A quantificação da expressão da proteína e co-localização Usando multiplexada Imuno-histoquímica Coloração e Multispectral Imagiologia

O objetivo geral deste método é quantificar de forma objetiva a expressão proteica e a co-localização utilizando imagem multiespectral. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais nas áreas de pesquisa básica e patologia diagnóstica, como as alterações na expressão e na localização de proteínas após tratamento ou durante a progressão de doenças. A principal vantagem desta técnica é que ela elimina a subjetividade do operador inerente aos métodos tradicionais de quantificação.

Para iniciar o processo de quantificação, abra o software de imagem multiespectral para criar uma biblioteca espectral a partir de lâminas-controle previamente preparadas coradas com cromógenos individuais e a lâmina corada com hematoxilina. Em seguida, abra um cubo de imagem adquirido de uma lâmina-controle e selecione quatro a cinco áreas positivamente coradas para definir opticamente o cromógeno. Repita os passos com cubos de imagem de outras lâminas-controle até que uma biblioteca espectral completa, representando todos os cromógenos, seja criada, e então salve a biblioteca espectral.

Inicie um novo projeto no software de imagem multiespectral selecionando Multispectral ou im3 como opção de formato de imagem e Campo Claro para o formato da amostra. Configure o projeto escolhendo segmentar tecido, identificar características, fenotipagem, pontuação e exportação. Altere a resolução da imagem para acelerar o tempo de análise, se desejado.

Importe a biblioteca espectral previamente criada e selecione todos os cromógenos a serem incluídos na análise. Abra os cubos de imagem que serão incluídos no conjunto de dados de treinamento selecionando a opção Abrir Cubo de Imagem. Selecione pelo menos 18% do número total de imagens a serem analisadas para garantir a precisão do treinamento.

Em seguida, escolha o conjunto de treinamento de imagens. Imagens que representem todos os estados da doença, para aumentar a precisão da segmentação. Inclua imagens com coloração negativa em abundância no conjunto de treinamento para evitar viés durante esta etapa.

Iguale o balanço de branco das imagens no conjunto de treinamento selecionando a ferramenta conta-gotas e escolhendo uma área em uma imagem que seja branca. Selecione o botão avançar para passar para a segmentação do tecido. Em seguida, use o painel de categorias de tecido para escolher os tipos de tecido a serem analisados; para uma localização proteica mais precisa no tecido, podem ser utilizadas categorias de tecido específicas.

Comece a criar o algoritmo e a definir as categorias de tecido utilizando a ferramenta de caneta e desenhando ao redor de grupos de células nas imagens de treinamento. Após concluir uma categoria de tecido, repita o passo para as demais categorias de tecido. Certifique-se de escolher grupos de células nas imagens que sejam característicos do tipo de categoria de tecido.

Selecione os componentes a serem incluídos no treinamento do segmentador de tecidos. Escolha uma escala de padrão apropriada para treinar o segmentador de tecidos. Em seguida, selecione o botão do segmentador de tecidos treinado.

Observe uma caixa pop-up exibindo a precisão da proporção de pixels dentro das regiões de treinamento corretamente classificadas. Segmento o conjunto completo de imagens de treinamento clicando em segmentar imagens. Ao finalizar, revise o conjunto de treinamento para identificar qualquer tecido mal classificado com o algoritmo de treinamento atual.

Quando estiver seguro com os resultados do algoritmo de segmentação do tecido, selecione o botão avançar. Certifique-se de que o núcleo já esteja selecionado para escolher o citoplasma e/ou a membrana. Selecione a guia de núcleos e escolha as configurações apropriadas para a segmentação nuclear.

Em seguida, escolha se categorias individuais ou todas as categorias de tecido serão incluídas na segmentação. Selecione a abordagem baseada em limiar de objeto da coloração de contraste para um método simplificado de obtenção de bons resultados. Em seguida, selecione a abordagem baseada em limiar de objeto em uma coloração nuclear de contraste confiável.

Selecione os parâmetros com formato citoplasmático escolhendo a guia citoplasma. Em seguida, selecione a distância externa ao núcleo. Depois, selecione o tamanho mínimo.

Selecione o próximo componente de opção com primário, secundário e terciário selecionado como opções secundárias. Vá para a aba membrana. Escolha a primeira opção para o marcador específico da membrana utilizado.

Ajuste a densidade óptica em escala total ou OD para encontrar um limiar mínimo ou um positivo para cada marcador nas membranas celulares. Continuando na guia membrana, selecione o tamanho máximo da célula. Após selecionar todas as opções, selecione segmentar tudo.

Aplicar as configurações às imagens e observá-las. Escolher avançar para passar para a etapa de pontuação IHC e selecionar uma categoria de tecido para pontuação. Escolher um tipo de pontuação desejado e selecionar o compartimento celular a ser usado na análise de pontuação.

Em seguida, selecione os dados do componente de visualização e mova o cursor sobre as imagens de treinamento para encontrar o limiar mínimo de densidade óptica da coloração para células positivas para os componentes de interesse. Exporte os dados do conjunto de treinamento para testar o algoritmo criado por meio da segmentação de tecido, segmentação celular e valores de pontuação; siga as instruções para criar uma nova pasta para o diretório de exportação. Selecione as imagens e tabelas a serem criadas e incluídas na análise.

Em seguida, realize a análise selecionando exportar tudo. Quando a análise estiver concluída, visualize os dados de segmentação celular e pontuação para imagens com coloração alta e baixa para avaliar a precisão das configurações. Após ficar satisfeito com as configurações, clique na guia de análise em lote para copiar o algoritmo para o projeto ativo.

Em seguida, escolha um novo diretório de exportação e selecione as imagens e tabelas a serem incluídas na análise. Na opção de arquivos de entrada, selecione todas as imagens que serão incluídas na análise em lote. Selecione a opção executar para realizar a análise.

Quando concluído, avance até a guia de revisão de mesclagem. Selecione incluir tudo e escolha mesclar para criar planilhas com dados resumidos para análise. O treinamento foi realizado em tecidos prostáticos para segmentar imagens em porções epiteliais e estromais.

Juntamente com um compartimento não tecidual. Um conjunto de imagens de treinamento foi importado para um software de imagem multiespectral representando tipos de tecidos e estados patológicos de todo o conjunto de imagens. Foram criadas categorias de tecidos, incluindo estroma, epitélios e não tecido, e as categorias foram definidas desenhando manualmente sobre as imagens de treinamento.

Foi criado e aplicado um algoritmo para segmentação de tecidos ao conjunto de treinamento de imagens. Segmentação precisa dos tecidos. Utilizando a técnica de imunohistoquímica multiplex, células positivas para expressão nuclear de ER-alfa, vistas como vermelhas, e AR, vistas como marrons, foram identificadas apesar da sobreposição de sinais coloridos e métricos. A expressão específica da membrana celular de CD-147 foi quantificada utilizando E-caderina, vista como preta, como proteína marcadora.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como quantificar a expressão proteica e a co-localização, além de informar e fixar tecidos embutidos em parafina.