Name: A quantificação da expressão da proteína e co-localização Usando multiplexada Imuno-histoquímica Coloração e Multispectral Imagiologia (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 40 s
Description: Aprenda a quantificar expressão proteica e co-localização usando imuno-histoquímica multiplexada e imagiologia multiespectral. Este método elimina a subjetividade do operador, melhorando a reprodutibilidade em pesquisa e diagnóstico patológico.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Os autores agradecem à Universidade de Wisconsin Translational iniciativas de investigação no laboratório de patologia, em parte apoiado pelo Departamento de Patologia e Medicina Laboratorial UW e concessão UWCCC P30 CA014520, para o uso de suas instalações e serviços.

<ol><li>Valdman, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+redox+pathway+enzymes+in+human+prostatic+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Quant+Cytol+Histol%22%5BJournal%5D)">Expression of redox pathway enzymes in human prostatic tissue.</a> Anal Quant Cytol Histol. 31 (6), 367-374 (2009).</li>
<li>Rimm, D. L., Camp, R. L., Charette, L. A., Olsen, D. A., Provost, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amplification+of+tissue+by+construction+of+tissue+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Mol+Pathol%22%5BJournal%5D)">Amplification of tissue by construction of tissue microarrays.</a> Exp Mol Pathol. 70 (3), 255-264 (2001).</li>
<li>Jonmarker, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+PDX-1+in+prostate+cancer%2C+prostatic+intraepithelial+neoplasia+and+benign+prostatic+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22APMIS%22%5BJournal%5D)">Expression of PDX-1 in prostate cancer, prostatic intraepithelial neoplasia and benign prostatic tissue.</a> APMIS. 116 (6), 491-498 (2008).</li>
<li>McCarty, K. S., Miller, L. S., Cox, E. B., Konrath, J., McCarty, K. S. Sr Estrogen receptor analyses. Correlation of biochemical and immunohistochemical methods using monoclonal antireceptor antibodies. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMcCarty%2C+KS+%22Arch+Pathol+Lab+Med%22">Arch Pathol Lab Med</a>. 109 (8), 716-721 (1985).</li>
<li>Volante, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatostatin+receptor+type+2A+immunohistochemistry+in+neuroendocrine+tumors%3A+a+proposal+of+scoring+system+correlated+with+somatostatin+receptor+scintigraphy%5BTitle%5D)+AND+%22Mod+Pathol%22%5BJournal%5D)">Somatostatin receptor type 2A immunohistochemistry in neuroendocrine tumors: a proposal of scoring system correlated with somatostatin receptor scintigraphy.</a> Mod Pathol. 20 (11), 1172-1182 (2007).</li>
<li>Muris, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemical+profiling+of+caspase+signaling+pathways+predicts+clinical+response+to+chemotherapy+in+primary+nodal+diffuse+large+B-cell+lymphomas%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemical profiling of caspase signaling pathways predicts clinical response to chemotherapy in primary nodal diffuse large B-cell lymphomas.</a> Blood. 105 (7), 2916-2923 (2005).</li>
<li>Jaraj, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intra-+and+interobserver+reproducibility+of+interpretation+of+immunohistochemical+stains+of+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Virchows+Arch%22%5BJournal%5D)">Intra- and interobserver reproducibility of interpretation of immunohistochemical stains of prostate cancer.</a> Virchows Arch. 455 (4), 375-381 (2009).</li>
<li>Nakane, P. K., Pierce, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzyme-labeled+antibodies%3A+preparation+and+application+for+the+localization+of+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Enzyme-labeled antibodies: preparation and application for the localization of antigens.</a> J Histochem Cytochem. 14 (12), 929-931 (1966).</li>
<li>Peters, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+tissue+organelles+by+a+combination+of+analytical+subcellular+fractionation+and+enzymic+microanalysis%3A+a+new+approach+to+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Pathol%22%5BJournal%5D)">Investigation of tissue organelles by a combination of analytical subcellular fractionation and enzymic microanalysis: a new approach to pathology.</a> J Clin Pathol. 34 (1), 1-12 (1981).</li>
<li>Emmert-Buck, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+Capture+Microdissection%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Laser Capture Microdissection.</a> Science. 274 (5289), 998-1001 (1996).</li>
<li>Waters, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accuracy+and+precision+in+quantitative+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Accuracy and precision in quantitative fluorescence microscopy.</a> J Cell Biol. 185 (7), 1135-1148 (2009).</li>
<li>Huang, W., Hennrick, K., Drew, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+colorful+future+of+quantitative+pathology%3A+validation+of+Vectra+technology+using+chromogenic+multiplexed+immunohistochemistry+and+prostate+tissue+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Pathol%22%5BJournal%5D)">A colorful future of quantitative pathology: validation of Vectra technology using chromogenic multiplexed immunohistochemistry and prostate tissue microarrays.</a> Hum Pathol. 44 (1), 29-38 (2013).</li>
<li>Rimm, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C-Path%3A+A+Watson-Like+Visit+to+the+Pathology+Lab%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">C-Path: A Watson-Like Visit to the Pathology Lab.</a> Science Translational Medicine. 3 (108), (2011).</li>
<li>Fiore, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utility+of+multispectral+imaging+in+automated+quantitative+scoring+of+immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Pathol%22%5BJournal%5D)">Utility of multispectral imaging in automated quantitative scoring of immunohistochemistry.</a> J Clin Pathol. 65 (6), 496-502 (2012).</li>
<li>Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+immunohistochemistry%2C+imaging%2C+and+quantitation%3A+A+review%2C+with+an+assessment+of+Tyramide+signal+amplification%2C+multispectral+imaging+and+multiplex+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: A review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis.</a> Methods. 70 (1), 46-58 (2014).</li>
<li>Rizzardi, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+comparison+of+immunohistochemical+staining+measured+by+digital+image+analysis+versus+pathologist+visual+scoring%5BTitle%5D)+AND+%22Diagn+Pathol%22%5BJournal%5D)">Quantitative comparison of immunohistochemical staining measured by digital image analysis versus pathologist visual scoring.</a> Diagn Pathol. 7, 42(2012).</li>
<li>Bauman, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+fibrillar+collagens+and+extracellular+matrix+of+glandular+benign+prostatic+hyperplasia+nodules%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Characterization of fibrillar collagens and extracellular matrix of glandular benign prostatic hyperplasia nodules.</a> PLoS One. 9 (10), e109102(2014).</li>
<li>Bauman, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beta-catenin+is+elevated+in+human+benign+prostatic+hyperplasia+specimens+compared+to+histologically+normal+prostate+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Clin+Exp+Urol%22%5BJournal%5D)">Beta-catenin is elevated in human benign prostatic hyperplasia specimens compared to histologically normal prostate tissue.</a> Am J Clin Exp Urol. 2 (4), 313-322 (2014).</li>
<li>Bauman, T. M., Ewald, J. A., Huang, W., Ricke, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD147+expression+predicts+biochemical+recurrence+after+prostatectomy+independent+of+histologic+and+pathologic+features%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">CD147 expression predicts biochemical recurrence after prostatectomy independent of histologic and pathologic features.</a> BMC Cancer. 15 (1), 549(2015).</li>
<li>Bauman, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Finasteride+treatment+alters+tissue+specific+androgen+receptor+expression+in+prostate+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Prostate%22%5BJournal%5D)">Finasteride treatment alters tissue specific androgen receptor expression in prostate tissues.</a> Prostate. 74 (9), 923-932 (2014).</li>
<li>Nicholson, T. M., Sehgal, P. D., Drew, S. A., Huang, W., Ricke, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex+steroid+receptor+expression+and+localization+in+benign+prostatic+hyperplasia+varies+with+tissue+compartment%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Sex steroid receptor expression and localization in benign prostatic hyperplasia varies with tissue compartment.</a> Differentiation. 85 (4-5), 140-149 (2013).</li>
<li>Taylor, C. R., Levenson, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+immunohistochemistry--issues+concerning+methods%2C+utility+and+semiquantitative+assessment+II%5BTitle%5D)+AND+%22Histopathology%22%5BJournal%5D)">Quantification of immunohistochemistry--issues concerning methods, utility and semiquantitative assessment II.</a> Histopathology. 49 (4), 411-424 (2006).</li>
<li>Matos, L. L., Trufelli, D. C., de Matos, M. G., da Silva Pinhal, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemistry+as+an+important+tool+in+biomarkers+detection+and+clinical+practice%5BTitle%5D)+AND+%22Biomark+Insights%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemistry as an important tool in biomarkers detection and clinical practice.</a> Biomark Insights. 5, 9-20 (2010).</li>
<li>Kononen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+microarrays+for+high-throughput+molecular+profiling+of+tumor+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Tissue microarrays for high-throughput molecular profiling of tumor specimens.</a> Nat Med. 4 (7), 844-847 (1998).</li>
<li>Ong, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computer-assisted+pathological+immunohistochemistry+scoring+is+more+time-effective+than+conventional+scoring%2C+but+provides+no+analytical+advantage%5BTitle%5D)+AND+%22Histopathology%22%5BJournal%5D)">Computer-assisted pathological immunohistochemistry scoring is more time-effective than conventional scoring, but provides no analytical advantage.</a> Histopathology. 56 (4), 523-529 (2010).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

A utilização de imuno-histoquímica tradicional para avaliar a expressão de proteínas é limitado por métodos subjectivos, semi-quantitativos de análise 22,23. plataformas de avanço de ter sido criado por análise de alto rendimento de expressão de biomarcadores e localização. segmentação detalhada de ambos os tecidos e compartimentos subcelulares permite aos usuários estudar a expressão de biomarcadores, localização e co-localização com outros marcadores de interesse. Em estudos anteriores, que demonstraram a u...

<html> A imuno-histoquímica (IHQ) é uma técnica de laboratório padrão para a detecção de proteína dentro do tecido, e IHC ainda é largamente utilizado tanto em pesquisa e de diagnóstico da patologia. A avaliação da coloração IHC é frequentemente semi-quantitativa, a introdução de potencial de polarização para interpretação dos resultados. Muitas abordagens semi-quantitativos foram desenvolvidos que incorporam tanto a intensidade da coloração e medida coloração em diagnóstico final 1-4. Outros sistemas incluem intensidade de pontuação e localização subcelular, a fim de melhor localizar a expressão 5. Incorporação de pontuações médias de vários espectadores é frequentemente utilizada, a fim de minimizar os efeitos da polarização único espectador 6. Apesar destes esforços, a subjetividade na análise ainda permanece, particularmente quando se avalia o grau de coloração 7. padronização do protocolo e minimizando a subjetividade da entrada humana é fundamental para a criação, resultados IHC reprodutíveis precisos. conteúdo &quot;&gt; Há outras opções além de IHQ para determinar a expressão de proteínas no interior de tecidos. Dentro do contexto de investigação, a imunohistoquímica tem sido tradicionalmente considerado como um meio para analisar localização da proteína 8, enquanto que outras técnicas, tais como imunotransferência são vistos como padrão de ouro para investigar a expressão da proteína . tecido Determinar ou expressão específica do compartimento da célula é difícil sem incorporar técnicas avançadas, como fracionamento celular ou captura a laser microdissecção 9,10. O uso de anticorpos fluorescentes em lâminas de tecido oferece um compromisso razoável, mas o fundo autofluorescência devido à NADPH, lipofuscins, reticular fibras, colágeno e elastina pode fazer uma quantificação precisa difícil 11. Plataformas de patologia computacionais automatizados são uma direção promissora para a quantificação mais objetiva da coloração patologia 12-15. Combinando imagens multiespectrais com microarrays de tecidofacilita a análise de alto rendimento de expressão da proteína em grandes tamanhos de amostra. Com estas técnicas, a análise de co-localização de proteínas, a heterogeneidade coloração e tecidos e localização subcelular é possível, reduzindo substancialmente os preconceitos e tempo necessário para análise inerentes, ao retornar dados de uma contínua em vez de formato categórica 16. Por conseguinte, o objectivo do presente estudo foi demonstrar a utilidade da metodologia e imuno-histoquímica para a realização de análises com multiplexado, utilizando software de imagem multi-espectral. Este protocolo é escrito para coloração imuno-histoquímica manual, o multiplex de uma única secção de tecido de slides com quatro anticorpos monoclonais otimizados. Como uma experiência representativa, de coelho anti-alfa nuclear do receptor de estrogénio (RctE) e o receptor de androgénio (AR) são multiplexados com anti-rato de CD147 ligado à membrana e ligada à membrana anti-ratinho de E-caderina. Qualquer anticorpo de escolha pode ser Substituted para os anticorpos aqui listadas, mas cada combinação de anticorpos requer otimização separada. Pré-tratamento para todos os anticorpos têm de ser idênticos. Os anticorpos de AR e CD147 deve ser optimizado individualmente e, em seguida, como um cocktail. Cada anticorpo é detectado usando um sistema de polímero livre de biotina e um de 4 cromogénios exclusivos.

<table><tbody><tr><td>Xileno</td><td>Fisher Chemical</td><td>X3F1GAL</td><td>Classificação NFPA: Saúde &ndash; 2, Fogo &ndash; 3 , Reatividade &ndash; 0</td></tr><tr><td>Álcool Etílico-200 à prova Fisher</td><td>Scientific</td><td>4355223</td><td>Classificação NFPA: Saúde &ndash; 0, Fogo &ndash; 3 , Reatividade &ndash; 0</td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-500</td><td>Classificação NFPA: Saúde &ndash; 2, Fogo &ndash; 0 , Reatividade &ndash; 0</td></tr><tr><td>Tris Hidroximetil aminometano HCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP153-1</td><td>Classificação NFPA: Saúde &ndash; 2, Fogo &ndash; 0 Reatividade &ndash; 0</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Chem-Impex</td><td>1512</td><td>Classificação NFPA: Saúde &ndash; 0, Fogo &ndash; 1 , Reatividade &ndash; 0</td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2944-100</td><td>Classificação NFPA: Saúde &ndash; 1, Fogo - 0 , Reatividade &ndash; 0</td></tr><tr><td>Peroxidazed</td><td>Biocare Medical</td><td>PX968</td><td>Evite o contato com a pele e os olhos. Pode causar irritação na pele e danos aos olhos.</td></tr><tr><td>Receptor de estrogênio alfa</td><td>Thermo Fisher Scientific-Labvision</td><td>RM9101</td><td>Não classificado como perigoso</td></tr><tr><td>Receptor de andrógeno</td><td>SCBT</td><td>sc-816</td><td>Não classificado como perigoso</td></tr><tr><td>CD147</td><td>Biodesign</td><td>P87535M</td><td>Não classificado como perigoso</td></tr><tr><td>E-caderina</td><td>Dako</td><td>M3612</td><td>Não classificado como perigoso</td></tr><tr><td>Renoir Red Andibody Diluent</td><td>Biocare Medical</td><td>PD904</td><td>É especialmente projetado para trabalhar com anticorpos baseados em Tris</td></tr> Câmara <tr><td>de Decamuflagem&nbsp;</td><td>Biocare Medical</td><td>Modelo DC2002</td><td>Tome as precauções normais ao usar uma panela de pressão</td></tr><tr><td>Caneta barreira-Immuno Edge&nbsp;</td><td>Vector Labs</td><td>H-4000</td><td></td></tr><tr><td>Kit de Desnaturação - Etapa de eluição</td><td>Biocare</td><td>Medical DNS001H</td><td>Não classificado como perigoso</td></tr><tr><td>Mach 2 Cabra anti-Coelho HRP Polímero</td><td>Biocare Medical</td><td>RHRP520</td><td>Não classificado como perigoso</td></tr><tr><td>Mach 2 Cabra anti-Coelho AP Polímero</td><td>Biocare Medical</td><td>RALP525</td><td>Não classificado como perigoso</td></tr><tr><td>Mach 2 Cabra anti-Mouse HRP Polímero</td><td>Biocare Medical</td><td>M3M530</td><td>Não classificado como perigoso</td></tr><tr><td>Kit de cromogênio Betazoid DAB</td><td>Biocare Medical</td><td>BDB2004</td><td>1. Sabe-se que o BAD é suspeito de ser cancerígeno. 2. Não exponha os componentes DAB à luz forte ou luz solar direta. 3. Use equipamentos e roupas de proteção individual adequados. 4. O DAB pode causar sensibilização da pele. Evite o contato com a pele e os olhos. 5. Observe todos os ambientes federais, estaduais e locais em relação ao descarte</td></tr><tr><td>Warp Red Chromogen Kit</td><td>Biocare Medical</td><td>WR806</td><td>Corrosivo. Ácido que pode causar irritação na pele ou danos aos olhos.&nbsp;</td></tr><tr><td>Kit de Cromogênio Verde Vina</td><td>Biocare Medical</td><td>BRR807</td><td>Nocivo se ingerido</td></tr><tr><td>Kit de Cromogênio Roxo Bajoriano</td><td>Biocare Medical</td><td>BJP807</td><td>Líquido inflamável. Mantenha longe do calor, chamas e faíscas. Nocivo por ingestão ou absorção. Evite o contato com a pele ou os olhos e evite a inalação.</td></tr><tr><td>Hematoxilina para Gatos</td><td>Biocare Medical</td><td>CATHE</td><td>Roxo &nbsp; solução &nbsp; com &nbsp; a &nbsp; leve &nbsp; acético &nbsp; ácido &nbsp; (vinagre) &nbsp; perfume. &nbsp; Maio &nbsp; be &nbsp; irritante &nbsp; para &nbsp; pele &nbsp; ou &nbsp; olho. &nbsp; Evite &nbsp; Contato &nbsp; com &nbsp; pele &nbsp; e &nbsp; olho. &nbsp; Evite &nbsp; ingestão.</td></tr><tr><td>Mídia de Montagem XYL</td><td>Richard Allen</td><td>8312-4</td><td>Classificação NFPA: Saúde &ndash; 2, Fogo &ndash; 3 , Reatividade &ndash;</td></tr><tr><td>0 1.5 Lamínulas</td><td>Marca Fisher</td><td>22266858</td><td>Bordas afiadas</td></tr><tr><td>Incubação (Umidade)Câmara</td><td>obsoleta</td><td>obsoleto</td><td>Vários fornecedores disponíveis</td></tr><tr><td>Forno de Convecção</td><td>Estável- Therm</td><td>C-4008-Q</td><td></td></tr><tr><td>Fundo Reagente de Bloqueio Punisher</td><td>Biocare Medical</td><td>BP974</td><td>Este produto não é classificado como perigoso.&nbsp;</td></tr><tr><td>Software inForm</td><td>PerkinElmer</td><td>CLS135781</td><td>Software de imagem multiespectral primário usado no manuscrito</td></tr><tr><td>Software Nuance</td><td>PerkinElmer</td><td>Nuance EX</td><td>Software usado para fazer bibliotecas espectrais dentro do manuscrito</td></tr><tr><td>Microscópio Vectra e scanner de lâminas</td><td>PerkinElmer</td><td>VECTRA</td><td>Scanner de lâminas automatizado e microscópio para obtenção de cubos de imagem IM3</td></tr></tbody></table>

a quantificação da expressão da proteína e co-localização usando multiplexada imuno-histoquímica coloração e multispectral imagiologia

Quantitation of Protein Expression and Co-localization Using Multiplexed Immuno-histochemical Staining and Multispectral Imaging

A imuno-histoquímica é uma técnica de detecção clínica e laboratorial comumente usada para investigar a expressão e localização de proteínas nos tecidos. Muitos sistemas semiquantitativos foram desenvolvidos para pontuar a expressão usando imuno-histoquímica, mas a subjetividade inerente limita a reprodutibilidade e a precisão dos resultados. Além disso, a investigação de biomarcadores espacialmente sobrepostos, como fatores de transcrição nuclear, é difícil com as técnicas atuais de imuno-histoquímica. Desenvolvemos e otimizamos um sistema para investigação simultânea de múltiplas proteínas usando métodos de alto rendimento de imuno-histoquímica multiplexada e imagem multiespectral. A imuno-histoquímica multiplexada é realizada pela aplicação sequencial de anticorpos primários com anticorpos secundários conjugados à peroxidase de rábano ou fosfatase alcalina. Diferentes cromógenos são usados para detectar cada proteína de interesse. As lâminas coradas são carregadas em um scanner de lâminas automatizado e um protocolo é criado para aquisição automatizada de imagens. Uma biblioteca espectral é criada colorindo um conjunto de lâminas com um único cromógeno em cada uma. Um subconjunto de imagens coradas representativas é importado para o software de imagem multiespectral e um algoritmo para distinguir o tipo de tecido é criado definindo compartimentos de tecido nas imagens. Os compartimentos subcelulares são segmentados usando a contracoloração de hematoxilina e ajustando o algoritmo intrínseco. O limiar é aplicado para determinar a positividade e a co-localização de proteínas. O algoritmo final é então aplicado a todo o conjunto de tecidos. Os dados resultantes permitem ao usuário avaliar a expressão de proteínas com base no tipo de tecido (por exemplo, epitélio vs. estroma) e compartimento subcelular (núcleo vs. citoplasma vs. membrana plasmática). A análise de co-localização permite a investigação de tipos de células duplamente positivas, duplamente negativas e uni-positivas. A combinação de imagens multiespectrais com imuno-histoquímica multiplexada e aquisição automatizada de imagens é um método objetivo e de alto rendimento para investigação de biomarcadores dentro dos tecidos.

Na Figura 1, a formação é realizada sobre os tecidos da próstata para segmentar imagens em porções epiteliais e do estroma, juntamente com o compartimento de não-tecido. Ao utilizar o marcador de membrana de E-caderina epitelial, a segmentação de células foi realizada para separar o núcleo, citoplasma, e porções de membrana, apresentados na Figura 2. Numa experiência, foi utilizado multiplexad...

A imuno-histoquímica é uma poderosa técnica de laboratório para avaliar a localização e expressão de proteínas nos tecidos. Os métodos semiautomatizados atuais de quantificação introduzem subjetividade e muitas vezes criam resultados irreproduzíveis. Aqui, descrevemos métodos para imuno-histoquímica multiplexada e quantificação objetiva da expressão e co-localização de proteínas usando imagens multiespectrais.

A quantificação da expressão da proteína e co-localização Usando multiplexada Imuno-histoquímica Coloração e Multispectral Imagiologia

Immunohistochemistry is a commonly used clinical and research lab detection technique for investigating protein expression and localization within ...

O objetivo geral deste método é quantificar de forma objetiva a expressão proteica e a co-localização utilizando imagem multiespectral. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais nas áreas de pesquisa básica e patologia diagnóstica, como as alterações na expressão e na localização de proteínas após tratamento ou durante a progressão de doenças. A principal vantagem desta técnica é que ela elimina a subjetividade do operador inerente aos métodos tradicionais de quantificação.Para iniciar o processo de quantificação, abra o software de imagem multiespectral para criar uma biblioteca espectral a partir de lâminas-controle previamente preparadas coradas com cromógenos individuais e a lâmina corada com hematoxilina. Em seguida, abra um cubo de imagem adquirido de uma lâmina-controle e selecione quatro a cinco áreas positivamente coradas para definir opticamente o cromógeno. Repita os passos com cubos de imagem de outras lâminas-controle até que uma biblioteca espectral completa, representando todos os cromógenos, seja criada, e então salve a biblioteca espectral.Inicie um novo projeto no software de imagem multiespectral selecionando Multispectral ou im3 como opção de fo

quantitation-protein-expression-co-localization-using-multiplexed

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Massas de tecido complexos, a partir de órgãos de tumores, são compostas de vários elementos celulares. Nós elucidada a contribuição de fenótipos celulares dentro de um tecido utilizando ratinhos transgénicos fluorescentes multi-marcados em combinação com coloração de imunofluorescência multiparamï seguido de separação espectral para decifrar origem celular, bem como características de células com base na expressão da proteína.

Análise Quantitativa Multispectral Após transplante de tecido fluorescente para visualização das Origens celulares, Tipos e Interações

Um protocolo detalhado para um painel de seis-marcador multiplex imunofluorescência é otimizado e executado, usando um corante automatizado para resultados mais consistentes e um menor tempo de procedimento. Esta abordagem pode ser adaptada directamente por qualquer laboratório de estudos imuno-oncologia.

Painel de imunofluorescência Multiplex automatizada para estudos imuno-oncologia em amostras de Carcinoma fixada em formol

Aqui descrevemos um protocolo para multiplex immunohistochemical fluorescente de coloração e de imagem para localização simultânea de múltiplos antígenos associada a câncer de linfoma. Este protocolo pode ser estendido para a análise de colocalization de biomarcadores dentro de todas as secções de tecido.

Coloração imuno-histoquímica fluorescente multiplexada, imagem e análise de amostras histológicas de linfoma

Aqui, descrevemos uma estratégia simples e acessível para visualizar, quantificar e mapear células imunes em seções de tecido tumoral parafina fixada em formalina. Essa metodologia combina técnicas de imagem e análise digital existentes com o objetivo de ampliar a capacidade de multiplexação e a análise multiparâmetro de ensaios de imagem.

Visualização, Quantificação e Mapeamento de Populações de Células Imunes no Microambiente tumoral

Descrevemos um método de coloração rápida para realizar imagens multiespectrais em tecidos congelados.

Um método rápido para imagem de fluorescência multiespectral de seções de tecido congelado

A análise de imagens multiplexadas com código de barras tem melhorado recentemente a caracterização do microambiente tumoral, permitindo estudos abrangentes da composição celular, estado funcional e interações célula-célula. Neste artigo, descrevemos um protocolo de coloração e imagem usando o código de barras de anticorpos conjugados a oligonucleotídeos e imagens cíclicas, que permite o uso de uma técnica de análise de imagens de alta dimensão.

Análise de Imagem de Código de Barras Multiplexado para Caracterização de Imunoprofiling e Mapeamento Espacial na Análise Unicelular de Amostras de Parafina

Neste artigo, um protocolo para amplificação manual do sinal de tiramida (TSA) por imunofluorescência multiplex (mIF) combinado com análise de imagem e análise espacial é descrito. Este protocolo pode ser usado com cortes fixados em formalina e embebidos em parafina (FFPE) para a coloração de dois a seis antígenos por lâmina, dependendo do scanner de lâminas disponível no laboratório.

Imunofluorescência Multiplex Combinada com Análise Espacial de Imagens para Avaliação Clínica e Biológica do Microambiente Tumoral

Este protocolo experimental descreve e otimiza um método de coloração por imunoistoquímica multiplex (IHQ), principalmente otimizando as condições de incubação de anticorpos de canal único e ajustando as configurações de anticorpos e canais para resolver os problemas de autofluorescência e crosstalk de canais em tecidos de câncer de pulmão de origem clínica.

Coloração por imunohistoquímica multiplex para tecido de câncer de pulmão embebido em parafina

Este relatório descreve um protocolo automatizado para ensaios de imunofluorescência multiplex (mIF) em um corador de lâmina automatizado. Ele demonstra a alta reprodutibilidade da proteômica espacial em autocorantes de tecido padrão de alto rendimento e imageadores de fluorescência de lâmina inteira, o que é ideal para ensaios mIF personalizados em um grande número de lâminas de tecido em pesquisa translacional.

Ensaios automatizados de imunofluorescência multiplex de alto rendimento para pesquisa translacional

Este protocolo detalha uma metodologia para detecção de mRNA multiplex com citometria de massa de imagem de proteína em seções de tecido embebidas em parafina fixada em formalina.

Cartografia Molecular de Modalidade Dupla: Integrando a Detecção de RNA Multiplex com a Citometria de Massa por Imagem de Proteínas

Aprenda a quantificar expressão proteica e co-localização usando imuno-histoquímica multiplexada e imagiologia multiespectral. Este método elimina a subjetividade do operador, melhorando a reprodutibilidade em pesquisa e diagnóstico patológico.

A quantificação da expressão da proteína e co-localização Usando multiplexada Imuno-histoquímica Coloração e Multispectral Imagiologia (Vídeo) | JoVE Journal

A quantificação da expressão da proteína e co-localização Usando multiplexada Imuno-histoquímica Coloração e Multispectral Imagiologia

Explorar mais vídeos