A Miniaturized Glycan Microarray Ensaio para a Avaliação de avidez e especificidade do Hemaglutininas vírus da gripe A

O objetivo geral desta matriz de glicanos miniaturizados é analisar a especificidade e avidez das hemaglutininas do vírus influenza A. Este ensaio pode ajudar a responder a perguntas-chave sobre a ligação e avidez do receptor do vírus influenza A. A principal vantagem dessa técnica é que, em um único ensaio, podemos abordar a especificidade, bem como a avidez de ligação relativa, normalmente não alcançada em ensaios típicos de matriz de glicanos e baseados em placas.

Este protocolo começa com a preparação das amostras de glicano. A solução base para os glicanos é um tampão de impressão de estoque que, quando feito, deve ser titulado lentamente até um pH de 8,5 e, em seguida, receber uma adição de surfactante. Utilizando o tampão de impressão preparado, diluir os glicanos conjugados com PAA a 100 microgramas por mililitro.

Em seguida, dilua os glicanos monovalentes a 100 micromolares também no tampão de impressão. Finalmente, faça estoques de trabalho dos corantes funcionalizados com amina em um micromolar. Agora carregue dez microlitros de cada amostra de glicano em um poço de uma placa de microtitulação de 384 poços.

Esta é uma solução suficiente para imprimir cinco slides. Transfira também dez microlitros do marcador de corante para um poço da chapa de impressão. Prepare-se para imprimir as matrizes posicionando primeiro os pinos do arrayer e o cabeçote de impressão de acordo com o layout.

Nesse caso, um alfinete pode imprimir todas as amostras. As matrizes de glicanos são impressas em blocos de seis cercados por um espaço vazio em todos os lados. Coloque luvas para manusear os slides.

Desembale-os e sopre quaisquer detritos de suas superfícies com gás nitrogênio de pureza ultra-alta. Em seguida, posicione as lâminas com o lado revestido para cima no estágio do arrayer. Em seguida, programe o arrayer.

Nesse caso, programe 27 vagas por visita à placa de origem. Três pré-pontos colocados na área sem matriz de uma lâmina revestida de poli-L-lisina são usados para remover o excesso de líquido na ponta do pino. Os outros 24 pontos por visita de pino são usados para colocar seis pontos em quatro matrizes replicadas.

Os detalhes são fornecidos no protocolo de texto. Agora, carregue as placas de vários poços na impressora e comece a imprimir as matrizes. Durante a impressão, certifique-se de que a umidade permaneça entre 55 e 65%Preste atenção à aparência dos pré-pontos nas lâminas revestidas de poli-L-lisina.

Após a impressão, inspecione visualmente cada slide. Verifique o alinhamento correto das manchas dentro das bordas de teflon, o que é vital, e verifique o número correto de características manchadas. Para ajudar a homogeneizar a fixação dos pontos, coloque as lâminas impressas em uma câmara de 100% de umidade com o lado impresso para cima imediatamente após serem feitas.

Use toalhas de papel molhadas para forrar um recipiente e um rack improvisado. Embrulhe a câmara em plástico para reter a umidade. Depois de meia hora, remova os slides.

Em seguida, numere as lâminas com um marcador resistente a solventes e guarde-as em uma caixa de dessecação durante a noite. No dia seguinte, prepare um novo estoque de tampão de bloqueio com agitação vigorosa. Ajuste o pH de 9,2 usando hidróxido de sódio concentrado.

Em seguida, incube as lâminas no buffer por uma hora. Para remover o bloco, enxágue as lâminas em água bidestilada Em seguida, transfira as lâminas para suportes de coloração de vidro e carregue os suportes em um suporte de placa oscilante para centrifugar as lâminas a 10 G por cinco minutos.

Depois de secos, se necessário, armazene as lâminas a menos 20 graus Celsius em sacos plásticos lacrados. Na preparação, faça outra câmara de umidificação como antes. Para detectar os glicanos imobilizados, prepare lectinas biotiniladas SNA e ECA a 10 microgramas por mililitro em tampão de sondagem e adicione dois microgramas por mililitro de estreptavidina 555 a cada diluição.

Para corar com as hemaglutininas, faça uma solução de 20 microgramas por mililitro de anticorpo pré-complexo em tampão de bloqueio em uma proporção molar de quatro para dois para um, conforme descrito no protocolo de texto. Transfira 20 microlitros das soluções preparadas para poços de uma placa de 384 poços. Em seguida, dilua em série as lectinas e hemaglutininas uma a uma em seus tampões apropriados.

Faça oito diluições, enchendo cada poço com 10 microlitros de amostra e 10 microlitros de tampão. Agora, incube o prato no gelo por 30 minutos. Agora adicione oito microlitros de cada diluição a um dos 48 micropoços em uma lâmina impressa.

Em seguida, incube a lâmina preparada na câmara de umidificação por 90 minutos. Após 90 minutos, lave a lâmina segurando-a pela borda; mergulhe-o em PBS-T quatro vezes, depois mergulhe-o em PBS quatro vezes e, finalmente, mergulhe-o em água deionizada quatro vezes. Agora, seque o slide como antes.

Após a centrifugação, digitalize imediatamente a lâmina. Certifique-se de carregar cuidadosamente a lâmina no scanner na orientação correta. Usando uma baixa potência de laser de cinco miliwatts, escaneie iterativamente as lâminas, aumentando gradualmente o ganho de 25 para 75%Ao otimizar as configurações de varredura, lembre-se de que os fluoróforos irão branquear com varreduras repetidas.

Analise a imagem salva em busca de sinais de ligação usando o software associado. Uma lista de matrizes pode ser carregada com o padrão de manchas. Sobreponha-o na digitalização para ajudar a navegar pelo posicionamento dos marcadores de grade.

Em seguida, use o software para analisar as intensidades pontuais e salve os resultados como um arquivo de texto delimitado por tabulação para exportar para uma planilha ou outro pacote estatístico. Analise os dados calculando a intensidade média do sinal menos o plano de fundo. Pegue uma média de quatro dos seis pontos replicados para cada amostra, deixando de fora o sinal mais alto e o sinal mais baixo.

Em seguida, produza um gráfico de linhas do sinal médio médio menos o fundo em relação às oito concentrações de proteínas. Suavize a linha resultante usando regressão não linear. O PAA array foi usado para avaliar a especificidade de ligação ao receptor das hemaglutininas do vírus influenza A.

A matriz incluiu controles não siaililados nos mesmos micropoços. Lectinas vegetais com especificidades conhecidas para os compostos impressos foram usadas como controles positivos. A lectina ECA ligada à galactose beta terminal 1-4 ligou-se à anacetilglucosamina e não se ligou ao mesmo composto se a galactose terminal fosse tampada com ácido siálico.

Para testar o ácido siálico ligado alfa 2-6, a lectina SNA foi usada. Como esperado, o SNA ligou-se apenas aos ácidos siálicos ligados ao alfa 2-6, mas com diferenças notáveis na afinidade para repetições lacNAc de corante ligadas a PAA versus não ligadas a PAA. Em seguida, foi testada uma hemaglutinina H5 derivada de um vírus do Vietnã/1203/04 que reconhece apenas ácidos siálicos ligados alfa 2-3.

O perfil de ligação da hemaglutinina H5 mostrou a especificidade esperada com maior avidez para as estruturas ligadas ao PAA. Finalmente, a hemaglutinina H1 de uma cepa H1N1 sazonal humana foi testada. Como esperado, esta hemaglutinina liga-se apenas a estruturas contendo ácido siálico ligadas ao alfa 2-6.

Uma vez dominada, essa técnica pode revelar as especificidades de ligação e avidez relativa dos vírus influenza em um único ensaio. Essa técnica aumentará muito a eficiência dos ensaios de ligação à gripe, além de reduzir o consumo de produtos biológicos preciosos.