A quantificação da expressão da proteína e co-localização Usando multiplexada Imuno-histoquímica Coloração e Multispectral Imagiologia

A imuno-histoquímica é uma poderosa técnica de laboratório para avaliar a localização e expressão de proteínas nos tecidos. Os métodos semiautomatizados atuais de quantificação introduzem subjetividade e muitas vezes criam resultados irreproduzíveis. Aqui, descrevemos métodos para imuno-histoquímica multiplexada e quantificação objetiva da expressão e co-localização de proteínas usando imagens multiespectrais.

O objetivo geral deste método é quantificar objetivamente a expressão e a co-localização de proteínas usando imagens multiespectrais. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da pesquisa básica e da patologia diagnóstica, como a forma como as proteínas mudam a expressão e a localização após o tratamento ou na progressão da doença. A principal vantagem dessa técnica é que ela remove a subjetividade do operador inerente aos métodos tradicionais de quantificação.

Para iniciar o processo de quantificação, abra o software de imagem multiespectral para construir uma biblioteca espectral a partir de lâminas de controle previamente preparadas coradas com cromogênios individuais e a lâmina corada com hematoxilina. Em seguida, abra um cubo de imagem adquirido de um slide de controle e selecione de quatro a cinco áreas positivamente coradas para definir opticamente o cromogênio. Repita as etapas com cubos de imagem de outros slides de controle até que uma biblioteca espectral completa representando todos os cromogênios seja criada e, em seguida, salve a biblioteca espectral.

Inicie um novo projeto dentro do software de imagem multiespectral selecionando Multiespectral ou im3 para a opção de formato de imagem e Campo claro para o formato de amostra. Configure o projeto escolhendo segmentar tecido, localizar feições, fenotipagem, pontuação e exportação. Altere a resolução da imagem para acelerar o tempo de análise, se desejar.

Importe a biblioteca espectral criada anteriormente e selecione todos os cromógenos a serem incluídos na análise. Abra os cubos de imagem a serem incluídos no conjunto de dados de treinamento selecionando a opção Abrir Cubo de Imagem. Selecione pelo menos 18% do número total de imagens a serem analisadas para garantir a precisão do treinamento.

Em seguida, escolha o conjunto de imagens de treinamento. Imagens que representam todos os estados da doença, para aumentar a precisão da segmentação. Inclua imagens de coloração negativa abundantes no conjunto de treinamento para evitar viés durante esta etapa.

Equilibre as imagens no conjunto de treinamento selecionando a ferramenta conta-gotas e escolhendo uma área branca em uma imagem. Selecione o botão de avanço para mover a segmentação do tecido. Em seguida, use o painel de categorias de tecido para escolher os tipos de tecido a serem analisados para uma localização mais precisa do tecido proteico, categorias de tecido selecionadas podem ser usadas.

Comece a criar o algoritmo e definir categorias de tecido usando a ferramenta caneta e desenhando em torno de grupos de células em imagens de treinamento. Quando terminar com uma categoria de tecido, repita a etapa para outras categorias de tecido. Certifique-se de escolher grupos de células dentro das imagens que são características do tipo de categoria de tecido.

Selecione os componentes a serem incluídos no treinamento para o segmentador de tecidos. Escolha uma escala de padrão apropriada para treinar o segmentador de tecido. Em seguida, selecione o botão do segmentador de tecido treinado.

Observe uma caixa pop-up exibindo a precisão da proporção de pixels dentro das regiões de treinamento classificadas corretamente. Segmente todo o conjunto de imagens de treinamento clicando em imagens de segmento. Quando terminar, revise o conjunto de treinamento para encontrar qualquer tecido classificado incorretamente com um algoritmo de treinamento atual.

Quando estiver confiante com os resultados do algoritmo de segmentação de tecido, selecione o botão avançar. Certifique-se de que os núcleos já estejam selecionados para escolher citoplasma e/ou membrana. Selecione a guia núcleos e escolha as configurações apropriadas para a segmentação nuclear.

Em seguida, escolha se as categorias individuais ou todas as categorias de tecido serão incluídas na segmentação. Selecione a abordagem de limite baseada em objeto de contracoloração para um método simplificado para obter bons resultados. Em seguida, selecione a abordagem de limiar baseada em objeto em uma contracoloração nuclear confiável.

Selecione os parâmetros de forma de citoplasma escolhendo a guia citoplasma. Em seguida, selecione a distância externa ao núcleo. Em seguida, selecione o tamanho mínimo.

Selecione o próximo componente de opção com primário, secundário e selecione terciário como opções secundárias. Vá para a guia de membrana. Escolha primeiro para o marcador específico da membrana usado.

Ajuste a densidade óptica ou OD da escala real para encontrar um limite mínimo ou um positivo para cada marcador nas membranas celulares. Continuando na guia da membrana, selecione o tamanho máximo da célula. Depois de selecionar todas as opções, selecione segmentar tudo.

Aplique as configurações às imagens e observe-as. Escolha avançar para passar para a etapa de pontuação IHC e escolha uma categoria de tecido para pontuar. Escolha um tipo de pontuação desejado e escolha o compartimento de células a ser usado na análise de pontuação.

Em seguida, selecione exibir dados do componente e mova o cursor sobre as imagens de treinamento para encontrar o limite mínimo de coloração de densidade óptica apropriado para células positivas para os componentes de interesse. Exporte os dados do conjunto de treinamento para testar o algoritmo criado por meio da segmentação de tecidos, segmentação de células e valores de pontuação, siga os prompts para criar uma nova pasta para o diretório de exportação. Selecione imagens e tabelas a serem criadas e incluídas na análise.

Em seguida, execute a análise selecionando exportar para todos. Quando a análise estiver concluída, visualize os dados de segmentação e pontuação de células para imagens com coloração alta e baixa para avaliar a precisão das configurações. Quando estiver satisfeito com as configurações, clique na guia de análise em lote para copiar o algoritmo para o projeto ativo.

Em seguida, escolha um novo diretório de exportação e selecione as imagens e tabelas a serem incluídas na análise. Na opção de arquivos de entrada, escolha todas as imagens a serem incluídas na análise em lote. Selecione a opção de execução para executar a análise.

Quando concluído, avance para a guia de mesclagem de revisão. Selecione incluir tudo e selecione mesclar para criar planilhas de dados com dados resumidos para análise. Foi realizado treinamento nos tecidos da próstata para segmentar as imagens em porções epiteliais e estromais.

Junto com um compartimento sem tecido. Um conjunto de imagens de treinamento foi importado para um software de imagem multiespectral representando tipos de tecido e estados de doença de todo o conjunto de imagens. Categorias de tecidos foram criadas, incluindo estroma, epitélio e não tecidos, e as categorias foram definidas desenhando manualmente em cima das imagens de treinamento.

Um algoritmo para segmentação de tecidos foi criado e aplicado ao conjunto de imagens de treinamento. Segmentando com precisão os tecidos. Usando a técnica de imuno-histoquímica multiplex, células positivas para expressão nuclear de ER-alfa visto como vermelho e AR visto como marrom foram identificadas apesar da sobreposição de sinais métricos e de cor A expressão específica da membrana celular de CD-147 foi quantificada usando E-catherine vista como preta como uma proteína marcadora.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como quantificar a expressão e a co-localização de proteínas, informar e fixar tecidos embebidos em parafina.