Alta capacidade método de detecção de vírus Influenza

O objetivo geral deste procedimento é quantificar com eficiência os títulos virais da gripe nas vias aéreas de camundongos infectados. Os camundongos são primeiro inoculados por via intranasal com o vírus influenza no momento selecionado. Pontos após a infecção.

Os M são sacrificados e a lavagem broncoalveolar ou fluido de LBA é coletada. Em seguida, o fluido de LBA é usado para infectar células MDCK. As células infectadas podem então ser coradas para a presença de proteínas virais usando anticorpos primários específicos, seguidos por anticorpos secundários conjugados no infravermelho.

Os sinais infravermelhos são lidos usando o scanner Lycor Odyssey e o software Odyssey pode ser usado para determinar os títulos virais. Usando uma curva padrão, a determinação quantitativa dos títulos virais pode ser obtida. As principais vantagens desta técnica em relação aos métodos existentes são a quantificação precisa dos títulos virais, a reprodutibilidade e o pequeno volume necessário para realizar este ensaio.

As implicações desta técnica podem ser estendidas para o diagnóstico e terapia de várias doenças virais respiratórias, pois pode ser usada para quantificar títulos virais em amostras clínicas após este procedimento. Outro método como QPCR pode ser realizado para responder a perguntas adicionais, como número de cópias virais. Ao tentar esta técnica, é importante lembrar de verificar o vírus de controle padrão do título após esse desenvolvimento.

Essa técnica abre caminho para o pesquisador no campo da lógica viral explorar o título do vírus ou a proteína viral de coloração torcida em amostras clínicas. Uma vez dominado, esta técnica pode ser realizada em 17 horas. Ele executou precisamente Infectar camundongos por via intranasal com 5.000 unidades de plataforma ou PFU de PR oito vírus influenza em 30 microlitros de PBS estéril ou apenas com PBS como controle negativo para a coleta de fluido de LBA de animais sacrificados primeiro, corte que a cavidade torácica abra e faça uma incisão de um centímetro paralela à traqueia para expô-la com uma tesoura estéril fina.

Faça uma pequena incisão na traqueia, infunda a traqueia com 0,5 mililitros de 1% BSA contendo PBS e aspire suavemente o fluido de lavagem. Armazene os fluidos de LBA a 20 graus centígrados negativos para quantificar os títulos virais nos fluidos de lavagem. Primeiro cultive 5 milhões de células MDCK em 20 mililitros de RPMI completo em um frasco T 75 durante a noite a 37 graus centígrados no dia seguinte, colha as células e coloque-as em uma placa preta de fundo plano óptico de 96 poços a 10.000 células por poço.

Em seguida, incubar a placa durante a noite a 37 graus centígrados após a incubação. Aspire suavemente o sobrenadante e lave as células duas vezes em DMEM completo, mas sem soro, contendo 0,2% BSA em vez de FBS. Uma vez que as células são lavadas, adicione 50 microlitros de fluido de LBA ou 50 microlitros de uma suspensão contendo uma concentração conhecida de vírus por poço.

Em seguida, adicione 50 microlitros por poço de DMEM, meio contendo tripsina tratada com TPCK a 0,2 microgramas por mililitro para aumentar a fixação, entrada e replicação viral. Incube as células por uma hora a 37 graus centígrados para permitir que o vírus seja absorvido. Em seguida, adicione 100 microlitros de FBS contendo RPMI completo a cada poço, cultive as células durante a noite para permitir que a infecção se propague após a incubação durante a noite.

Lave as células com 100 microlitros de 1%B-S-A-P-B-S. Depois que as células forem lavadas, adicione 100 microlitros por poço de 1% para formaldeído e incube as placas por cinco minutos em temperatura ambiente para fixar as células Em seguida, lave com 100 microlitros por poço de 1% BSAP e incube as células por mais 30 minutos para bloqueio. Uma vez que as células tenham sido bloqueadas, adicione 50 microlitros por poço de anticorpo antiviral primário M dois diluído em um a 1000 e incube as placas por uma hora em temperatura ambiente para corar qualquer proteína viral presente após a incubação, lave as células três vezes em 1%B-S-A-P-B-S e incube-as com 100 microlitros por poço de anticorpo secundário conjugado com corante infravermelho em uma diluição de um a 200 por uma hora em temperatura ambiente No escuro, uma vez que as células estejam manchadas, lave-as três vezes como antes.

Em seguida, posicione as placas na plataforma de vidro de leitura do scanner infravermelho Licor Odyssey. Selecione a configuração da placa de 96 poços no leitor usando o software Licor Odyssey. Identifique os alvéolos de controlo negativo em branco e, em seguida, quantifique a fluorescência de toda a placa.

Use a ferramenta de forma automática para desenhar a região de interesse ou ROI no meio de um teste. Bem, use o ROI de um controle negativo. Bem, para definir o valor de fluorescência da linha de base para o ensaio, introduza as duas miras opostas fornecidas pelo software Odyssey no ROI para medir a intensidade da fluorescência no poço.

Em seguida, escaneie a placa usando o canal de 780 nanômetros para detecção e 680 nanômetros como comprimento de onda de referência. Uma vez que o comando read tenha sido ativado, as intensidades fluorescentes em intervalos uniformes da ROI serão medidas. E então os pontos de dados coletados se integraram.

Um multiplicador de desvio padrão determinará o nível de sinal sobre a linha de base incluída no ROI, certifique-se de selecionar a opção de intensidade integrada para cálculos, pois ela representa o volume líquido de pixels para áreas definidas, independentemente do tamanho. A fluorescência de fundo será quantificada a partir dos controles infectados simulados e será usada para estimar a intensidade integrada em poços de teste. A fluorescência infravermelha de poços duplicados contendo diluições seriais de vírus titulados é usada para construir uma curva padrão.

A curva padrão pode então ser usada para determinar os títulos de fluido de LBA de camundongos infectados. Neste experimento, um aumento significativo na carga viral foi observado no segundo e quarto dia. O vírus pós-infecção foi eliminado no dia 10, conforme mostrado aqui.

Os títulos virais medidos usando este ensaio se correlacionam bem com a perda de peso do camundongo após a infecção. Esta técnica também pode ser aplicada a amostras humanas. Aqui é mostrada uma quantificação do vírus H one N one de um swab nasal humano.

O limite de detecção aqui é de 10 elevado à terceira TCID ou dose infecciosa de cultura de tecidos. Depois de assistir a este vídeo, você também tem uma boa compreensão de como estimar o título do vírus influenza usando o ensaio baseado em matriz infravermelha. A demonstração visual dessa técnica é fundamental porque o uso do gerador de imagens corp pode ser difícil e isso ajudará a simplificar e demonstrar nossos métodos para quantificar os títulos virais em uma placa de 96 ou 384 poços.

E, finalmente, não se esqueça de que trabalhar com vírus pode ser extremamente perigoso e precursores como equipamentos de proteção individual devem sempre ser levados durante a realização deste procedimento.