A Miniaturized Glycan Microarray Ensaio para a Avaliação de avidez e especificidade do Hemaglutininas vírus da gripe A

O objetivo geral deste arranjo de glicanos em miniatura é analisar a especificidade e a avidade das hemaglutininas do vírus da influenza A. Este ensaio pode ajudar a responder perguntas fundamentais sobre a ligação ao receptor e a avidade do vírus da influenza A. A principal vantagem desta técnica é que, em um único ensaio, podemos avaliar tanto a especificidade quanto a avidade relativa de ligação, o que normalmente não é alcançado em ensaios típicos baseados em arranjos de glicanos ou em placas.

Este protocolo inicia-se com os preparativos das amostras de glicanos. A solução base para os glicanos é um tampão estoque para impressão que, quando preparado, deve ser titulado lentamente até um pH de 8,5 e, em seguida, receber uma adição de surfactante. Usando o tampão de impressão preparado, dilua os glicanos conjugados com PAA para 100 microgramas por mililitro.

Em seguida, dilua os glicanos monovalentes até 100 micromolares também no tampão de impressão. Por fim, prepare estoques de trabalho dos corantes funcionalizados com amina a um micromolar. Agora, carregue dez microlitros de cada amostra de glicano em um poço de uma placa de microtitulação de 384 poços.

Esta quantidade é suficiente para imprimir cinco lâminas. Transfira também dez microlitros do marcador corante para um poço da placa de impressão. Prepare-se para imprimir os arranjos posicionando primeiro os pinos do arrayer e a cabeça de impressão de acordo com o layout.

Neste caso, um único pino pode imprimir todas as amostras. As matrizes de glicanos são impressas em blocos de seis, cercados por um espaço vazio em todos os lados. Use luvas ao manipular as lâminas.

Desempacote-os e remova qualquer resíduo das superfícies com gás nitrogênio de ultra alta pureza. Em seguida, posicione as lâminas com o lado revestido voltado para cima na plataforma do arrayer. Depois, programe o arrayer.

Neste caso, o programa executa 27 pontos por visita à placa de origem. Três pontos prévios colocados na área não utilizada para o arranjo em uma lâmina revestida com poli-L-lisina são usados para remover o excesso de líquido na ponta do pino. Os outros 24 pontos por visita do pino são utilizados para colocar seis pontos em quatro arranjos replicados.

Os detalhes são fornecidos no protocolo textual. Agora, carregue as placas de múltiplos poços na impressora e inicie a impressão das matrizes. Durante a impressão, certifique-se de que a umidade permaneça entre 55 e 65%. Preste atenção à aparência dos pré-pontos em lâminas revestidas com poli-L-lisina.

Após a impressão, inspecione visualmente cada lâmina. Verifique o alinhamento correto das manchas dentro das bordas de teflon, o que é essencial, e confira o número correto de características impressas. Para ajudar a homogeneizar a fixação das manchas, coloque as lâminas impressas em uma câmara de umidade a 100% com o lado impresso voltado para cima imediatamente após a confecção.

Use toalhas de papel úmidas para forrar um recipiente e uma grade improvisada. Envolva a câmara com plástico para reter a umidade. Após meia hora, remova as lâminas.

Em seguida, numere as lâminas com um marcador resistente a solventes e armazene-as em uma caixa de dessecação durante a noite. No dia seguinte, prepare um estoque fresco de tampão bloqueador com agitação vigorosa. Ajuste o pH para 9,2 usando hidróxido de sódio concentrado.

Em seguida, incubar as lâminas no tampão por uma hora. Para remover o bloqueio, lavar as lâminas em água destilada duas vezes. Em seguida, transferir as lâminas para porta-lâminas de vidro e colocar os porta-lâminas em um suporte giratório para centrifugar as lâminas a 10 G por cinco minutos até secarem.

Uma vez secos, se necessário, armazene as lâminas a menos 20 graus Celsius em sacos plásticos lacrados. Como preparação, monte outra câmara de umidificação como anteriormente. Para detectar os glicanos imobilizados, prepare lectinas biotiniladas de SNA e ECA a 10 microgramas por mililitro em tampão de sondagem e adicione dois microgramas por mililitro de estreptavidina 555 a cada diluição.

Para corar com as hemaglutininas, prepare uma solução de 20 microgramas por mililitro de anticorpo pré-complexado em tampão bloqueador na proporção molar de quatro para dois para um, conforme descrito no protocolo do texto. Transfira 20 microlitros das soluções preparadas para poços de uma placa de 384 poços. Em seguida, dilua seriamente as lectinas e hemaglutininas na proporção de um para um em seus tampões apropriados.

Prepare oito diluições, preenchendo cada poço com 10 microlitros de amostra e 10 microlitros de tampão. Em seguida, incube a placa em gelo por 30 minutos. Agora, adicione oito microlitros de cada diluição a um dos 48 micropoços em uma lâmina impressa.

Em seguida, incube a lâmina preparada na câmara de umidificação por 90 minutos. Após 90 minutos, lave a lâmina segurando-a pela borda; mergulhe-a quatro vezes em PBS-T, depois mergulhe-a quatro vezes em PBS e, finalmente, mergulhe-a quatro vezes em água desionizada. Agora, seque a lâmina em centrífuga como antes.

Após a secagem por centrifugação, escaneie imediatamente a lâmina. Certifique-se de carregar cuidadosamente a lâmina no escâner na orientação correta. Usando uma potência baixa do laser de cinco miliwatts, escaneie iterativamente as lâminas, aumentando gradualmente o ganho de 25 a 75%. Ao otimizar as configurações de digitalização, lembre-se de que os fluoróforos sofrerão bleaching com digitalizações repetidas.

Analise a imagem salva em busca de sinais de ligação utilizando o software associado. Uma lista de matriz pode ser carregada, contendo o padrão de deposição. Sobreponha-a à imagem escaneada para ajudar a navegar na colocação dos marcadores da grade.

Em seguida, utilize o software para analisar as intensidades dos pontos e salve os resultados como um arquivo de texto delimitado por tabulações para exportação para uma planilha ou outro pacote estatístico. Analise os dados calculando a intensidade média do sinal menos o fundo. Calcule a média de quatro dos seis pontos replicados para cada amostra, excluindo o sinal mais alto e o sinal mais baixo.

Em seguida, produza um gráfico de linhas da média do sinal médio subtraído do fundo em relação às oito concentrações de proteína. Suavize a linha resultante utilizando regressão não linear. O arranjo de PAA foi utilizado para avaliar a especificidade de ligação ao receptor das hemaglutininas do vírus da influenza A.

A matriz incluiu controles não sialilados nos mesmos micropoços. Lectinas de plantas com especificidades conhecidas para os compostos impressos foram utilizadas como controles positivos. A lectina ECA ligou-se à galactose terminal beta 1-4 ligada à N-acetilglicosamina e não se ligou ao mesmo composto se a galactose terminal estivesse cuspida com ácido siálico.

Para testar o ácido siálico ligado por alfa 2-6, utilizou-se a lectina SNA. Como esperado, a SNA ligou-se apenas aos ácidos siálicos ligados por alfa 2-6, mas com diferenças notáveis na afinidade por repetições de lacNAc marcadas com corante ligadas a PAA versus não ligadas a PAA. Em seguida, testou-se uma hemaglutinina H5 derivada de um vírus Vietnam/1203/04, que reconhece apenas ácidos siálicos ligados por alfa 2-3.

O perfil de ligação da hemaglutinina H5 mostrou a especificidade esperada, com maior afinidade por estruturas ligadas ao PAA. Por fim, foi testada a hemaglutinina H1 de uma cepa sazonal humana H1N1. Conforme esperado, essa hemaglutinina ligou-se apenas a estruturas contendo ácido siálico ligado por alfa 2-6.

Uma vez dominada, esta técnica pode revelar as especificidades de ligação e as avidades relativas de vírus da influenza dentro de um único ensaio. Esta técnica aumentará significativamente a eficiência dos ensaios de ligação de influenza, além de reduzir o consumo de reagentes biológicos preciosos.