Name: Alta capacidade método de detecção de vírus Influenza (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: Aprenda a quantificar titulações virais de influenza em camundongos infectados usando imagem infravermelha com alta sensibilidade. Este método utiliza fluido de lavagem broncoalveolar e células MDCK para detecção precisa do vírus H1N1.

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Este trabalho é apoiado em parte NIH concede R01 A1064826-01, Sub-19 AI062627-01, NO1-HHSN26600500032C (para SM). Agradecemos a nossos membros de laboratório para discussão e ajuda técnica, Tina Heil, pela revisão crítica do manuscrito. Gostaríamos de agradecer a David Bina, Milwaukee Departamento de Saúde Laboratório de vírus cultura e PCR.

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Não temos nada a divulgar.

O surto recente epidemia de gripe aviária no Sudeste Asiático e um medo global da pandemia de gripe suína impor enormes preocupações para a saúde e segurança públicas. Enfoque crítico tem se dedicado na geração de vacinas para as estirpes existentes e mais recentes do vírus da gripe. Disponibilidade de rápidas tecnologias de alta capacidade para a detecção precisa e precisos cálculos título viral será tremendamente melhorar o tratamento. As técnicas mais comumente usados ​​empregadas para calcular título de vírus incluem ensaios de placa formadoras e influenza de hemaglutinação. O ensaio de placas formando foi desenvolvido para estimar os títulos de bacteriófagos e foi aprovado por Renato Dulbecco para calcular animais títulos virais 4. Para executar este ensaio, 10-de dobragem diluições de estoque de influenza ou espécimes animais, tais como líquido de LBA são preparadas e alíquotas de 0,1 ml são inoculadas em a monocamada de células MDCK em 6-bem placas. O vírus é permitido para adsorver sobre as células MDCK seguidos por o anúnciodição de um meio nutriente e de agarose. Durante a incubação, as células originais infectados liberar progênie viral que se espalhou apenas às células vizinhas. O efeito citopatogénico da infecção por influenza viral produz uma zona circular de células infectadas chamado de uma placa bacteriana. Cada placa bacteriana é, presumivelmente, formado após infecção de uma única célula com uma única partícula do vírus seguido pela replicação do vírus. Contraste entre as células vivas e das placas de pode ser reforçada por corantes, tais como violeta de cristal. Uma grande desvantagem deste ensaio é a falta de reprodutibilidade e enormes variações dentro de experimentos. Outro ensaio usado para determinar o título de influenza viral é a ensaio de hemaglutinação. A proteína presente hemaglutinina na superfície do vírus da gripe de forma eficiente liga-se a N-acetilneuramínico-ácido contendo proteínas sobre de mamíferos e de aviária células vermelhas do sangue 1. Esta interação entre o vírus da gripe e os eritrócitos leva a aglutinação sob a forma de uma treliça. O lEvel de aglutinação é usado para estimar o título de o vírus da gripe em amostras de teste. Ensaio de aglutinação eritrocitária é utilizada apenas para determinar a titulação de um vírus conhecido e não puder ser usadas para propósitos identificação da estirpe. Uma vez que este ensaio não faz diferença entre o ao vivo e os vírus de mortas, é difícil para se obter um cálculo exacto da os títulos virais. Atuais diagnósticos clínicos de infecções de gripe são baseados em testes sorológicos, a reação em cadeia da polimerase, imunofluorescência direta e amostra de cultura de células 1,6. O novo método descrito aqui também tem clínica e laboratorial potencial de diagnóstico. Influenza detecção kits Directigen FLU-A. (BD Biosciences, San Jose, CA) e BinaxNow (Binax, Inc., Scarborough, ME) ensaio de imunocromatografia uso para detectar o antígeno viral, como nucleoproteína 7 Usando estes kits, a detecção de vírus pode ser alcançada dentro de 15 min; no entanto, todas as amostras negativas tem que ser s ainda maiscreened pelo método de cultura de células. Vários estudos também relataram baixa sensibilidade desses kits, particularmente, quando a infecção foi leve ou baixo 8. Em nosso método, nós consistentemente detectar preço tão baixo quanto 100 PFU de vírus. Isto sugere a nossa técnica é útil na detecção de vírus H1N1 em amostras clínicas, mesmo quando a infecção é leve. Um método de fluorescência-Based para detectar antígenos virais tem sido relatada, onde ou tomas de aspirado de secreção nasofaríngea foram diretamente analisados ​​ou foram inoculados em uma monocamada de células suscetíveis para a multiplicação do vírus e análises subseqüentes 9. No entanto, estes métodos estão limitados para fins de diagnóstico e não são adequados para os cálculos de título de vírus. Q-PCR ajuda a identificar a presença de RNA viral e não consegue estimar o grau de infecciosidade do vírus vivos. Comparado a esses ensaios, IR sistema de ensaio à base de corantes vai ajudar na detecção e enumeração título viral em amostras clínicas e laboratoriais. Em caso de surto de influenza, écrítico para diagnosticar milhares de amostras em um período de tempo curto. Nosso método baseado em uma placa de 384 poços e scanner IR pode digitalizar 6 placas em um tempo (&gt; 2.000 amostras), portanto, oferecendo uma maior vantagem sobre outros métodos diretos fluorescentes. Viabilidade de processamento rápido de milhares de amostras clínicas poderiam reduzir a variabilidade teste comprimento, de tempo de ensaio e os custos. O uso de um anticorpo M2-específico oferece a vantagem de ser independente diferenças de estirpes em proteínas H e N. A proteína M2-é relativamente conservada em cepas de a maioria dos de influenza que infectam os seres humanos. Se os anticorpos específicos para as manchas que circulam são combinados com o nosso sistema de uma pode medir tanto o título de o de vírus e de identificar a estirpe. No entanto, uma vez que M2 é o alvo para os fármacos que Amantadine-like, os mutantes pode surgir que poderia alterar o sítio de ligação para o mAb usados ​​aqui. Isto representa uma limitação potencial para este sistema em indivíduos que estão sendo tratados por essas drogas. Múltiploensaios são usados ​​para enumerar os títulos de influenza em amostras de teste. Para calcular vírus da titulação, a dose de cultura 50% de tecido infecciosa (TCID 50) e de ovos alantóide fluido baseados em ensaios de são amplamente utilizados 1,10. Contudo, as necessidades de vários dias fazer estes métodos menos confiáveis. Além disso, em estes métodos de cálculos baseados sobre a alteração de 50% no número de placas de fornecer teóricas, mas, não precisas titulações virais. Placa formando ensaios podem ser realizados dentro de 96 horas, no entanto, a falta de reprodutibilidade é uma grande preocupação em cálculos título viral. A presente técnica descrita aqui tem várias vantagens distintas. Primeiro, é uma técnica altamente reprodutível e com resultados consistentes. Em segundo lugar, cálculos título viral são baseados em quantificação simples de intensidades de fluorescência que são comparados contra definidas curvas padrão. Em terceiro lugar, dois ou mais anticorpos primários pode ser usado para diagnosticar múltiplos sorotipos em uma dada amostra. Além disso, IR dye-conjugados anticorpos têm minimal autofluorescência e têm sido utilizados para a célula de imagem 11. UV ou visual de radiação (300-600 nM) resulta em autofluorescência celular elevada devido à presença de altos quânticos rendendo fluoróforos endógenos. Estes incluem aminoácidos aromáticos, Lipo-pigmentos, nucleotídeos piridínicos (NADPH), elastina, colágeno e coenzimas flavina. Esta propriedade intrínseca de células faz com que seja difícil de utilizar estas fontes de radiação como sondas para quantificar a expressão de proteínas específicas. Em contraste, quase IR corantes excitar e emitem entre 670-1000 nm. Moléculas hospedeiras Muitos celulares e hidrocarbonetos poliaromáticos não excitar menos este comprimento de onda e devido a espalhamento de luz reduzida, emitem fluorescência de fundo extremamente baixa. Além disso, a janela entre o plano de fundo e de detecção específico é vastamente melhorada devido a um coeficiente de extinção elevado de os fluoróforos perto de-IR. Fotoestabilidade, relação sinal-para-ruído superior, é extremamente relevante na quantificação dos títulos da reação virais. Use de microflcâmaras uidic irá automatizar o processo de seleção por meio de controles robóticos, e que pode nos permitir testar altamente contagiosas amostras clínicas com facilidade. Assim, a utilização de perto de-IR corantes nestes métodos é o ideal e altamente confiável para enumerar os títulos virais em amostras de tecido.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Albumina de soro bovino </td><td> Atlanta Biologicals </td><td> S11750 </td><td></td></tr><tr><td> PR8 vírus </td><td></td><td></td><td> De Dr. Thomas Moran M </td></tr><tr><td> Goat anti-mouse IRDye @ 800 </td><td> LI-COR Biosciences </td><td> 926-32210 </td><td> 1:200 de diluição </td></tr><tr><td> LI-COR Odyssey IR scanner </td><td> LI-COR-biociências </td><td> 9201-01 </td><td></td></tr><tr><td> 384-poços de placa de fundo plano </td><td> Nalge Nunc internacional </td><td> 164730 </td><td></td></tr><tr><td> 96-poços de placa de fundo plana </td><td> Nalge Nunc internacional </td><td> 165305 </td><td></td></tr><tr><td> Meio DMEM </td><td> InvitrOgen </td><td> 11965126 </td><td></td></tr><tr><td> Meio RPMI </td><td> Invitrogen </td><td> 11875135 </td><td></td></tr><tr><td> O bicarbonato de sódio </td><td> Invitrogen </td><td> 25080 </td><td></td></tr><tr><td> L-glutamina-100x </td><td> Invitrogen </td><td> 25030 </td><td></td></tr><tr><td> Trypson-EDTA </td><td> Invitrogen </td><td> R001100 </td><td></td></tr><tr><td> Piruvato de sódio </td><td> Invitrogen </td><td> 11360070 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-M-2 anticorpo </td><td></td><td></td><td> De Dr. Thomas Moran M </td></tr><tr><td> Anti-NP mAb </td><td> CDC </td><td> V2S2208 </td><td> Obtido com um MTA </td></tr></tbody></table>

alta capacidade método de detecção de vírus influenza

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

Vírus influenza é um patógeno respiratório que faz com que um elevado grau de morbidade e mortalidade a cada ano em múltiplas partes do mundo. Portanto, o diagnóstico preciso da cepa infectante e high-throughput screening rápido de um grande número de amostras clínicas é fundamental para controlar a propagação de infecções pandemia. Atuais diagnósticos clínicos de infecções de gripe são baseados em testes sorológicos, a reação em cadeia da polimerase, imunofluorescência direta e 1,2 espécime de cultura de células. Aqui, nós relatamos o desenvolvimento de uma técnica de romance de diagnóstico usado para detectar os vírus da gripe ao vivo. Nós utilizado o humano do mouse-adaptado A/PR/8/34 (PR8, H1N1) vírus 3 para testar a eficácia dessa técnica usando células MDCK 4. Células MDCK (10 4 ou 5 x 10 3 por poço) foram cultivados em 96 - ou placas de 384-bem, infectadas com PR8 e proteínas virais foram detectadas utilizando anti-M2 seguido por um IR dye-conjugada seganticorpo secundário. M2 5 e hemaglutinina 1 são duas proteínas marcadoras principais usados ​​em muitas diferentes ensaios de diagnóstico. Que empregam IR-dye-conjugados anticorpos secundários minimizou a autofluorescência associada com outras corantes fluorescentes. O uso de anticorpo anti-M2 permitiu-nos para usar a intensidade antígeno-específica de fluorescência como uma métrica direta de quantidade viral. Para enumerar a intensidade de fluorescência, foi utilizado o LI-COR Odyssey baseada scanner IR. Este sistema usa dois de canal detecções de baseados em laser IR para identificar fluoróforos e diferenciá-los a partir de ruído de fundo. O canal de primeira excita em 680 nm e emite menos 700 nm, para a ajudar a quantificar o plano de fundo. O segundo canal detecta fluoróforos que excitam a 780 nm e emissão a 800 nm. Digitalização de PR8-infectados células MDCK em o scanner IR indicado um de fluorescência título de-dependente viral brilhante. Uma correlação positiva da intensidade de fluorescência para título de vírus de partida a partir de 10 2 -10 5 PFU poderia ser conconsistentemente observada. Positividade Minimal, mas detectável consistentemente visto com 10 2 -10 3 PFU PR8 os títulos virais demonstraram a alta sensibilidade das tinturas de perto de-IR. A relação sinal-para-ruído foi determinada por comparando-se os mock-infectados ou isotipo de anticorpo-tratados com células MDCK. Usando as intensidades de fluorescência a partir de 96 - ou formatos de placa 384-bem, nós construídas curvas de titulação padrão. Nestes cálculos, a primeira variável é o título viral enquanto a variável segundo é a intensidade de fluorescência. Portanto, nós utilizamos a distribuição exponencial para gerar uma curva de fit-para determinar a relação polinomial entre os títulos virais e intensidades de fluorescência. Colectivamente, podemos concluir que IR à base de corantes sistema de detecção de proteína pode ajudar a diagnosticar infecção cepas virais e enumerar precisamente o título dos patógenos infectantes.

Este método descreve o uso de sistema de imagem de Infravermelhos corante baseada em para a detecção de A H1N1 no bronchioalveolar o lavado de fluido (BAL) de camundongos infectados em uma alta sensibilidade. Esta metodologia pode ser realizado em um 96 - ou 384-bem prato, requer &lt;volume de 10 uL de material de teste e tem o potencial para a triagem concomitante de agentes patogénicos múltiplos.

Alta capacidade método de detecção de vírus Influenza

O vírus da influenza é um patógeno respiratório que causa um alto grau de morbidade e mortalidade todos os anos em diversas partes do mundo. Portanto, ...

O objetivo geral deste procedimento é quantificar de forma eficiente as titulações virais da gripe nas vias aéreas de camundongos infectados. Primeiramente, os camundongos são inoculados por via intranasal com o vírus da gripe em momentos selecionados após a infecção.Os M são sacrificados e o lavado broncoalveolar ou fluido BAL é coletado. Em seguida, o fluido BAL é usado para infectar células MDCK. As células infectadas podem então ser coradas para detectar a presença de proteínas virais utilizando anticorpos primários específicos, seguidos por anticorpos secundários conjugados com infravermelho.Os sinais de infravermelho são lidos utilizando o leitor Lycor Odyssey, e o software Odyssey pode ser usado para determinar os títulos virais. Utilizando uma curva padrão, pode-se obter a determinação quantitativa dos títulos virais. As principais vantagens desta técnica em relação aos métodos existentes são a quantificação precisa dos títulos virais, a reprodutibilidade e o pequeno volume necessário para realizar este ensaio.As implicações desta técnica podem ser estendidas para o diagnóstico e terapia de diversas doenças virais respiratórias, pois ela pode ser usada para quantificar títulos virais em amostras clínicas após este procedimento. Outros métodos, como a QPCR, podem ser realizados para responder perguntas adicionais, como o número de cópias virais. Ao tentar aplicar esta técnica, é importante lembrar-se de verificar o vírus controle do padrão de título após este desenvolvimento.Esta técnica abre caminho para que o pesquisador na área da lógica viral explore a titulação viral ou a detecção de proteínas virais em amostras clínicas. Uma vez dominada, essa técnica pode ser realizada em 17 horas. Realiza-se a infecção precisa de camundongos por via intranasal com 5.000 unidades formadoras de placas ou PFU do vírus influenza PR8 em 30 microlitros de PBS estéril ou com PBS sozinho como controle negativo para a coleta de líquido de lavagem broncoalveolar de animais eutanasiados; primeiramente, abre-se a cavidade torácica e faz-se uma incisão de um centímetro paralela à traqueia para expô-la com tesoura estéril fina.Faça uma pequena incisão na traqueia, infunda a traqueia com 0,5 mililitros de PBS contendo 1% de BSA e aspire suavemente o fluido de lavagem. Armazene os fluidos de LBA a menos 20 graus centígrados para quantificar os títulos virais nos fluidos de lavagem. Primeiro, cultive 5 milhões de células MDCK em 20 mililitros de RPMI completo em um frasco T75 durante a noite a 37 graus centígrados; no dia seguinte, recolha as células e plaque-as em uma placa de 96 poços preta com fundo óptico plano, com 10.000 células por poço.Em seguida, incubar a placa durante a noite a 37 graus centígrados após a incubação. Aspirar suavemente o sobrenadante e lavar as células duas vezes em DMEM completo, mas sem soro, contendo 0,2% de BSA em vez de FBS. Após a lavagem das células, adicionar 50 microlitros de fluido BAL ou 50 microlitros de uma suspensão contendo uma concentração conhecida de vírus por poço.Em seguida, adicione 50 microlitros por poço de DMEM, meio contendo tripsina tratada com TPCK a 0,2 microgramas por mililitro, para potencializar a adesão, entrada e replicação viral. Incube as células por uma hora a 37 graus centígrados para permitir a absorção do vírus. Em seguida, adicione 100 microlitros de RPMI completo contendo FBS a cada poço e cultive as células durante a noite para permitir a propagação da infecção após a incubação noturna.Lave as células com 100 microlitros de B-S-A-P-B-S a 1%. Após a lavagem das células, adicione 100 microlitros por poço de paraformaldeído a 1% e incube as placas por cinco minutos à temperatura ambiente para fixar as células. Em seguida, lave com 100 microlitros por poço de B-S-A-P-B-S a 1% e incube as células por mais 30 minutos para bloqueio. Após o bloqueio das células, adicione 50 microlitros por poço do anticorpo primário antiviral M dois diluído na proporção de 1:1000 e incube as placas por uma hora à temperatura ambiente para marcar qualquer proteína viral presente. Após a incubação, lave as células três vezes em B-S-A-P-B-S a 1% e incube-as com 100 microlitros por poço de anticorpo secundário conjugado com corante infravermelho, diluído na proporção de 1:200, por uma hora à temperatura ambiente, no escuro. Após a marcação das células, lave-as três vezes como anteriormente.Em seguida, posicione as placas na plataforma de leitura do scanner de infravermelho Licor Odyssey. Selecione a configuração para placa de 96 poços no leitor utilizando o software Licor Odyssey. Identifique os poços de controle negativo em branco e, em seguida, quantifique a fluorescência de toda a placa.Use a ferramenta de formas automáticas para desenhar a região de interesse ou ROI no centro de um teste. Utilizaremos a ROI de um controle negativo para definir o valor de fluorescência de base para o ensaio e, em seguida, introduziremos as duas linhas de mira opostas fornecidas pelo software Odyssey dentro da ROI para medir a intensidade da fluorescência ao longo do poço.Em seguida, escaneie a placa utilizando o canal de 780 nanômetros para detecção e 680 nanômetros como comprimento de onda de referência. Após a ativação do comando de leitura, as intensidades fluorescentes em intervalos uniformes da ROI serão medidas. Em seguida, os pontos de dados coletados serão integrados.Um multiplicador do desvio padrão determinará o nível de sinal acima da linha de base que será incluído na ROI; certifique-se de selecionar a opção de intensidade integrada para os cálculos, já que ela representa o volume líquido de pixels em áreas definidas, independentemente do tamanho. A fluorescência de fundo será quantificada a partir dos controles não infectados e será utilizada para estimar a intensidade integrada nas poças de teste. A fluorescência no infravermelho de poças duplicadas contendo diluições seriadas de vírus titulado é utilizada para construir uma curva padrão.A curva padrão pode então ser usada para determinar os títulos do fluido de lavagem broncoalveolar de camundongos infectados. Neste experimento, um aumento significativo na carga viral foi observado no segundo e quarto dia. O vírus pós-infecção foi eliminado até o décimo dia, conforme mostrado aqui.Os títulos virais medidos utilizando este ensaio apresentam boa correlação com a perda de peso em camundongos após a infecção. Esta técnica também pode ser aplicada a amostras humanas. Aqui é mostrada uma quantificação do vírus H1N1 obtido de um swab nasal humano.O limite de detecção aqui é de 10 elevado à terceira dose infecciosa em cultura de tecidos, ou TCID. Após assistir a este vídeo, você também terá uma boa compreensão de como estimar a titulação do vírus da gripe utilizando um ensaio baseado em corante infravermelho. A demonstração visual desta técnica é fundamental, pois o uso do corp imager pode ser difícil, e isso ajudará a simplificar e demonstrar nossos métodos para quantificar titulações virais em uma placa de 96 ou 384 poços.E, finalmente, não se esqueça de que trabalhar com vírus pode ser extremamente perigoso e precauções como o uso de equipamentos de proteção individual devem sempre ser adotadas ao realizar este procedimento.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Resgate de vírus influenza A partir de DNA plasmídeo é uma técnica básica e essencial experimental que permite aos pesquisadores a gripe para gerar vírus recombinante para estudar os múltiplos aspectos da biologia do vírus da gripe, e para ser usado como vetores potenciais ou vacinas.

Geração de recombinante do vírus Influenza de DNA plasmidial

ampliPHOX tecnologia de detecção colorimétrica é apresentado como uma alternativa barata para detecção de fluorescência para microarrays. Com base na fotopolimerização, ampliPHOX produz spots polímero sólido visível a olho nu em apenas alguns minutos. Resultados são então fotografada e automaticamente interpretados com um pacote de software simples, mas poderosa.

ampliPHOX Detecção colorimétrica em um Microarray de DNA para Influenza

Este estudo descreve o diagnóstico de influenza aviária em aves selvagens usando um sistema rRT-PCR portátil. O método aproveita liofilizadas reagentes para a tela aves selvagens em um ambiente não-laboratorial, típico de um cenário de surto. Uso de ferramentas moleculares oferece alternativas precisas e sensíveis para o diagnóstico rápido.

Diagnóstico rápido de vírus da gripe aviária em aves selvagens: o uso de um Portable rRT-PCR e liofilizados Reagentes no Campo

Neste vídeo, discutimos a correlação entre o CIT50 e a multiplicidade de infecções virais. As células infectadas pelo vírus apresentam efeitos citopáticos, causando sua morte e desprendimento do microeletrodo de ouro, o que, por sua vez, reduz a impedância.

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Fabricação de chips microfluídicos e método para detectar a gripe

Usando uma estratégia de microarray de glicano impresso, um ensaio convencional de placa de 96 poços foi miniaturizado para análise da avidez e especificidade da hemaglutinina do vírus influenza A para receptores contendo ácido siálico.

A Miniaturized Glycan Microarray Ensaio para a Avaliação de avidez e especificidade do Hemaglutininas vírus da gripe A

Descreve-se um ensaio rápido, com base molecular da gripe A e B. O ensaio detecta Influenza cada alvo dentro de 15 min, utilizando amplificação isotérmica com iniciadores específicos de influenza, seguido de detecção do alvo com as sondas farol molecular. O ensaio de Influenza A e B é de fácil utilização e necessário hands-on tempo mínimo para executar.

Rápida Detecção Molecular e diferenciação de Influenza vírus A e B

testes de alto rendimento de DNA e RNA patógenos base por nanoescala PCR é descrito usando um canino sindrômica e painel de PCR respiratória equina.

Detecção de alto rendimento de patógenos respiratórios em espécimes animais por Nanoscale PCR

Este estudo descreve uma   -Imagem baseada ensaio de micro-neutralização para analisar as relações antigênicas entre vírus. O protocolo emprega um digitalizador de mesa e tem quatro passos, incluindo titulação, a quantificação de titulação, neutralização, e quantificação de neutralização. O ensaio funciona bem com pdm09 corrente circulante vírus influenza A (H1N1), A (H3N2), e B vírus.

Optimização de um Micro-quantitativa Ensaio de neutralização

Descreve-se a utilização de um ensaio de inibição da neuraminidase à base de fluorescência fenotípica para avaliar a susceptibilidade de vírus influenza A e B para a classe dos inibidores da neuraminidase de medicamentos antivirais.

-Fluorescência baseado Neuraminidase Ensaio de Inibição Para avaliar a susceptibilidade do vírus influenza A de neuraminidase Inibidor de Classe Antivirais

Aprenda a quantificar titulações virais de influenza em camundongos infectados usando imagem infravermelha com alta sensibilidade. Este método utiliza fluido de lavagem broncoalveolar e células MDCK para detecção precisa do vírus H1N1.

Alta capacidade método de detecção de vírus Influenza

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