<li>Volante, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatostatin+receptor+type+2A+immunohistochemistry+in+neuroendocrine+tumors%3A+a+proposal+of+scoring+system+correlated+with+somatostatin+receptor+scintigraphy%5BTitle%5D)+AND+%22Mod+Pathol%22%5BJournal%5D)">Somatostatin receptor type 2A immunohistochemistry in neuroendocrine tumors: a proposal of scoring system correlated with somatostatin receptor scintigraphy.</a> Mod Pathol. 20 (11), 1172-1182 (2007).</li>
<li>Muris, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemical+profiling+of+caspase+signaling+pathways+predicts+clinical+response+to+chemotherapy+in+primary+nodal+diffuse+large+B-cell+lymphomas%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemical profiling of caspase signaling pathways predicts clinical response to chemotherapy in primary nodal diffuse large B-cell lymphomas.</a> Blood. 105 (7), 2916-2923 (2005).</li>
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<li>Peters, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+tissue+organelles+by+a+combination+of+analytical+subcellular+fractionation+and+enzymic+microanalysis%3A+a+new+approach+to+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Pathol%22%5BJournal%5D)">Investigation of tissue organelles by a combination of analytical subcellular fractionation and enzymic microanalysis: a new approach to pathology.</a> J Clin Pathol. 34 (1), 1-12 (1981).</li>
<li>Emmert-Buck, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+Capture+Microdissection%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Laser Capture Microdissection.</a> Science. 274 (5289), 998-1001 (1996).</li>
<li>Waters, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accuracy+and+precision+in+quantitative+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Accuracy and precision in quantitative fluorescence microscopy.</a> J Cell Biol. 185 (7), 1135-1148 (2009).</li>
<li>Huang, W., Hennrick, K., Drew, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+colorful+future+of+quantitative+pathology%3A+validation+of+Vectra+technology+using+chromogenic+multiplexed+immunohistochemistry+and+prostate+tissue+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Pathol%22%5BJournal%5D)">A colorful future of quantitative pathology: validation of Vectra technology using chromogenic multiplexed immunohistochemistry and prostate tissue microarrays.</a> Hum Pathol. 44 (1), 29-38 (2013).</li>
<li>Rimm, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C-Path%3A+A+Watson-Like+Visit+to+the+Pathology+Lab%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">C-Path: A Watson-Like Visit to the Pathology Lab.</a> Science Translational Medicine. 3 (108), (2011).</li>
<li>Fiore, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utility+of+multispectral+imaging+in+automated+quantitative+scoring+of+immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Pathol%22%5BJournal%5D)">Utility of multispectral imaging in automated quantitative scoring of immunohistochemistry.</a> J Clin Pathol. 65 (6), 496-502 (2012).</li>
<li>Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+immunohistochemistry%2C+imaging%2C+and+quantitation%3A+A+review%2C+with+an+assessment+of+Tyramide+signal+amplification%2C+multispectral+imaging+and+multiplex+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: A review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis.</a> Methods. 70 (1), 46-58 (2014).</li>
<li>Rizzardi, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+comparison+of+immunohistochemical+staining+measured+by+digital+image+analysis+versus+pathologist+visual+scoring%5BTitle%5D)+AND+%22Diagn+Pathol%22%5BJournal%5D)">Quantitative comparison of immunohistochemical staining measured by digital image analysis versus pathologist visual scoring.</a> Diagn Pathol. 7, 42(2012).</li>
<li>Bauman, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+fibrillar+collagens+and+extracellular+matrix+of+glandular+benign+prostatic+hyperplasia+nodules%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Characterization of fibrillar collagens and extracellular matrix of glandular benign prostatic hyperplasia nodules.</a> PLoS One. 9 (10), e109102(2014).</li>
<li>Bauman, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beta-catenin+is+elevated+in+human+benign+prostatic+hyperplasia+specimens+compared+to+histologically+normal+prostate+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Clin+Exp+Urol%22%5BJournal%5D)">Beta-catenin is elevated in human benign prostatic hyperplasia specimens compared to histologically normal prostate tissue.</a> Am J Clin Exp Urol. 2 (4), 313-322 (2014).</li>
<li>Bauman, T. M., Ewald, J. A., Huang, W., Ricke, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD147+expression+predicts+biochemical+recurrence+after+prostatectomy+independent+of+histologic+and+pathologic+features%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">CD147 expression predicts biochemical recurrence after prostatectomy independent of histologic and pathologic features.</a> BMC Cancer. 15 (1), 549(2015).</li>
<li>Bauman, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Finasteride+treatment+alters+tissue+specific+androgen+receptor+expression+in+prostate+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Prostate%22%5BJournal%5D)">Finasteride treatment alters tissue specific androgen receptor expression in prostate tissues.</a> Prostate. 74 (9), 923-932 (2014).</li>
<li>Nicholson, T. M., Sehgal, P. D., Drew, S. A., Huang, W., Ricke, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex+steroid+receptor+expression+and+localization+in+benign+prostatic+hyperplasia+varies+with+tissue+compartment%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Sex steroid receptor expression and localization in benign prostatic hyperplasia varies with tissue compartment.</a> Differentiation. 85 (4-5), 140-149 (2013).</li>
<li>Taylor, C. R., Levenson, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+immunohistochemistry--issues+concerning+methods%2C+utility+and+semiquantitative+assessment+II%5BTitle%5D)+AND+%22Histopathology%22%5BJournal%5D)">Quantification of immunohistochemistry--issues concerning methods, utility and semiquantitative assessment II.</a> Histopathology. 49 (4), 411-424 (2006).</li>
<li>Matos, L. L., Trufelli, D. C., de Matos, M. G., da Silva Pinhal, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemistry+as+an+important+tool+in+biomarkers+detection+and+clinical+practice%5BTitle%5D)+AND+%22Biomark+Insights%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemistry as an important tool in biomarkers detection and clinical practice.</a> Biomark Insights. 5, 9-20 (2010).</li>
<li>Kononen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+microarrays+for+high-throughput+molecular+profiling+of+tumor+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Tissue microarrays for high-throughput molecular profiling of tumor specimens.</a> Nat Med. 4 (7), 844-847 (1998).</li>
<li>Ong, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computer-assisted+pathological+immunohistochemistry+scoring+is+more+time-effective+than+conventional+scoring%2C+but+provides+no+analytical+advantage%5BTitle%5D)+AND+%22Histopathology%22%5BJournal%5D)">Computer-assisted pathological immunohistochemistry scoring is more time-effective than conventional scoring, but provides no analytical advantage.</a> Histopathology. 56 (4), 523-529 (2010).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

A utilização de imuno-histoquímica tradicional para avaliar a expressão de proteínas é limitado por métodos subjectivos, semi-quantitativos de análise 22,23. plataformas de avanço de ter sido criado por análise de alto rendimento de expressão de biomarcadores e localização. segmentação detalhada de ambos os tecidos e compartimentos subcelulares permite aos usuários estudar a expressão de biomarcadores, localização e co-localização com outros marcadores de interesse. Em estudos anteriores, que demonstraram a u...

<html> A imuno-histoquímica (IHQ) é uma técnica de laboratório padrão para a detecção de proteína dentro do tecido, e IHC ainda é largamente utilizado tanto em pesquisa e de diagnóstico da patologia. A avaliação da coloração IHC é frequentemente semi-quantitativa, a introdução de potencial de polarização para interpretação dos resultados. Muitas abordagens semi-quantitativos foram desenvolvidos que incorporam tanto a intensidade da coloração e medida coloração em diagnóstico final 1-4. Outros sistemas incluem intensidade de pontuação e localização subcelular, a fim de melhor localizar a expressão 5. Incorporação de pontuações médias de vários espectadores é frequentemente utilizada, a fim de minimizar os efeitos da polarização único espectador 6. Apesar destes esforços, a subjetividade na análise ainda permanece, particularmente quando se avalia o grau de coloração 7. padronização do protocolo e minimizando a subjetividade da entrada humana é fundamental para a criação, resultados IHC reprodutíveis precisos. conteúdo &quot;&gt; Há outras opções além de IHQ para determinar a expressão de proteínas no interior de tecidos. Dentro do contexto de investigação, a imunohistoquímica tem sido tradicionalmente considerado como um meio para analisar localização da proteína 8, enquanto que outras técnicas, tais como imunotransferência são vistos como padrão de ouro para investigar a expressão da proteína . tecido Determinar ou expressão específica do compartimento da célula é difícil sem incorporar técnicas avançadas, como fracionamento celular ou captura a laser microdissecção 9,10. O uso de anticorpos fluorescentes em lâminas de tecido oferece um compromisso razoável, mas o fundo autofluorescência devido à NADPH, lipofuscins, reticular fibras, colágeno e elastina pode fazer uma quantificação precisa difícil 11. Plataformas de patologia computacionais automatizados são uma direção promissora para a quantificação mais objetiva da coloração patologia 12-15. Combinando imagens multiespectrais com microarrays de tecidofacilita a análise de alto rendimento de expressão da proteína em grandes tamanhos de amostra. Com estas técnicas, a análise de co-localização de proteínas, a heterogeneidade coloração e tecidos e localização subcelular é possível, reduzindo substancialmente os preconceitos e tempo necessário para análise inerentes, ao retornar dados de uma contínua em vez de formato categórica 16. Por conseguinte, o objectivo do presente estudo foi demonstrar a utilidade da metodologia e imuno-histoquímica para a realização de análises com multiplexado, utilizando software de imagem multi-espectral. Este protocolo é escrito para coloração imuno-histoquímica manual, o multiplex de uma única secção de tecido de slides com quatro anticorpos monoclonais otimizados. Como uma experiência representativa, de coelho anti-alfa nuclear do receptor de estrogénio (RctE) e o receptor de androgénio (AR) são multiplexados com anti-rato de CD147 ligado à membrana e ligada à membrana anti-ratinho de E-caderina. Qualquer anticorpo de escolha pode ser Substituted para os anticorpos aqui listadas, mas cada combinação de anticorpos requer otimização separada. Pré-tratamento para todos os anticorpos têm de ser idênticos. Os anticorpos de AR e CD147 deve ser optimizado individualmente e, em seguida, como um cocktail. Cada anticorpo é detectado usando um sistema de polímero livre de biotina e um de 4 cromogénios exclusivos.

<table><tbody><tr><td>Xileno</td><td>Fisher Chemical</td><td>X3F1GAL</td><td>Classificação NFPA: Saúde &ndash; 2, Fogo &ndash; 3 , Reatividade &ndash; 0</td></tr><tr><td>Álcool Etílico-200 à prova Fisher</td><td>Scientific</td><td>4355223</td><td>Classificação NFPA: Saúde &ndash; 0, Fogo &ndash; 3 , Reatividade &ndash; 0</td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-500</td><td>Classificação NFPA: Saúde &ndash; 2, Fogo &ndash; 0 , Reatividade &ndash; 0</td></tr><tr><td>Tris Hidroximetil aminometano HCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP153-1</td><td>Classificação NFPA: Saúde &ndash; 2, Fogo &ndash; 0 Reatividade &ndash; 0</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Chem-Impex</td><td>1512</td><td>Classificação NFPA: Saúde &ndash; 0, Fogo &ndash; 1 , Reatividade &ndash; 0</td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2944-100</td><td>Classificação NFPA: Saúde &ndash; 1, Fogo - 0 , Reatividade &ndash; 0</td></tr><tr><td>Peroxidazed</td><td>Biocare Medical</td><td>PX968</td><td>Evite o contato com a pele e os olhos. Pode causar irritação na pele e danos aos olhos.</td></tr><tr><td>Receptor de estrogênio alfa</td><td>Thermo Fisher Scientific-Labvision</td><td>RM9101</td><td>Não classificado como perigoso</td></tr><tr><td>Receptor de andrógeno</td><td>SCBT</td><td>sc-816</td><td>Não classificado como perigoso</td></tr><tr><td>CD147</td><td>Biodesign</td><td>P87535M</td><td>Não classificado como perigoso</td></tr><tr><td>E-caderina</td><td>Dako</td><td>M3612</td><td>Não classificado como perigoso</td></tr><tr><td>Renoir Red Andibody Diluent</td><td>Biocare Medical</td><td>PD904</td><td>É especialmente projetado para trabalhar com anticorpos baseados em Tris</td></tr> Câmara <tr><td>de Decamuflagem&nbsp;</td><td>Biocare Medical</td><td>Modelo DC2002</td><td>Tome as precauções normais ao usar uma panela de pressão</td></tr><tr><td>Caneta barreira-Immuno Edge&nbsp;</td><td>Vector Labs</td><td>H-4000</td><td></td></tr><tr><td>Kit de Desnaturação - Etapa de eluição</td><td>Biocare</td><td>Medical DNS001H</td><td>Não classificado como perigoso</td></tr><tr><td>Mach 2 Cabra anti-Coelho HRP Polímero</td><td>Biocare Medical</td><td>RHRP520</td><td>Não classificado como perigoso</td></tr><tr><td>Mach 2 Cabra anti-Coelho AP Polímero</td><td>Biocare Medical</td><td>RALP525</td><td>Não classificado como perigoso</td></tr><tr><td>Mach 2 Cabra anti-Mouse HRP Polímero</td><td>Biocare Medical</td><td>M3M530</td><td>Não classificado como perigoso</td></tr><tr><td>Kit de cromogênio Betazoid DAB</td><td>Biocare Medical</td><td>BDB2004</td><td>1. Sabe-se que o BAD é suspeito de ser cancerígeno. 2. Não exponha os componentes DAB à luz forte ou luz solar direta. 3. Use equipamentos e roupas de proteção individual adequados. 4. O DAB pode causar sensibilização da pele. Evite o contato com a pele e os olhos. 5. Observe todos os ambientes federais, estaduais e locais em relação ao descarte</td></tr><tr><td>Warp Red Chromogen Kit</td><td>Biocare Medical</td><td>WR806</td><td>Corrosivo. Ácido que pode causar irritação na pele ou danos aos olhos.&nbsp;</td></tr><tr><td>Kit de Cromogênio Verde Vina</td><td>Biocare Medical</td><td>BRR807</td><td>Nocivo se ingerido</td></tr><tr><td>Kit de Cromogênio Roxo Bajoriano</td><td>Biocare Medical</td><td>BJP807</td><td>Líquido inflamável. Mantenha longe do calor, chamas e faíscas. Nocivo por ingestão ou absorção. Evite o contato com a pele ou os olhos e evite a inalação.</td></tr><tr><td>Hematoxilina para Gatos</td><td>Biocare Medical</td><td>CATHE</td><td>Roxo &nbsp; solução &nbsp; com &nbsp; a &nbsp; leve &nbsp; acético &nbsp; ácido &nbsp; (vinagre) &nbsp; perfume. &nbsp; Maio &nbsp; be &nbsp; irritante &nbsp; para &nbsp; pele &nbsp; ou &nbsp; olho. &nbsp; Evite &nbsp; Contato &nbsp; com &nbsp; pele &nbsp; e &nbsp; olho. &nbsp; Evite &nbsp; ingestão.</td></tr><tr><td>Mídia de Montagem XYL</td><td>Richard Allen</td><td>8312-4</td><td>Classificação NFPA: Saúde &ndash; 2, Fogo &ndash; 3 , Reatividade &ndash;</td></tr><tr><td>0 1.5 Lamínulas</td><td>Marca Fisher</td><td>22266858</td><td>Bordas afiadas</td></tr><tr><td>Incubação (Umidade)Câmara</td><td>obsoleta</td><td>obsoleto</td><td>Vários fornecedores disponíveis</td></tr><tr><td>Forno de Convecção</td><td>Estável- Therm</td><td>C-4008-Q</td><td></td></tr><tr><td>Fundo Reagente de Bloqueio Punisher</td><td>Biocare Medical</td><td>BP974</td><td>Este produto não é classificado como perigoso.&nbsp;</td></tr><tr><td>Software inForm</td><td>PerkinElmer</td><td>CLS135781</td><td>Software de imagem multiespectral primário usado no manuscrito</td></tr><tr><td>Software Nuance</td><td>PerkinElmer</td><td>Nuance EX</td><td>Software usado para fazer bibliotecas espectrais dentro do manuscrito</td></tr><tr><td>Microscópio Vectra e scanner de lâminas</td><td>PerkinElmer</td><td>VECTRA</td><td>Scanner de lâminas automatizado e microscópio para obtenção de cubos de imagem IM3</td></tr></tbody></table>

a quantificação da expressão da proteína e co-localização usando multiplexada imuno-histoquímica coloração e multispectral imagiologia

Quantitation of Protein Expression and Co-localization Using Multiplexed Immuno-histochemical Staining and Multispectral Imaging

A imuno-histoquímica é uma técnica de detecção clínica e laboratorial comumente usada para investigar a expressão e localização de proteínas nos tecidos. Muitos sistemas semiquantitativos foram desenvolvidos para pontuar a expressão usando imuno-histoquímica, mas a subjetividade inerente limita a reprodutibilidade e a precisão dos resultados. Além disso, a investigação de biomarcadores espacialmente sobrepostos, como fatores de transcrição nuclear, é difícil com as técnicas atuais de imuno-histoquímica. Desenvolvemos e otimizamos um sistema para investigação simultânea de múltiplas proteínas usando métodos de alto rendimento de imuno-histoquímica multiplexada e imagem multiespectral. A imuno-histoquímica multiplexada é realizada pela aplicação sequencial de anticorpos primários com anticorpos secundários conjugados à peroxidase de rábano ou fosfatase alcalina. Diferentes cromógenos são usados para detectar cada proteína de interesse. As lâminas coradas são carregadas em um scanner de lâminas automatizado e um protocolo é criado para aquisição automatizada de imagens. Uma biblioteca espectral é criada colorindo um conjunto de lâminas com um único cromógeno em cada uma. Um subconjunto de imagens coradas representativas é importado para o software de imagem multiespectral e um algoritmo para distinguir o tipo de tecido é criado definindo compartimentos de tecido nas imagens. Os compartimentos subcelulares são segmentados usando a contracoloração de hematoxilina e ajustando o algoritmo intrínseco. O limiar é aplicado para determinar a positividade e a co-localização de proteínas. O algoritmo final é então aplicado a todo o conjunto de tecidos. Os dados resultantes permitem ao usuário avaliar a expressão de proteínas com base no tipo de tecido (por exemplo, epitélio vs. estroma) e compartimento subcelular (núcleo vs. citoplasma vs. membrana plasmática). A análise de co-localização permite a investigação de tipos de células duplamente positivas, duplamente negativas e uni-positivas. A combinação de imagens multiespectrais com imuno-histoquímica multiplexada e aquisição automatizada de imagens é um método objetivo e de alto rendimento para investigação de biomarcadores dentro dos tecidos.

Na Figura 1, a formação é realizada sobre os tecidos da próstata para segmentar imagens em porções epiteliais e do estroma, juntamente com o compartimento de não-tecido. Ao utilizar o marcador de membrana de E-caderina epitelial, a segmentação de células foi realizada para separar o núcleo, citoplasma, e porções de membrana, apresentados na Figura 2. Numa experiência, foi utilizado multiplexad...

A imuno-histoquímica é uma poderosa técnica de laboratório para avaliar a localização e expressão de proteínas nos tecidos. Os métodos semiautomatizados atuais de quantificação introduzem subjetividade e muitas vezes criam resultados irreproduzíveis. Aqui, descrevemos métodos para imuno-histoquímica multiplexada e quantificação objetiva da expressão e co-localização de proteínas usando imagens multiespectrais.

A quantificação da expressão da proteína e co-localização Usando multiplexada Imuno-histoquímica Coloração e Multispectral Imagiologia

Immunohistochemistry is a commonly used clinical and research lab detection technique for investigating protein expression and localization within ...

O objetivo geral deste método é quantificar de forma objetiva a expressão proteica e a co-localização utilizando imagem multiespectral. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais nas áreas de pesquisa básica e patologia diagnóstica, como as alterações na expressão e na localização de proteínas após tratamento ou durante a progressão de doenças. A principal vantagem desta técnica é que ela elimina a subjetividade do operador inerente aos métodos tradicionais de quantificação.Para iniciar o processo de quantificação, abra o software de imagem multiespectral para criar uma biblioteca espectral a partir de lâminas-controle previamente preparadas coradas com cromógenos individuais e a lâmina corada com hematoxilina. Em seguida, abra um cubo de imagem adquirido de uma lâmina-controle e selecione quatro a cinco áreas positivamente coradas para definir opticamente o cromógeno. Repita os passos com cubos de imagem de outras lâminas-controle até que uma biblioteca espectral completa, representando todos os cromógenos, seja criada, e então salve a biblioteca espectral.Inicie um novo projeto no software de imagem multiespectral selecionando Multispectral ou im3 como opção de formato de imagem e Campo Claro para o formato da amostra. Configure o projeto escolhendo segmentar tecido, identificar características, fenotipagem, pontuação e exportação. Altere a resolução da imagem para acelerar o tempo de análise, se desejado.Importe a biblioteca espectral previamente criada e selecione todos os cromógenos a serem incluídos na análise. Abra os cubos de imagem que serão incluídos no conjunto de dados de treinamento selecionando a opção Abrir Cubo de Imagem. Selecione pelo menos 18% do número total de imagens a serem analisadas para garantir a precisão do treinamento.Em seguida, escolha o conjunto de treinamento de imagens. Imagens que representem todos os estados da doença, para aumentar a precisão da segmentação. Inclua imagens com coloração negativa em abundância no conjunto de treinamento para evitar viés durante esta etapa.Iguale o balanço de branco das imagens no conjunto de treinamento selecionando a ferramenta conta-gotas e escolhendo uma área em uma imagem que seja branca. Selecione o botão avançar para passar para a segmentação do tecido. Em seguida, use o painel de categorias de tecido para escolher os tipos de tecido a serem analisados; para uma localização proteica mais precisa no tecido, podem ser utilizadas categorias de tecido específicas.Comece a criar o algoritmo e a definir as categorias de tecido utilizando a ferramenta de caneta e desenhando ao redor de grupos de células nas imagens de treinamento. Após concluir uma categoria de tecido, repita o passo para as demais categorias de tecido. Certifique-se de escolher grupos de células nas imagens que sejam característicos do tipo de categoria de tecido.Selecione os componentes a serem incluídos no treinamento do segmentador de tecidos. Escolha uma escala de padrão apropriada para treinar o segmentador de tecidos. Em seguida, selecione o botão do segmentador de tecidos treinado.Observe uma caixa pop-up exibindo a precisão da proporção de pixels dentro das regiões de treinamento corretamente classificadas. Segmento o conjunto completo de imagens de treinamento clicando em segmentar imagens. Ao finalizar, revise o conjunto de treinamento para identificar qualquer tecido mal classificado com o algoritmo de treinamento atual.Quando estiver seguro com os resultados do algoritmo de segmentação do tecido, selecione o botão avançar. Certifique-se de que o núcleo já esteja selecionado para escolher o citoplasma e/ou a membrana. Selecione a guia de núcleos e escolha as configurações apropriadas para a segmentação nuclear.Em seguida, escolha se categorias individuais ou todas as categorias de tecido serão incluídas na segmentação. Selecione a abordagem baseada em limiar de objeto da coloração de contraste para um método simplificado de obtenção de bons resultados. Em seguida, selecione a abordagem baseada em limiar de objeto em uma coloração nuclear de contraste confiável.Selecione os parâmetros com formato citoplasmático escolhendo a guia citoplasma. Em seguida, selecione a distância externa ao núcleo. Depois, selecione o tamanho mínimo.Selecione o próximo componente de opção com primário, secundário e terciário selecionado como opções secundárias. Vá para a aba membrana. Escolha a primeira opção para o marcador específico da membrana utilizado.Ajuste a densidade óptica em escala total ou OD para encontrar um limiar mínimo ou um positivo para cada marcador nas membranas celulares. Continuando na guia membrana, selecione o tamanho máximo da célula. Após selecionar todas as opções, selecione segmentar tudo.Aplicar as configurações às imagens e observá-las. Escolher avançar para passar para a etapa de pontuação IHC e selecionar uma categoria de tecido para pontuação. Escolher um tipo de pontuação desejado e selecionar o compartimento celular a ser usado na análise de pontuação.Em seguida, selecione os dados do componente de visualização e mova o cursor sobre as imagens de treinamento para encontrar o limiar mínimo de densidade óptica da coloração para células positivas para os componentes de interesse. Exporte os dados do conjunto de treinamento para testar o algoritmo criado por meio da segmentação de tecido, segmentação celular e valores de pontuação; siga as instruções para criar uma nova pasta para o diretório de exportação. Selecione as imagens e tabelas a serem criadas e incluídas na análise.Em seguida, realize a análise selecionando exportar tudo. Quando a análise estiver concluída, visualize os dados de segmentação celular e pontuação para imagens com coloração alta e baixa para avaliar a precisão das configurações. Após ficar satisfeito com as configurações, clique na guia de análise em lote para copiar o algoritmo para o projeto ativo.Em seguida, escolha um novo diretório de exportação e selecione as imagens e tabelas a serem incluídas na análise. Na opção de arquivos de entrada, selecione todas as imagens que serão incluídas na análise em lote. Selecione a opção executar para realizar a análise.Quando concluído, avance até a guia de revisão de mesclagem. Selecione incluir tudo e escolha mesclar para criar planilhas com dados resumidos para análise. O treinamento foi realizado em tecidos prostáticos para segmentar imagens em porções epiteliais e estromais.Juntamente com um compartimento não tecidual. Um conjunto de imagens de treinamento foi importado para um software de imagem multiespectral representando tipos de tecidos e estados patológicos de todo o conjunto de imagens. Foram criadas categorias de tecidos, incluindo estroma, epitélios e não tecido, e as categorias foram definidas desenhando manualmente sobre as imagens de treinamento.Foi criado e aplicado um algoritmo para segmentação de tecidos ao conjunto de treinamento de imagens. Segmentação precisa dos tecidos. Utilizando a técnica de imunohistoquímica multiplex, células positivas para expressão nuclear de ER-alfa, vistas como vermelhas, e AR, vistas como marrons, foram identificadas apesar da sobreposição de sinais coloridos e métricos. A expressão específica da membrana celular de CD-147 foi quantificada utilizando E-caderina, vista como preta, como proteína marcadora.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como quantificar a expressão proteica e a co-localização, além de informar e fixar tecidos embutidos em parafina.

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Biologia

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A quantificação da expressão da proteína e co-localização Usando multiplexada Imuno-histoquímica Coloração e Multispectral Imagiologia (Vídeo) | JoVE Journal

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