Name: A Miniaturized Glycan Microarray Ensaio para a Avaliação de avidez e especificidade do Hemaglutininas vírus da gripe A (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 32 s
Description: Aprenda a usar microarranjo de glicanos miniaturizado para avaliar avidez e especificidade de hemaglutininas do vírus influenza A. Este método permite analisar ligação a receptores e avidez simultaneamente em ensaio único.

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Este trabalho foi apoiado em parte pela facilidade Scripps Microarray Core, e um contrato a partir dos Centros de Controle de Doenças (JCP). RPdV é um beneficiário de uma doação Rubicon e VENI da Organização Holandesa para Pesquisa Científica (NWO). O Consórcio para Glycomics Funcionais (http://www.functionalglycomics.org/) financiado pela concessão NIGMS GM62116 (JCP) forneceu vários glicanos utilizados neste estudo. Esta é a publicação 29113 do The Scripps Research Institute.

NOTA: Todos os passos são realizados à temperatura ambiente a menos que indicado de outra forma. 1. Disposição Construção <ol><li> Glicanos Preparação e configuração da placa <ol><li> Prepare um estoque de tampão impressão. Em primeiro lugar fazer 500 ml de uma solução de estoque de 150 mM de fosfato de sódio dibásico. Também fazem 50 ml de uma solução de estoque de 150 mM de solução de fosfato de sódio monobásico. Num balão, utilizando uma barra de agitação magnética e um medidor de pH, lentamente titule a solução de fosfato de sódio dibásico com a solução monobásico até um pH de 8,5 seja alcançado. Adicionar Tween-20 a 0,005%. </li><li> Prepare as amostras de glicano. Diluir PAA glicanos conjugados, (diLacNAc (Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ-PAA), 3SLNLN (Neu5Acα2-3Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ-PAA) e 6SLNLN (Neu5Acα2-6Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ-PAA (Figura 1A )) são para ser diluída para 100 ug / ml em tampão de impressão. step1.1.1 monovalentes glicanos,diLacNAc (Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ- (CH 2) 3 NH 2, 3SLNLN (Neu5Acα2-3Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ - (CH 2) 3 NH 2) e 6SLNLN (Neu5Acα2-6Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1- 4GlcNAcβ - (CH 2) 3 NH 2)) para 100 uM em tampão de impressão a partir do passo 1.1.1. Finalmente, preparar as tinturas funcionalizado com amina, para usar como marcadores de grade / luzes de pouso. manchas de marcador corante são impressos em 1? M. NOTA: Atto488-NHS corante é usado em nossas impressões. No entanto, qualquer corante funcionalizado com amina, legível pelo scanner de slides é apropriado para esta finalidade. </li><li> Transferir 10 uL de cada amostra de glicano para placas de microtitulação de 384 poços, utilizados para o robô de impressão. Armazene glicanos não utilizados em solução tampão de impressão a -20 ° C em tubos selados. Tansfer 10 uL do marcador de corante para a placa de impressão. </li></ol></li><li> Impressão NOTA: Todos steps que a preocupação de tocar ou mover os slides devem ser feitas com luvas. <ol><li> Coloque arrayer pins na cabeça de impressão de acordo com a configuração correta do layout. Para este layout usar um pin para imprimir todas as amostras e matrizes. Imprimir os glicanos em blocos de seis, saltando um recurso (uma característica é definida como único local de um determinado composto), de cada lado, de tal modo que os pontos de uma mesma amostra não são impressos exactamente ao lado do outro. NOTA: O usuário final deve decidir a configuração. </li><li> Retirar as lâminas de sacos, caixas abertas, e remover quaisquer partículas de poeira ou pequenos pedaços de plástico que podem ser em suas superfícies por gás nitrogénio ultra-alta pureza em cada slide. Coloque o número desejado de slides, o lado revestido para cima, no palco arrayer. </li><li> Programa do arrayer, usar os parâmetros de 27 pontos por visita para a placa de fonte, usando 3 &quot;pré-spots&quot; em lâminas revestidas com poli-L-lisina, para remover o excesso de líquido na ponta dos pinos de impressão <ol><li> Ligue MPU (Unidade de Alimentação Principal) e Unidade de Controle do Clima. O software de análise Tiling aberto no computador. </li><li> Escolha um layout para a impressão. Selecione Opções → Ferramenta Pin para ser usado para imprimir a matriz 1 x 1 ferramenta de impressão - 1 único pino. Selecione a guia de destino → Matriz Ferramenta Definição → Print Pattern e adicione o pitch (ponto-a-ponto à distância), o número de linhas e colunas para acomodar as amostras a ser impresso, e o padrão de impressão das amostras (para essa matriz de 8 x 8 padrão de impressão é usado em 340 relvado mm para 7 amostras totais). </li><li> Selecione Alvo → Layout de slide e programar a distância de bloco-a-bloco para permitir a impressão de cada matriz replicar para o modelo de slide de 48 poços (4 x 12). Selecione Fonte e adicione o número de captadores de origem (1 para cada amostra quando se usa um pin) (para esta cópia 7 captadores de origem será usado para acomodar 6 poços de amostra e um marcador de corante bem). NOTA: O diálogo fonte deve ficar verde para mostrar que o númerodas visitas de origem coincide com as amostras a serem impressas no padrão de impressão. </li><li> Selecione Alvo → Adaptador de Placa e Layout de slides e ajustar o número de slides (5 slides são impressos em uma hora para esta cópia com 1 slide pré-manchas). </li><li> Solte a bandeja clicando no botão T1 para ativar a bandeja e adicionar o número desejado de lâminas para a bandeja, prestando muita atenção aos locais de slide pré-spotting (azul) e lâminas &quot;reais&quot;. </li><li> Coloque lâminas de vidro lisos em todas as portas de vácuo restantes para bloquear a vácuo e clique em OK para ativar o vácuo. Verifique se todos os slides são mantidos no lugar e clique em OK para retornar a bandeja para a posição inicial. </li><li> Coloque a chapa de impressão no suporte da placa e garantir a cremalheira está definido corretamente no lugar. Clique GO e permitir que o processo de impressão para continuar. </li></ol></li><li> Imprimir os restantes 24 pontos em repetições de 6 pontos por matriz (4 matrizes / visit Fonte). </li><li> Carregar as placas de 384 poçosna impressora e começar a imprimir. Manter a humidade relativa, durante a impressão, em toda a impressão entre 55 e 65%. A impressora pára após a impressão 5 slides. NOTA: Enquanto o microarray neste ensaio é impresso em um 8 x 8 padrão específico, os robôs impressão microarray diferentes exigirá equipamento de programação específica para atingir o layout desejado. Cabe ao usuário final para determinar o padrão mais adequado tendo em conta as especificações dos seus equipamentos. </li></ol></li><li> Umidificação / Imobilização NOTA: Uma vez que as lâminas de terminar a impressão, eles passam por uma etapa de imobilização temporária, também chamado de umidificação. Umidificação pós-impressão ajuda a homogeneizar o anexo amostra por re-molhar as manchas e garantir bloqueio completo. <ol><li> Colocar as lâminas em uma câmara de humidade a 100% imediatamente após a impressão durante um período de 30 min. Construir a câmara de colocação por toalhas de papel molhado muito plana no fundo de um prato de vidro grande, colocando os diapositivosem algum tipo de rack, tal como um suporte de tubos de ensaio, de impressão voltada para cima, e selagem com filme plástico para prender a umidade. </li><li> Número desliza com um / pen álcool resistentes a solventes marcação e armazenar em uma caixa de dessecação. Desidratar durante a noite. </li></ol></li><li> Numeração, bloqueio e armazenamento <ol><li> Prepara-se o tampão de bloqueio - etanolamina 50 mM em 50 mM de tampão de borato. Primeiro, dissolver o ácido bórico, em ddH2O, a uma concentração final de 50 mM num frasco contendo uma barra de agitação magnética. Agita-se a solução vigorosamente numa placa de agitação até todo o sólido se ter dissolvido. Enquanto agitação constante, adicionar a quantidade apropriada de etanolamina a partir de uma solução estoque de 16,54 H até atingir a concentração de 50 mM desejado. Adiciona-se hidróxido de sódio concentrado para ajustar para um pH final de 9,2. </li><li> Mergulhar os slides impressos na solução tampão de bloqueio durante 1 h. </li><li> Seguindo 1 hora, lavar as lâminas em ddH2O para remover qualquer vestígio de excesso de tampão de bloqueio.Descarte tampão de bloqueio em um recipiente adequado de lixo. </li><li> Transferir as lâminas para suportes de vidro para coloração e spin seco. matrizes secas, colocando-os numa centrífuga equipada com suportes de placa oscilante, a uma velocidade de 10 xg durante 5 min. </li><li> Uma vez que as lâminas são secas, elas podem ser incubadas imediatamente ou armazenado. condições de armazenamento: -20 ° C em um saco plástico selado. </li></ol></li></ol> 2. Analisando glicano Proteínas de Ligação <ol><li> Preparar uma câmara umidificado em que as matrizes para ser hibridizado vai caber. Uma câmara simples consiste em um pirex, mergulhado no fundo com toalhas de papel umedecido e um rack, sobre a qual os slides vai descansar. </li><li> Use lectinas biotiniladas SNA (Sambuca nigra aglutinina) e CEA (Erythrina aglutinina cristagalli) a 10 ug / ml + 2 ug / ml de estreptavidina-555 de corante, em sondagem de tampão (PBS + 0,01% Tween-20). Para HA (A / Vietnam / 1203-1204 H5N1 e A / KY / 07 H1N1, neste exemplo), o usouma concentração de partida de 20? g / ml pré-complexada, como previamente descrito 34. Resumidamente, fazer uma HA: Rato-α-Strep: mistura cabra-α-murganho Alexa647 em tampão de bloqueio (PBS + BSA a 3% + 0,01% de Tween-20), numa proporção de 4: molar de 1: 2. NOTA: O array é sondado com lectinas para verificar que glicanos são imobilizados e detectável (Figura 1B). </li><li> Transferir a solução de proteína-anticorpo de ligação de glicano mistura de 20 ul de uma placa de 384 poços e incubar em gelo durante 30 min. Seriadamente diluídas amostras de lectina e HA 1: 1, na sua tampão apropriado, 8 vezes, por mistura de 10 ul de amostra com 10 ul de tampão. </li><li> Pipeta 8 ul da amostra para a superfície de micro-poços e incubar na câmara de humidificação selada (100% de HR) durante 90 min. </li><li> Lavam-se as lâminas de um de cada vez, mantendo as bordas e mergulhando-os quatro vezes em uma mistura de PBS e Tween a 0,05%, em seguida, quatro vezes em PBS, e, finalmente, quatro vezes em H 2 O. desionizada utilizaçãoo mesmo protocolo de secagem descrito no passo de bloqueio, as matrizes girar secar numa centrífuga durante 5 min a 10 x g. </li></ol> 3. Análises de digitalização e de dados NOTA: Os microarrays de glicano podem ser digitalizados em configurações diferentes, dependendo do fabricante do scanner microarray. Ao variar a potência do laser e da resolução, o instrumento pode produzir uma imagem com tantos sinais quanto possível dentro de sua faixa dinâmica (Figura 1C). <ol><li> Use um scanner de slides fluorescente e digitalizar as matrizes imediatamente após a incubação com as proteínas de ligação de glicano. Tome cuidado para garantir a lâmina está correctamente inserida no instrumento de varredura. <ol><li> software de digitalização aberta. Clique em Iniciar para abrir o programa. Conectar-se a scanner: Scanner → Connect ou botão verde no menu do painel de navegação Scanner. </li><li> porta autoloader aberta do scanner. Colocar as lâminas em ranhuras no carregador automático, a fim específico. Feche a porta carregador automático. Click &quot;ler loader&quot; no painel Ferramentas de navegação para detectar automaticamente os slides no scanner. </li><li> Ajuste o parâmetro de verificação: parâmetros Scanner → digitalização apropriadas para o experimento (por exemplo, 635 potência do laser de alta, o ganho de detecção de 50%). Digitalizar slides: Scanner → digitalização. Selecione caminho, criando uma pasta para guardar as imagens de varredura e nome scans individuais. Faça isso antes da digitalização real. Repita para cada slide individual. Clique em OK para iniciar a digitalização. </li></ol></li><li> Use o software do scanner para configurar o instrumento e digitalizar os slides. Definir scanner para digitalizar de forma iterativa em baixa potência laser (5 mW) com o aumento ajustes de ganho de 25%, 50% e 75%. NOTA: As configurações podem ser testadas e otimizadas, mas tenha em mente que cada varredura pode eventualmente diminuir a saída de fluorescência dos corantes devido à fotodegradação. <ol><li> aquisição de dados aberto e software de análise, tais como software Mapix. Clique em Iniciar para abrir o programa. Abrir varredura imagem: Arquivo → im abertoidade. Abrir arquivo GAL: Analisar → grade aberta e selecione o arquivo GAL apropriado. </li><li> Entre no modo de blocos: Modo de imagem → blocos para mover o grid. Use os marcadores de grade para definir a rede para o local apropriado no slide. Ajustar os blocos individuais conforme necessário para coincidir com a matriz impressa. </li><li> Entre no modo de pontos: Imagem → Modo de pontos para ajustar localização eo tamanho de pontos individuais dentro do bloco. Uma vez que todos os blocos e os pontos são ajustados e no lugar, intensidades de sinal medida pelo Analisar cálculos fotométricos →. Salve o arquivo de saída. </li></ol></li><li> Uma vez que os slides a digitalização é concluída, as imagens são analisadas para sinais de ligação com o programa de processamento de imagem instalado (Figura 1D - G). Para análise de imagem, carregar um arquivo GAL (Lista Array) sobre a imagem TIFF digitalizada. NOTA: O arquivo GAL contém o padrão de layout de local e as identidades de cada local local. arquivos GAL para matrizes são created pelo software da impressora usando um arquivo de texto delimitado por guia que contém a identidade das amostras e sua localização na placa de fonte de 384 poços. </li><li> Use a grade luzes marcador / desembarque impressas nas microarrays para colocar adequadamente a grade GAL. pontos individuais podem precisar de ser movido de forma individual, mas uma matriz bem impresso será geralmente permitir que os blocos dentro da grade para ser colocado com facilidade. Após a colocação do grid, recolher intensidades local pelo software e salva como um arquivo de texto delimitado por tabulação (.txt). <ol><li> Usando programa de planilha, abra o arquivo a partir do scanner de saída. Abra o arquivo de macro apropriado a partir da localização da pasta. Clique em Exibir → Macro → RunMacro. NOTA: A pré-escrito irá copiar os dados de saída matérias, remover linhas e colunas desnecessárias, classificar os dados por amostra, calcular os valores médios média de fundo menos sinal e traçar os valores resultantes para uma planilha do spread-folha que contém os gráficos para cada dos seis SAMPles testado na matriz. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Tumpey, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+two-amino+acid+change+in+the+hemagglutinin+of+the+1918+influenza+virus+abolishes+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A two-amino acid change in the hemagglutinin of the 1918 influenza virus abolishes transmission.</a> Science. 315 (5812), 655-659 (2007).</li>
<li>Xu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+balance+of+the+hemagglutinin+and+neuraminidase+activities+accompanies+the+emergence+of+the+2009+H1N1+influenza+pandemic%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Functional balance of the hemagglutinin and neuraminidase activities accompanies the emergence of the 2009 H1N1 influenza pandemic.</a> J Virol. 86 (17), 9221-9232 (2012).</li>
<li>Bouvier, N. M., Palese, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biology+of+influenza+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">The biology of influenza viruses.</a> Vaccine. 26, Suppl 4. D49-D53 (2008).</li>
<li>Freidl, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influenza+at+the+animal-human+interface%3A+a+review+of+the+literature+for+virological+evidence+of+human+infection+with+swine+or+avian+influenza+viruses+other+than+A%28H5N1%29%5BTitle%5D)+AND+%22Euro+Surveill%22%5BJournal%5D)">Influenza at the animal-human interface: a review of the literature for virological evidence of human infection with swine or avian influenza viruses other than A(H5N1).</a> Euro Surveill. 19 (18), (2014).</li>
<li>Xu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preferential+recognition+of+avian-like+receptors+in+human+influenza+A+H7N9+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Preferential recognition of avian-like receptors in human influenza A H7N9 viruses.</a> Science. 342 (6163), 1230-1235 (2013).</li>
<li>Paulson, J. C., de Vries, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H5N1+receptor+specificity+as+a+factor+in+pandemic+risk%5BTitle%5D)+AND+%22Virus+Res%22%5BJournal%5D)">H5N1 receptor specificity as a factor in pandemic risk.</a> Virus Res. 178 (1), 99-113 (2013).</li>
<li>Tzarum, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+receptor+binding+of+the+hemagglutinin+from+a+human+H6N1+influenza+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Structure and receptor binding of the hemagglutinin from a human H6N1 influenza virus.</a> Cell Host Microbe. 17 (3), 369-376 (2015).</li>
<li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Human-Infecting+H10N8+Influenza+Virus+Retains+a+Strong+Preference+for+Avian-type+Receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">A Human-Infecting H10N8 Influenza Virus Retains a Strong Preference for Avian-type Receptors.</a> Cell Host Microbe. 17 (3), 377-384 (2015).</li>
<li>Carroll, S. M., Higa, H. H., Paulson, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+cell-surface+receptor+determinants+of+antigenically+similar+influenza+virus+hemagglutinins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Different cell-surface receptor determinants of antigenically similar influenza virus hemagglutinins.</a> J Biol Chem. 256 (16), 8357-8363 (1981).</li>
<li>Gambaryan, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specification+of+receptor-binding+phenotypes+of+influenza+virus+isolates+from+different+hosts+using+synthetic+sialylglycopolymers%3A+non-egg-adapted+human+H1+and+H3+influenza+A+and+influenza+B+viruses+share+a+common+high+binding+affinity+for+6%27-sialyl%28N-acetyllactosamine%29%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Specification of receptor-binding phenotypes of influenza virus isolates from different hosts using synthetic sialylglycopolymers: non-egg-adapted human H1 and H3 influenza A and influenza B viruses share a common high binding affinity for 6'-sialyl(N-acetyllactosamine).</a> Virology. 232 (2), 345-350 (1997).</li>
<li>Rogers, G. N., D'Souza, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptor+binding+properties+of+human+and+animal+H1+influenza+virus+isolates%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Receptor binding properties of human and animal H1 influenza virus isolates.</a> Virology. 173 (1), 317-322 (1989).</li>
<li>Rogers, G. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+amino+acid+substitutions+in+influenza+haemagglutinin+change+receptor+binding+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single amino acid substitutions in influenza haemagglutinin change receptor binding specificity.</a> Nature. 304 (5921), 76-78 (1983).</li>
<li>Paulson, J. C., Rogers, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resialylated+erythrocytes+for+assessment+of+the+specificity+of+sialyloligosaccharide+binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Resialylated erythrocytes for assessment of the specificity of sialyloligosaccharide binding proteins.</a> Methods Enzymol. 138, 162-168 (1987).</li>
<li>Paulson, J. C., Sadler, J. E., Hill, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restoration+of+specific+myxovirus+receptors+to+asialoerythrocytes+by+incorporation+of+sialic+acid+with+pure+sialyltransferases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Restoration of specific myxovirus receptors to asialoerythrocytes by incorporation of sialic acid with pure sialyltransferases.</a> J Biol Chem. 254 (6), 2120-2124 (1979).</li>
<li>Chutinimitkul, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+assessment+of+attachment+pattern+and+replication+efficiency+of+H5N1+influenza+A+viruses+with+altered+receptor+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">In vitro assessment of attachment pattern and replication efficiency of H5N1 influenza A viruses with altered receptor specificity.</a> J Virol. 84 (13), 6825-6833 (2010).</li>
<li>Glaser, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+amino+acid+substitution+in+1918+influenza+virus+hemagglutinin+changes+receptor+binding+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">A single amino acid substitution in 1918 influenza virus hemagglutinin changes receptor binding specificity.</a> J Virol. 79 (17), 11533-11536 (2005).</li>
<li>Herfst, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Airborne+transmission+of+influenza+A%2FH5N1+virus+between+ferrets%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Airborne transmission of influenza A/H5N1 virus between ferrets.</a> Science. 336 (6088), 1534-1541 (2012).</li>
<li>Nobusawa, E., Ishihara, H., Morishita, T., Sato, K., Nakajima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Change+in+receptor-binding+specificity+of+recent+human+influenza+A+viruses+%28H3N2%29%3A+a+single+amino+acid+change+in+hemagglutinin+altered+its+recognition+of+sialyloligosaccharides%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Change in receptor-binding specificity of recent human influenza A viruses (H3N2): a single amino acid change in hemagglutinin altered its recognition of sialyloligosaccharides.</a> Virology. 278 (2), 587-596 (2000).</li>
<li>Gambaryan, A. S., Matrosovich, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+solid-phase+enzyme-linked+assay+for+influenza+virus+receptor-binding+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol+Methods%22%5BJournal%5D)">A solid-phase enzyme-linked assay for influenza virus receptor-binding activity.</a> J Virol Methods. 39 (1-2), 111-123 (1992).</li>
<li>Totani, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemoenzymatic+synthesis+and+application+of+glycopolymers+containing+multivalent+sialyloligosaccharides+with+a+poly%28L-glutamic+acid%29+backbone+for+inhibition+of+infection+by+influenza+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Glycobiology%22%5BJournal%5D)">Chemoenzymatic synthesis and application of glycopolymers containing multivalent sialyloligosaccharides with a poly(L-glutamic acid) backbone for inhibition of infection by influenza viruses.</a> Glycobiology. 13 (5), 315-326 (2003).</li>
<li>Gambaryan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptor+specificity+of+influenza+viruses+from+birds+and+mammals%3A+new+data+on+involvement+of+the+inner+fragments+of+the+carbohydrate+chain%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Receptor specificity of influenza viruses from birds and mammals: new data on involvement of the inner fragments of the carbohydrate chain.</a> Virology. 334 (2), 276-283 (2005).</li>
<li>Ito, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptor+specificity+of+influenza+A+viruses+correlates+with+the+agglutination+of+erythrocytes+from+different+animal+species%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Receptor specificity of influenza A viruses correlates with the agglutination of erythrocytes from different animal species.</a> Virology. 227 (2), 493-499 (1997).</li>
<li>Watanabe, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acquisition+of+human-type+receptor+binding+specificity+by+new+H5N1+influenza+virus+sublineages+during+their+emergence+in+birds+in+Egypt%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Acquisition of human-type receptor binding specificity by new H5N1 influenza virus sublineages during their emergence in birds in Egypt.</a> PLoS Pathog. 7 (5), e1002068(2011).</li>
<li>Chandrasekaran, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycan+topology+determines+human+adaptation+of+avian+H5N1+virus+hemagglutinin%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Glycan topology determines human adaptation of avian H5N1 virus hemagglutinin.</a> Nat Biotechnol. 26 (1), 107-113 (2008).</li>
<li>Blixt, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Printed+covalent+glycan+array+for+ligand+profiling+of+diverse+glycan+binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Printed covalent glycan array for ligand profiling of diverse glycan binding proteins.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (49), 17033-17038 (2004).</li>
<li>Childs, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptor-binding+specificity+of+pandemic+influenza+A+%28H1N1%29+2009+virus+determined+by+carbohydrate+microarray%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Receptor-binding specificity of pandemic influenza A (H1N1) 2009 virus determined by carbohydrate microarray.</a> Nat Biotechnol. 27 (9), 797-799 (2009).</li>
<li>Nycholat, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recognition+of+Sialylated+Poly-N-acetyllactosamine+Chains+on+N-+and+O-Linked+Glycans+by+Human+and+Avian+Influenza+A+Virus+Hemagglutinins%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">Recognition of Sialylated Poly-N-acetyllactosamine Chains on N- and O-Linked Glycans by Human and Avian Influenza A Virus Hemagglutinins.</a> Angew Chem Int Ed Engl. , (2012).</li>
<li>Rillahan, C. D., Paulson, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycan+microarrays+for+decoding+the+glycome%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Glycan microarrays for decoding the glycome.</a> Annu Rev Biochem. 80, 797-823 (2011).</li>
<li>Song, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sialylated+glycan+microarray+reveals+novel+interactions+of+modified+sialic+acids+with+proteins+and+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">A sialylated glycan microarray reveals novel interactions of modified sialic acids with proteins and viruses.</a> J Biol Chem. 286 (36), 31610-31622 (2011).</li>
<li>Gulati, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+H3N2+Influenza+Viruses+Isolated+from+1968+To+2012+Show+Varying+Preference+for+Receptor+Substructures+with+No+Apparent+Consequences+for+Disease+or+Spread%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Human H3N2 Influenza Viruses Isolated from 1968 To 2012 Show Varying Preference for Receptor Substructures with No Apparent Consequences for Disease or Spread.</a> PLoS One. 8 (6), (2013).</li>
<li>Stevens, J., Blixt, O., Paulson, J. C., Wilson, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycan+microarray+technologies%3A+tools+to+survey+host+specificity+of+influenza+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Glycan microarray technologies: tools to survey host specificity of influenza viruses.</a> Nat Rev Microbiol. 4 (11), 857-864 (2006).</li>
<li>de Vries, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+the+hemagglutinin+protein+of+the+new+pandemic+H1N1+influenza+virus%3A+maintaining+optimal+receptor+binding+by+compensatory+substitutions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Evolution of the hemagglutinin protein of the new pandemic H1N1 influenza virus: maintaining optimal receptor binding by compensatory substitutions.</a> J Virol. 87 (24), 13868-13877 (2013).</li>
<li>Yang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+receptor+binding+preferences+of+recombinant+human+A%28H3N2%29+virus+hemagglutinins%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Structure and receptor binding preferences of recombinant human A(H3N2) virus hemagglutinins.</a> Virology. 477, 18-31 (2015).</li>
<li>de Vries, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influenza+A+virus+hemagglutinin+glycosylation+state+affects+receptor-binding+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">The influenza A virus hemagglutinin glycosylation state affects receptor-binding specificity.</a> Virology. 403 (1), 17-25 (2010).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar

Avaliando especificidade de receptor IAV é um passo importante na análise do potencial pandemia de vírus aviários. reconhecimento de ácido siálico por o vírus está ligada a várias propriedades biológicas, tais como ligação e libertação a partir da célula. O conhecimento de que mutações de aminoácidos são necessários para vírus aviários para alcançar α2-6 vinculativo e cruzar a barreira das espécies permite preparação para uma pandemia. Vários ensaios são utilizados para determinar a especificidade do receptor; No entant...

aves aquáticas selvagens são o reservatório natural para IAV, mas IAV é capaz de atravessar a barreira das espécies para aves e mamíferos, incluindo os humanos. IAVS aviárias reconheçam α2-3 ácidos siálicos ligados (receptores do tipo aviário), enquanto que os vírus humanos se ligam α2-6 ácidos siálicos ligados (receptores do tipo humano). Para ser capaz de se replicar eficientemente e transmitir entre seres humanos uma IAV aviária necessita de se ligar a receptores do tipo 1 humano. IAVS são divididas com base na serologia que caracteriza a sua antigenicidade de hemaglutinina (HA) e neuraminidase (NA) glicoproteínas do envelope. HA se liga a ácidos siálicos, enquanto que NA é a enzima destruidora de receptor na outra extremidade do ciclo de vida viral e cliva o ácido siálico 2. Todos os vírus que infectam humanos, incluindo H1N1, H2N2 e H3N2, têm uma origem aviária 3. Durante as duas últimas décadas vários aviários para os crossovers humanos ocorreu, com o H5N1, H7N7 e H7N9, sendo o mais conhecido; However, outros subtipos de ter infectado seres humanos mais esporadicamente (H6N1, H7N1, H7N2, H9N2, H10N7, H10N8) 4. Felizmente, parece que nenhum destes vírus têm sido inteiramente capaz de se adaptar aos receptores do ácido siálico ligado a α2-6-tipo humano 5-8. Adaptação do vírus zoonóticos aviária ou de outros para acomodar a replicação e transmissão em hospedeiros humanos poderia ter um efeito devastador sobre a saúde humana. Portanto, o conhecimento prévio de como esses vírus estão evoluindo para se ligar receptores do tipo humano ajudará a vigilância mundial do vírus da gripe emergentes. Determinação da preferência receptor foi elucidada primeiro usando eritrócitos de diferentes espécies e continua a ser um ensaio favorecida entre os pesquisadores da gripe 9-12. A demonstração de que os vírus aviários reconhecer ácido siálico α2-3 e vírus humanos α2-6 ligados ácido siálico foi originalmente baseado em um ensaio utilizando hemaglutinação de eritrócitos enzimaticamente modificados para conter cada uma das linkages 13,14. Embora a leitura é hemaglutinação, um ensaio padrão para virologistas, as estruturas de glicano subjacentes não são definidos, a única ligação terminal. Além disso, a disponibilidade limitada das sialiltransferases, utilizados para re-sialilar as células, têm limitado a utilização deste ensaio 15-18. Subsequentemente, outros métodos de determinação das preferências de ligação ao receptor foram introduzidos usando estruturas de glicanos sialilados, ligado a poli-acrilamida (PAA) ou estruturas poli-glutamato (PGA) nos ensaios baseados em placa 19,20. Diversas variações são possíveis tanto no revestimento os glicanos vírus ou a placas de microtitulação, cada um dos quais resulta em um ensaio de ELISA de tipo robusto, fiável e muito sensível 21-23. Alternativamente, glicanos ligados em biotina pode substituir PAA / PGA e podem ser conjugados com placas revestidas com estreptavidina 2,24. Embora alguns soros específicos podem ser necessários, ELISAs estão glicanos padrão e vários ligados ao PAA são prontamente commercially e não comercialmente disponível (Consórcio para Glycomics Funcionais (http://www.functionalglycomics.org)). Tecnologias de microarray glicano surgiram como uma ferramenta valiosa para determinar a especificidade de receptor, como vários glicanos diferentes são vistos, e ligação a uma grande variedade de estruturas diferentes pode ser avaliada dentro de um único ensaio 25-29. A ligação dos IAV para estas estruturas fornece uma melhor compreensão das estruturas de glicano que IAV reconhece preferencialmente 30-33. microarrays de glicano requerem pequenas quantidades de volume de amostra para efectuar um ensaio de ligação e utiliza apenas quantidades diminutas de glicano por ponto (2 nl). No entanto, estas matrizes são normalmente utilizados apenas para avaliar a especificidade dos receptores de glicanos. Análise de vários vírus, ou proteínas de hemaglutinina, em vários intervalos de concentração pode ser proibitivo devido ao número de lâminas necessárias. Além disso, até à data, nenhum ensaio de avidez relativa foi desenvolvido usando ar glicanotécnicas de raios. Para combinar a exigência de baixo amostra proporcionada por técnicas de microarray de glicano e a sensibilidade dos glicanos ligados em PAA em ensaios baseados em ELISA, procurou-se desenvolver uma matriz de glicanos multi-bem que iria permitir a análise de alto rendimento com resolução semelhante ou melhor, em comparação para o ensaio tradicional baseado em ELISA. Simultaneamente, queríamos minimizar a quantidade de produtos biológicos e químicos repórter consumidos. O resultado final é um ensaio de avidez miniaturizado, desenvolvido especificamente para o controlo e especificidade IAV é igualmente aplicável à avaliação de outras proteínas de ligação de glicano. Usando uma lâmina de vidro separada em 48 micro-poços por uma máscara de Teflon, 6 glicanos diferentes são vistos em 6 réplicas por poço. A plataforma de microarray ofereça as mesmas tendências na ligação ao receptor visto no formato macro ELISA com várias vantagens. Estas incluem: (I) a impressão de composto em 6 repetições, utilizando amostra mínima, contra o revestimento de várias linhas iplaca na, usando 100 ul por poço; (II) vários compostos diferentes analisados ​​simultaneamente num único poço, incluindo os controlos; (III) a uma redução maciça no volume de incubação e; (Iv) uma gama dinâmica maior utilizando uma leitura fluorescente. Uma única lâmina pode ser calculada como sendo equivalente a 18x placas de 96 poços. Com o protocolo seguinte, qualquer laboratório capaz de fabricar e análise manchada microarrays deve ser capaz de fabricar este formato de ELISA miniaturizado.

<table><tbody><tr><td>NEXTERION&reg; Slide H MPX-48&nbsp;</td><td>Lâminas Schott</td><td>1091525</td><td>Microwell</td></tr><tr><td>ProScanArray Plus&nbsp;</td><td>PerkinElmer</td><td>descontinuou</td><td>o scanner de microarray confocal</td></tr><tr><td>Innoscan 1100AL Scanner/Mapix Software</td><td>Innopsys-scanner</td><td></td> <td>de microarray confocal</td></tr><tr><td>MicroGrid II&nbsp;</td><td>Impressora Digilab-microaray</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>SNA</td><td>Vector Labs</td><td>B-1305&nbsp;</td><td>Lectina vegetal</td></tr><tr><td>ECA</td><td>Vector Labs</td><td>B-1145&nbsp;</td><td>Lectina vegetal</td></tr><tr><td>Anticorpo Anti-Estreptococo</td><td>IBA</td><td>2-1509-001&nbsp;</td><td>Anitbody para ligação HA</td></tr><tr><td>Anti-Mouse Alexa-647</td><td>Life</td><td>A-21235</td><td>Anitbody para ligação</td></tr><tr><td>HA Tween-20</td><td>Sigma</td><td>P2287&nbsp;</td><td>Detergente</td></tr><tr><td>Fosfato de Sódio di-básico</td><td>Sigma</td><td>255793</td><td>componente de buffer de impressão</td></tr><tr><td>mono-básico Fosfato de sódio Sigma</td><td></td><td>229903&nbsp;</td><td>componente de buffer de impressão</td></tr><tr><td>solução de poli-l-lisina</td><td>Sigma</td><td>P8920;</td><td>componente de slide de pré-localização</td></tr><tr><td>hidróxido de sódio</td><td>Sigma</td><td>221465</td><td>componente de lâmina de pré-mancha</td></tr><tr><td>etanol</td><td>Sigma</td><td>493546</td><td>componente de lâmina de pré-mancha</td></tr><tr><td>tampão de fosfato solução salina</td><td>Corning</td><td>46-013-CM</td><td>tampão de incubação/lavagem</td></tr><tr><td>SMP4B pinos</td><td>Telechem</td><td>SMP4B</td><td>pino de impressão</td></tr><tr><td>Nitrogênio comprimido (Grade5)</td> <td>Praxair</td><td>UN1066</td><td>ferramenta geral de espanagem/secagem</td></tr><tr><td>Ácido bórico</td><td>Sigma</td><td>B6768-500G</td><td>Reagente de bloqueio de lâminas</td></tr><tr><td>etanolamina</td><td>Sigma</td><td>E9508-500ML</td><td>Reagente de bloqueio de lâminas</td></tr><tr><td>Atto 488</td><td>AttoTec</td><td>AD 488-91</td><td>Marcador de grade na matriz</td></tr><tr><td>Consórcio PAA-LNLN</td><td>para Glicômica Funcional</td><td>PA368</td><td>Glicanos manchados</td></tr><tr><td>Consórcio PAA-3SLNLN</td><td>para Glicanos Manchados</td><td>PA362</td><td>Glicanos Funcionais</td></tr><tr><td>PAA-6SLNLN</td><td>Consórcio para Glicômica Funcional</td><td>PA343</td><td>Glicanos Manchados</td></tr><tr><td>LNLN</td><td>Consórcio para Glicômica Funcional</td><td>Te98</td><td>Glicanos Manchados</td></tr><tr><td>3SLNLN</td><td>Consórcio para Glicômica Funcional</td><td>Te175</td><td>Glicanos Manchados</td></tr><tr><td>6SLNLN</td><td>Consórcio para Glicômica Funcional</td><td>Te176</td><td>Glicanos manchados</td></tr><tr><td>Placa de microtitulação de 384 poços</td><td>Matrix TechCorp</td><td>4361</td><td>Placa de impressão</td></tr><tr><td>Marcador de laboratório VWR</td><td>VWR</td><td>52877-150</td><td>Numeração de lâminas</td></tr><tr><td>Placa de coloração de lâminas Wheaton</td><td>Sigma</td><td>Z103969-1EA</td><td>Bloqueio e secagem</td></tr></tbody></table>

a miniaturized glycan microarray ensaio para a avaliação de avidez e especificidade do hemaglutininas vírus da gripe a

A Miniaturized Glycan Microarray Assay for Assessing Avidity and Specificity of Influenza A Virus Hemagglutinins

Vírus da Influenza A (IAV) hemaglutininas reconhecem ácidos siálicos na superfície celular como receptores funcionais para ganhar a entrada nas células. aves aquáticas selvagens são o reservatório natural para IAV, mas IAV pode cruzar a barreira das espécies para aves, suínos, cavalos e seres humanos. vírus aviários reconhecer ácido siálico ligado a um penúltimo galactose através de uma ligação α2-3 (receptores do tipo aviário), enquanto que os vírus humanos reconhecem preferencialmente ácido siálico com uma ligação α2-6 (receptores do tipo humano). Para monitorar se os vírus aviários estão a adaptar-se aos receptores do tipo humano, podem ser usados ​​vários métodos. microarrays de glicano com diversas bibliotecas de sialosides sintéticos são cada vez mais utilizadas para avaliar a especificidade do receptor. No entanto, esta técnica não é usada para medir a avidez. Medição de avidez é tipicamente alcançada por avaliação da ligação de hemaglutinina ou de vírus diluído em série a glicanos adsorvidos ao polipropileno placas de 96 poços convencionais. Neste ensaio, os glicanos com α2-3 ou α2-6 ácidos siálicos são acoplados a biotina e adsorvido a placas de estreptavidina, ou são acoplados a poliacrilamida (PAA), que adsorver directamente para o plástico. Temos miniaturizado significativamente este ensaio, imprimindo directamente ligada sialosides-PAA e os seus homólogos não ligada-PAA em lâminas de vidro de micro-poços. Este set-up, com 48 matrizes em um único slide, permite ensaios simultâneos de 6 glicano proteínas de ligação em 8 diluições, interrogando 6 glicanos diferentes, incluindo dois controles não-sialilados. Isto é equivalente a 18x placas de 96 cavidades na placa de ensaio tradicionais. O formato de matriz de glicanos diminui o consumo de compostos e produtos biológicos e, portanto, aumenta muito a eficiência.

Impressão, digitalização e análise de dados Para garantir a impressão correta, é vital ter o alinhamento correto da grade manchado dentro da máscara de teflon, que delineia cada matriz no slide. Durante a impressão, devido à natureza do revestimento de Teflon, as manchas não podem ser vistos a olho nu nas lâminas MPX. Dá-se atenção, em seguida, para o aparecimento dos pré-manchas sobre as lâminas de poli-L-lisina revestidos. D...

Usando uma estratégia de microarray de glicano impresso, um ensaio convencional de placa de 96 poços foi miniaturizado para análise da avidez e especificidade da hemaglutinina do vírus influenza A para receptores contendo ácido siálico.

A Miniaturized Glycan Microarray Ensaio para a Avaliação de avidez e especificidade do Hemaglutininas vírus da gripe A

Influenza A virus (IAV) hemagglutinins recognize sialic acids on the cell surface as functional receptors to gain entry into cells. Wild waterfowl are the ...

O objetivo geral deste arranjo de glicanos em miniatura é analisar a especificidade e a avidade das hemaglutininas do vírus da influenza A. Este ensaio pode ajudar a responder perguntas fundamentais sobre a ligação ao receptor e a avidade do vírus da influenza A. A principal vantagem desta técnica é que, em um único ensaio, podemos avaliar tanto a especificidade quanto a avidade relativa de ligação, o que normalmente não é alcançado em ensaios típicos baseados em arranjos de glicanos ou em placas.Este protocolo inicia-se com os preparativos das amostras de glicanos. A solução base para os glicanos é um tampão estoque para impressão que, quando preparado, deve ser titulado lentamente até um pH de 8,5 e, em seguida, receber uma adição de surfactante. Usando o tampão de impressão preparado, dilua os glicanos conjugados com PAA para 100 microgramas por mililitro.Em seguida, dilua os glicanos monovalentes até 100 micromolares também no tampão de impressão. Por fim, prepare estoques de trabalho dos corantes funcionalizados com amina a um micromolar. Agora, carregue dez microlitros de cada amostra de glicano em um poço de uma placa de microtitulação de 384 poços.Esta quantidade é suficiente para imprimir cinco lâminas. Transfira também dez microlitros do marcador corante para um poço da placa de impressão. Prepare-se para imprimir os arranjos posicionando primeiro os pinos do arrayer e a cabeça de impressão de acordo com o layout.Neste caso, um único pino pode imprimir todas as amostras. As matrizes de glicanos são impressas em blocos de seis, cercados por um espaço vazio em todos os lados. Use luvas ao manipular as lâminas.Desempacote-os e remova qualquer resíduo das superfícies com gás nitrogênio de ultra alta pureza. Em seguida, posicione as lâminas com o lado revestido voltado para cima na plataforma do arrayer. Depois, programe o arrayer.Neste caso, o programa executa 27 pontos por visita à placa de origem. Três pontos prévios colocados na área não utilizada para o arranjo em uma lâmina revestida com poli-L-lisina são usados para remover o excesso de líquido na ponta do pino. Os outros 24 pontos por visita do pino são utilizados para colocar seis pontos em quatro arranjos replicados.Os detalhes são fornecidos no protocolo textual. Agora, carregue as placas de múltiplos poços na impressora e inicie a impressão das matrizes. Durante a impressão, certifique-se de que a umidade permaneça entre 55 e 65%. Preste atenção à aparência dos pré-pontos em lâminas revestidas com poli-L-lisina.Após a impressão, inspecione visualmente cada lâmina. Verifique o alinhamento correto das manchas dentro das bordas de teflon, o que é essencial, e confira o número correto de características impressas. Para ajudar a homogeneizar a fixação das manchas, coloque as lâminas impressas em uma câmara de umidade a 100% com o lado impresso voltado para cima imediatamente após a confecção.Use toalhas de papel úmidas para forrar um recipiente e uma grade improvisada. Envolva a câmara com plástico para reter a umidade. Após meia hora, remova as lâminas.Em seguida, numere as lâminas com um marcador resistente a solventes e armazene-as em uma caixa de dessecação durante a noite. No dia seguinte, prepare um estoque fresco de tampão bloqueador com agitação vigorosa. Ajuste o pH para 9,2 usando hidróxido de sódio concentrado.Em seguida, incubar as lâminas no tampão por uma hora. Para remover o bloqueio, lavar as lâminas em água destilada duas vezes. Em seguida, transferir as lâminas para porta-lâminas de vidro e colocar os porta-lâminas em um suporte giratório para centrifugar as lâminas a 10 G por cinco minutos até secarem.Uma vez secos, se necessário, armazene as lâminas a menos 20 graus Celsius em sacos plásticos lacrados. Como preparação, monte outra câmara de umidificação como anteriormente. Para detectar os glicanos imobilizados, prepare lectinas biotiniladas de SNA e ECA a 10 microgramas por mililitro em tampão de sondagem e adicione dois microgramas por mililitro de estreptavidina 555 a cada diluição.Para corar com as hemaglutininas, prepare uma solução de 20 microgramas por mililitro de anticorpo pré-complexado em tampão bloqueador na proporção molar de quatro para dois para um, conforme descrito no protocolo do texto. Transfira 20 microlitros das soluções preparadas para poços de uma placa de 384 poços. Em seguida, dilua seriamente as lectinas e hemaglutininas na proporção de um para um em seus tampões apropriados.Prepare oito diluições, preenchendo cada poço com 10 microlitros de amostra e 10 microlitros de tampão. Em seguida, incube a placa em gelo por 30 minutos. Agora, adicione oito microlitros de cada diluição a um dos 48 micropoços em uma lâmina impressa.Em seguida, incube a lâmina preparada na câmara de umidificação por 90 minutos. Após 90 minutos, lave a lâmina segurando-a pela borda; mergulhe-a quatro vezes em PBS-T, depois mergulhe-a quatro vezes em PBS e, finalmente, mergulhe-a quatro vezes em água desionizada. Agora, seque a lâmina em centrífuga como antes.Após a secagem por centrifugação, escaneie imediatamente a lâmina. Certifique-se de carregar cuidadosamente a lâmina no escâner na orientação correta. Usando uma potência baixa do laser de cinco miliwatts, escaneie iterativamente as lâminas, aumentando gradualmente o ganho de 25 a 75%. Ao otimizar as configurações de digitalização, lembre-se de que os fluoróforos sofrerão bleaching com digitalizações repetidas.Analise a imagem salva em busca de sinais de ligação utilizando o software associado. Uma lista de matriz pode ser carregada, contendo o padrão de deposição. Sobreponha-a à imagem escaneada para ajudar a navegar na colocação dos marcadores da grade.Em seguida, utilize o software para analisar as intensidades dos pontos e salve os resultados como um arquivo de texto delimitado por tabulações para exportação para uma planilha ou outro pacote estatístico. Analise os dados calculando a intensidade média do sinal menos o fundo. Calcule a média de quatro dos seis pontos replicados para cada amostra, excluindo o sinal mais alto e o sinal mais baixo.Em seguida, produza um gráfico de linhas da média do sinal médio subtraído do fundo em relação às oito concentrações de proteína. Suavize a linha resultante utilizando regressão não linear. O arranjo de PAA foi utilizado para avaliar a especificidade de ligação ao receptor das hemaglutininas do vírus da influenza A.A matriz incluiu controles não sialilados nos mesmos micropoços. Lectinas de plantas com especificidades conhecidas para os compostos impressos foram utilizadas como controles positivos. A lectina ECA ligou-se à galactose terminal beta 1-4 ligada à N-acetilglicosamina e não se ligou ao mesmo composto se a galactose terminal estivesse cuspida com ácido siálico.Para testar o ácido siálico ligado por alfa 2-6, utilizou-se a lectina SNA. Como esperado, a SNA ligou-se apenas aos ácidos siálicos ligados por alfa 2-6, mas com diferenças notáveis na afinidade por repetições de lacNAc marcadas com corante ligadas a PAA versus não ligadas a PAA. Em seguida, testou-se uma hemaglutinina H5 derivada de um vírus Vietnam/1203/04, que reconhece apenas ácidos siálicos ligados por alfa 2-3.O perfil de ligação da hemaglutinina H5 mostrou a especificidade esperada, com maior afinidade por estruturas ligadas ao PAA. Por fim, foi testada a hemaglutinina H1 de uma cepa sazonal humana H1N1. Conforme esperado, essa hemaglutinina ligou-se apenas a estruturas contendo ácido siálico ligado por alfa 2-6.Uma vez dominada, esta técnica pode revelar as especificidades de ligação e as avidades relativas de vírus da influenza dentro de um único ensaio. Esta técnica aumentará significativamente a eficiência dos ensaios de ligação de influenza, além de reduzir o consumo de reagentes biológicos preciosos.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Um método simples blot slot foi desenvolvido para a quantificação da gripe hemaglutinina e neuraminidase viral utilizando anticorpos universal, direccionado para suas seqüências mais conservadas identificados através de análises de bioinformática. Esta abordagem inovadora pode fornecer uma alternativa útil para determinação quantitativa de todos os hemaglutinina e neuraminidase viral.

Análise quantitativa de todos Influenza Tipo A Hemaglutininas Virais e neuraminidases usando anticorpos Universal em Ensaios Blot simples slot

Este método descreve o uso de sistema de imagem de Infravermelhos corante baseada em para a detecção de A H1N1 no bronchioalveolar o lavado de fluido (BAL) de camundongos infectados em uma alta sensibilidade. Esta metodologia pode ser realizado em um 96 - ou 384-bem prato, requer &lt;volume de 10 uL de material de teste e tem o potencial para a triagem concomitante de agentes patogénicos múltiplos.

Alta capacidade método de detecção de vírus Influenza

Neste vídeo, demonstramos o processo de detecção de isotipos de anticorpos em várias amostras de soro humano usando uma lâmina de microarray impressa com subtipos antigênicos de cepas do vírus influenza.

Ensaio de microarranjo de antígeno viral para detectar isotipos de anticorpos no soro contra o antígeno viral

O vídeo demonstra um ensaio de inibição da hemaglutinação para detectar anticorpos séricos contra antígenos específicos. A confirmação da inibição da hemaglutinação no poço de teste e da hemaglutinação no poço de controle é obtida por meio de padrões visuais distintos. Este ensaio desempenha um papel crucial na avaliação da resposta imune, na eficácia da vacina e no estudo de infecções virais em virologia e imunologia.

O ensaio de inibição da hemaglutinação para detectar anticorpos séricos contra um antígeno alvo

O vídeo demonstra um ensaio para quantificar os vírus influenza A e B. Este ensaio emprega amplificação de endonuclease de corte com primers específicos para influenza e detecção de alvos usando sondas de farol molecular.

Um ensaio de base molecular para quantificar os vírus influenza A e B

Este vídeo demonstra um ensaio que mede os títulos de anticorpos inibidores da neuraminidase (NA) da influenza em uma amostra de soro. Uma amostra de soro contendo anticorpos contra NA é adicionada a uma placa de micropoços revestida com fetuína. Ao adicionar o vírus, os anticorpos impedem que o NA viral clive a fetuína e exponha sua porção galactose. Uma lectina conjugada com peroxidase é então adicionada, que se liga à galactose exposta. O título de anticorpos inibidores de NA é determinado...

Um ensaio para medir os títulos de anticorpos de inibição da neuraminidase da influenza

Descrevemos o ensaio de lectina enzimática (ELLA) para medir os títulos de anticorpos de inibição da neuraminidase (NA) da influenza em soros. O ensaio usa aglutinina de amendoim para quantificar os resíduos de galactose que se tornam acessíveis quando a NA remove o ácido siálico de placas de 96 poços revestidas com fetuína.

Medição de Inibição da Neuraminidase Influenza títulos de anticorpos por Enzyme-linked Lectina Ensaio

Este estudo descreve uma   -Imagem baseada ensaio de micro-neutralização para analisar as relações antigênicas entre vírus. O protocolo emprega um digitalizador de mesa e tem quatro passos, incluindo titulação, a quantificação de titulação, neutralização, e quantificação de neutralização. O ensaio funciona bem com pdm09 corrente circulante vírus influenza A (H1N1), A (H3N2), e B vírus.

Optimização de um Micro-quantitativa Ensaio de neutralização

Os protocolos apresentados descrevem como realizar um ensaio de inibição de hemaglutinação para quantificar os anticorpos específicos de gripe de amostras de soro de destinatários de vacina contra gripe. O primeiro ensaio determina as concentrações de antígeno viral ideal por hemaglutinação. O segundo ensaio quantifica anticorpos específicos da gripe através da inibição da hemaglutinação.

Um ensaio de inibição (HI) de hemaglutinação otimizado para quantificar os anticorpos específicos de gripe

Nós descrevemos um método para medir a ativação das funções efetoras Fc-mediada por anticorpos que visam a hemaglutinina do vírus da gripe. Este ensaio também pode ser adaptado para avaliar a capacidade dos anticorpos monoclonais ou policlonais soros visando outras glicoproteínas de superfície virais para induzir imunidade mediada por Fc.

Um método para avaliar funções efetoras mediada por Fc induzidas por anticorpos específicos de hemaglutinina de gripe

Nós apresentamos um protocolo para usar um microarray da proteína construído imprimindo antígenos da gripe em corrediças nitrocelulose-revestidas para sonda simultaneamente o soro para isotipos múltiplos do anticorpo de encontro a mais de 250 antígenos das tensões diferentes do vírus, assim permitindo a medida da amplitude de anticorpos do soro através dos subtypes do vírus.

Uso de um microarray do antígeno da gripe para medir a amplitude de anticorpos do soro através dos subtypes do vírus

Aprenda a usar microarranjo de glicanos miniaturizado para avaliar avidez e especificidade de hemaglutininas do vírus influenza A. Este método permite analisar ligação a receptores e avidez simultaneamente em ensaio único.

A Miniaturized Glycan Microarray Ensaio para a Avaliação de avidez e especificidade do Hemaglutininas vírus da gripe A

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