Alta capacidade método de detecção de vírus Influenza

O objetivo geral deste procedimento é quantificar de forma eficiente as titulações virais da gripe nas vias aéreas de camundongos infectados. Primeiramente, os camundongos são inoculados por via intranasal com o vírus da gripe em momentos selecionados após a infecção.

Os M são sacrificados e o lavado broncoalveolar ou fluido BAL é coletado. Em seguida, o fluido BAL é usado para infectar células MDCK. As células infectadas podem então ser coradas para detectar a presença de proteínas virais utilizando anticorpos primários específicos, seguidos por anticorpos secundários conjugados com infravermelho.

Os sinais de infravermelho são lidos utilizando o leitor Lycor Odyssey, e o software Odyssey pode ser usado para determinar os títulos virais. Utilizando uma curva padrão, pode-se obter a determinação quantitativa dos títulos virais. As principais vantagens desta técnica em relação aos métodos existentes são a quantificação precisa dos títulos virais, a reprodutibilidade e o pequeno volume necessário para realizar este ensaio.

As implicações desta técnica podem ser estendidas para o diagnóstico e terapia de diversas doenças virais respiratórias, pois ela pode ser usada para quantificar títulos virais em amostras clínicas após este procedimento. Outros métodos, como a QPCR, podem ser realizados para responder perguntas adicionais, como o número de cópias virais. Ao tentar aplicar esta técnica, é importante lembrar-se de verificar o vírus controle do padrão de título após este desenvolvimento.

Esta técnica abre caminho para que o pesquisador na área da lógica viral explore a titulação viral ou a detecção de proteínas virais em amostras clínicas. Uma vez dominada, essa técnica pode ser realizada em 17 horas. Realiza-se a infecção precisa de camundongos por via intranasal com 5.000 unidades formadoras de placas ou PFU do vírus influenza PR8 em 30 microlitros de PBS estéril ou com PBS sozinho como controle negativo para a coleta de líquido de lavagem broncoalveolar de animais eutanasiados; primeiramente, abre-se a cavidade torácica e faz-se uma incisão de um centímetro paralela à traqueia para expô-la com tesoura estéril fina.

Faça uma pequena incisão na traqueia, infunda a traqueia com 0,5 mililitros de PBS contendo 1% de BSA e aspire suavemente o fluido de lavagem. Armazene os fluidos de LBA a menos 20 graus centígrados para quantificar os títulos virais nos fluidos de lavagem. Primeiro, cultive 5 milhões de células MDCK em 20 mililitros de RPMI completo em um frasco T75 durante a noite a 37 graus centígrados; no dia seguinte, recolha as células e plaque-as em uma placa de 96 poços preta com fundo óptico plano, com 10.000 células por poço.

Em seguida, incubar a placa durante a noite a 37 graus centígrados após a incubação. Aspirar suavemente o sobrenadante e lavar as células duas vezes em DMEM completo, mas sem soro, contendo 0,2% de BSA em vez de FBS. Após a lavagem das células, adicionar 50 microlitros de fluido BAL ou 50 microlitros de uma suspensão contendo uma concentração conhecida de vírus por poço.

Em seguida, adicione 50 microlitros por poço de DMEM, meio contendo tripsina tratada com TPCK a 0,2 microgramas por mililitro, para potencializar a adesão, entrada e replicação viral. Incube as células por uma hora a 37 graus centígrados para permitir a absorção do vírus. Em seguida, adicione 100 microlitros de RPMI completo contendo FBS a cada poço e cultive as células durante a noite para permitir a propagação da infecção após a incubação noturna.

Lave as células com 100 microlitros de B-S-A-P-B-S a 1%. Após a lavagem das células, adicione 100 microlitros por poço de paraformaldeído a 1% e incube as placas por cinco minutos à temperatura ambiente para fixar as células. Em seguida, lave com 100 microlitros por poço de B-S-A-P-B-S a 1% e incube as células por mais 30 minutos para bloqueio. Após o bloqueio das células, adicione 50 microlitros por poço do anticorpo primário antiviral M dois diluído na proporção de 1:1000 e incube as placas por uma hora à temperatura ambiente para marcar qualquer proteína viral presente. Após a incubação, lave as células três vezes em B-S-A-P-B-S a 1% e incube-as com 100 microlitros por poço de anticorpo secundário conjugado com corante infravermelho, diluído na proporção de 1:200, por uma hora à temperatura ambiente, no escuro. Após a marcação das células, lave-as três vezes como anteriormente.

Em seguida, posicione as placas na plataforma de leitura do scanner de infravermelho Licor Odyssey. Selecione a configuração para placa de 96 poços no leitor utilizando o software Licor Odyssey. Identifique os poços de controle negativo em branco e, em seguida, quantifique a fluorescência de toda a placa.

Use a ferramenta de formas automáticas para desenhar a região de interesse ou ROI no centro de um teste. Utilizaremos a ROI de um controle negativo para definir o valor de fluorescência de base para o ensaio e, em seguida, introduziremos as duas linhas de mira opostas fornecidas pelo software Odyssey dentro da ROI para medir a intensidade da fluorescência ao longo do poço.

Em seguida, escaneie a placa utilizando o canal de 780 nanômetros para detecção e 680 nanômetros como comprimento de onda de referência. Após a ativação do comando de leitura, as intensidades fluorescentes em intervalos uniformes da ROI serão medidas. Em seguida, os pontos de dados coletados serão integrados.

Um multiplicador do desvio padrão determinará o nível de sinal acima da linha de base que será incluído na ROI; certifique-se de selecionar a opção de intensidade integrada para os cálculos, já que ela representa o volume líquido de pixels em áreas definidas, independentemente do tamanho. A fluorescência de fundo será quantificada a partir dos controles não infectados e será utilizada para estimar a intensidade integrada nas poças de teste. A fluorescência no infravermelho de poças duplicadas contendo diluições seriadas de vírus titulado é utilizada para construir uma curva padrão.

A curva padrão pode então ser usada para determinar os títulos do fluido de lavagem broncoalveolar de camundongos infectados. Neste experimento, um aumento significativo na carga viral foi observado no segundo e quarto dia. O vírus pós-infecção foi eliminado até o décimo dia, conforme mostrado aqui.

Os títulos virais medidos utilizando este ensaio apresentam boa correlação com a perda de peso em camundongos após a infecção. Esta técnica também pode ser aplicada a amostras humanas. Aqui é mostrada uma quantificação do vírus H1N1 obtido de um swab nasal humano.

O limite de detecção aqui é de 10 elevado à terceira dose infecciosa em cultura de tecidos, ou TCID. Após assistir a este vídeo, você também terá uma boa compreensão de como estimar a titulação do vírus da gripe utilizando um ensaio baseado em corante infravermelho. A demonstração visual desta técnica é fundamental, pois o uso do corp imager pode ser difícil, e isso ajudará a simplificar e demonstrar nossos métodos para quantificar titulações virais em uma placa de 96 ou 384 poços.

E, finalmente, não se esqueça de que trabalhar com vírus pode ser extremamente perigoso e precauções como o uso de equipamentos de proteção individual devem sempre ser adotadas ao realizar este procedimento.