Optimização de um Micro-quantitativa Ensaio de neutralização

O objetivo geral deste ensaio de microneutralização é caracterizar todos os tipos de vírus influenza circulantes atuais e a atividade de anticorpos e medições antivirais de maneira quantitativa, de alto rendimento e altamente sensível. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da virologia, como caracterização antigênica de vírus influenza, neutralização quantitativa de anticorpos e atividades antivirais. A principal vantagem dessa técnica é que ela caracterizou toda a população de células infectadas, incluindo placas visíveis e invisíveis e infecções unicelulares.

O ensaio de microneutralização será demonstrado pelo Dr. Yipu Lin, diretor assistente do Centro Colaborador da OMS para Influenza em Londres. O nível de biossegurança, ou BSL, para o protocolo a seguir é BSL 2 para vírus da gripe sazonal e BSL 3+ para possíveis vírus da gripe pandêmica. Para começar, alíquota células suficientes em placas de 96 poços.

Incube as células a 37 graus Celsius e 5% de CO2 por dois a três dias para atingir a confluência. Usando etanol a 70%, esterilize uma lavadora de placas de vários poços e use PBS ou VGM para enxaguá-la. Em seguida, use 200 microlitros de meio de crescimento de vírus, ou VGM, para lavar as células confluentes.

Aspire o VGM das células e adicione imediatamente 50 microlitros de VGM a cada poço. Em seguida, adicione 900 microlitros de VGM a cada um dos seis tubos estéreis. Em seguida, pipete 100 microlitros de vírus no primeiro tubo e misture bem.

Prepare diluições seriadas do vírus começando com o primeiro tubo, trocando as pontas entre cada diluição. Adicione 50 microlitros de cada diluição de vírus, começando com a diluição mais alta, para duplicar poços de uma placa de 96 poços. Em seguida, coloque a placa a 37 graus Celsius por duas a três horas para permitir que o vírus infecte as células.

Depois de preparar a cobertura de acordo com o protocolo de texto, remova o inóculo dos poços. Em seguida, adicione 200 microlitros de cobertura a cada poço e incube a 37 graus Celsius durante a noite sem ser perturbado. Adicione 200 microlitros de 4% de PFA gelado em PBS A aos poços e incube a quatro graus Celsius por 30 minutos ou temperatura ambiente por 20 minutos.

Após a incubação, aspire o PFA e use 200 microlitros por poço de PBS A para lavar a placa duas vezes. Adicione 100 microlitros de tampão de permeabilização à placa e incube em temperatura ambiente por 30 minutos. Em seguida, use PBS A para lavar o prato duas vezes.

Em seguida, adicione 50 microlitros por poço de um anticorpo monoclonal de camundongo contra influenza tipo A aos poços e incube em temperatura ambiente com agitação por uma hora. Após a incubação, use 300 microlitros de tampão de lavagem para lavar o poço três vezes. Em seguida, adicione 50 microlitros de um anticorpo secundário de cabra conjugado com HRP às amostras e incube em temperatura ambiente por uma hora.

Depois de lavar os poços três vezes como antes, adicione 50 microlitros de substrato por poço e incube em temperatura ambiente por 30 minutos ou até que o desenvolvimento de uma cor azul seja claramente visível. Para interromper a reação, use 200 microlitros de água destilada para lavar os poços duas vezes. Em seguida, após secar a placa ao ar, guarde-a em local escuro.

Coloque uma placa de poço na área de varredura de um scanner de mesa, usando o limite de posição em forma de L para garantir que um local de imagem ideal e repetível possa ser obtido. Digitalize a placa usando as configurações mostradas aqui. Em seguida, execute o software leitor de placas de poço para calcular a concentração de vírus necessária clicando no botão Carregar imagem para carregar uma imagem.

Em seguida, na guia limite global, deslize a barra vermelha no histograma para ajustar o limite de amostragem. Em seguida, clique no botão de atualização para examinar o efeito em uma imagem. Agora, marque a caixa Calcular neutralização/titulação.

Clique no botão Amostragem para quantificar a população de células infectadas, ou ICP. Em seguida, quando solicitado, clique no botão Salvar para salvar os resultados da amostragem. Para obter os resultados da titulação, carregue ou insira o mapa de definição da placa do poço.

Em Titulação:População de vírus ideal, indique o limite. Selecione a guia Processo de titulação para calcular os resultados da titulação. Em seguida, verifique os resultados da titulação antes de clicar no botão Salvar e Fechar para salvar os resultados.

Consulte o suplemento S1 para obter instruções mais detalhadas do software. Para realizar a neutralização do vírus, prepare a monocamada celular com dois ou três dias de antecedência. Em seguida, adicione 50 microlitros de VGM a cada poço da placa.

Use as colunas 11 e 12 para o controle de vírus e controle de células, respectivamente. Adicione alíquotas de 50 microlitros de uma diluição em 20 da enzima destruidora do receptor, ou RDE, soro tratado à primeira linha de colunas de um a 10. Realize diluições seriais duplas transferindo 50 microlitros da linha A para a linha H e descartando 50 microlitros da linha H. Em seguida, adicione 50 microlitros de diluente a cada poço da coluna de controle da célula.

Adicione 50 microlitros do vírus a cada poço da placa, exceto para a coluna de controle celular. Incube a placa a 37 graus Celsius por duas a três horas. Em seguida, remova o inóculo e adicione a cobertura a cada poço.

Incube a placa durante a noite a 37 graus Celsius sem ser perturbada. Em seguida, fixe e manche as placas conforme demonstrado anteriormente neste vídeo. Para quantificar a neutralização, coloque uma placa de poço na área de varredura de um scanner de mesa, conforme demonstrado anteriormente neste vídeo.

Digitalize a placa e execute o software leitor de placas de poços para calcular os títulos virais necessários como antes. Depois de carregar ou inserir o mapa da placa do poço, em Neutralização:Dedução de Infecção, indique o limite. Em seguida, selecione Processo de neutralização para calcular os títulos.

Por fim, verifique os títulos e clique no botão Salvar e Fechar para salvar os resultados da neutralização. Aqui são mostrados os resultados da titulação de experimentos recentes de caracterização antigênica de oito vírus de entrada com diluições entre 1,0 vezes 10 elevado a negativo e 1,0 vezes 10 elevado a seis negativos. O gráfico ilustra que os ICPs diminuem com o aumento da diluição do vírus.

As curvas foram normalizadas contra os ICPs dos mesmos vírus que produziram infecções em todas as células dentro de um poço. Listadas nesta tabela estão as diluições de vírus que produziram 30% da saturação de ICP que foram escolhidas como a diluição de vírus de entrada para neutralização. Esta figura mostra os resultados de um experimento de neutralização usando um vírus de entrada contra cinco anti-soros.

O gráfico ilustra o processo de infecção com o aumento da diluição do soro. A população positiva normalizada no eixo vertical representa a razão de ICPs da resposta anti-soros correspondente em relação à ICP média do vírus de referência. Por fim, os títulos de neutralização foram determinados como os recíprocos das diluições do anti-soro correspondentes à redução de 50% da PIC.

Este ensaio se concentra na consistência, velocidade e sensibilidade de detecção, incluindo titulação quantificada de vírus de entrada, imagens de alto rendimento e processamento de dados. É econômico, fácil de usar e tem sido usado rotineiramente em estudos antigênicos virais.