Name: Optimização de um Micro-quantitativa Ensaio de neutralização (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 9 s
Description: Aprenda a otimizar um ensaio de micro-neutralização para caracterização antigênica de vírus influenza usando scanner de mesa. Este método quantitativo de alta sensibilidade permite analisar relações antigênicas entre cepas circulantes.

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Os autores agradecem ao Dr. M. Matrosovich por fornecer as linhagens celulares MDCK e MDCK-SIAT1 e à Roche Pharmaceuticals por fornecer o carboxilato de oseltamivir. Também agradecemos à Dra. Anne Weston por sugestões valiosas sobre o manuscrito. Este estudo dependeu da valiosa colaboração dos Centros Nacionais de Influenza da OMS e dos CCs da OMS dentro do GISRS da OMS, que forneceram os vírus influenza usados. Este trabalho foi financiado pelo Conselho de Pesquisa Médica por meio do Programa U117512723.

NOTA: O nível de biossegurança (BSL) para o seguinte protocolo é BSL 2 para vírus da gripe sazonal e BSL 3+ para possíveis vírus de gripe pandêmica. titulação virai é necessária antes de uma experiência de neutralização para decidir a concentração viral do controlo viral (VC). Titulação 1. Vírus NOTA: Dependendo do número de vírus e o número de duplicações, uma placa bem pode ser configurado com as seguintes flexibilidades: (1) A diluição virai podem ser dispostos ao longo de qualquer das filas ou das colunas (Figura 1). Cada vírus deve ocupar uma linha / coluna separada. (2) O aumento de diluição virai é flexível, mas deve começar com a maior concentração viral no canto superior esquerdo. (3) Não há nenhuma restrição sobre o número de duplicatas. NOTA: Madin Darby de rim canino (MDCK) e MDCK-SIAT1 células (SIAT) foram gentilmente cedidas pelo Dr. M. Matrosovich, Marburg, Germuitos 10. SIAT células são células MDCK transfectadas estavelmente com o CMP-N-acetilneuraminato humano: gene da p-galactósido α-2,6-sialiltransferase para a expressão aumentada de ácido siálico (SA) oligossacáridos α2-6Gal-terminados. <ol><li> Células alíquotas suficientes MDCK ou células MDCK-SIAT 8 em placas de 96 poços (200 ul / poço). Incubar as células a 37 ° C com 5% de CO 2 durante 2 ou 3 dias para atingir confluência. Propagar as células em DMEM suplementado com soro inactivado pelo calor 10% de vitelo fetal (FCS) e antibióticos (penicilina 100 U / ml e 100 ug / ml de estreptomicina). Incubar as células a 37 SIAT ° C com 5% de CO 2 e 1 mg / ml de sulfato de G418. NOTA: O factor de diluição é dependente de experiência e a linha celular utilizada. A monocamada de células confluentes deve ser (ou seja, sem parede celular ou esboço visível para as células MDCK e um esquema bem-embalados para as células MDCK-SIAT1) no momento da inoculação com o vírus. Exemplos de diluições com base ema subcultura de frascos confluentes de células MDCK ou células MDCK-SIAT1 são dadas na Tabela 1. </li><li> Lavam-se as células 3 vezes com 200 ul de meio de crescimento do vírus (VGM) por poço. Esteriliza-se o lavador de placas de multicamadas com 70% de EtOH durante 30 minutos, e, em seguida, lave-o em solução salina estéril tamponada com fosfato (PBS) ou VGM antes da lavagem. </li><li> Aspirar o VGM e imediatamente adicionar 50 ul de VGM a cada poço. </li><li> Adicionar 900 ul de VGM para cada um dos 6 tubos estéreis (ou menos, dependendo do número de vírus de teste e duplicados). Pipete 100 pi de vírus para o primeiro tubo, misturar bem, e diluir em série, mudando as pontas entre cada diluição. Repita para cada vírus para ser titulada. NOTA: Isto vai dar diluições de vírus de 10 -1 a 10 -6. </li><li> Adicionar 50 ul de cada diluição do vírus, a partir da mais alta diluição (1 x 10 -5 na Figura 1), para poços duplicados (colunas 9 e 10 na Figura 1) de uma 9placa de 6 poços. </li><li> Colocar a placa a 37 ° C durante 2-3 horas para permitir que o vírus para infectar as células. NOTA: uma incubação de 2 a 3 horas é necessário para assegurar que os vírus no inoculo ter tempo suficiente para alcançar a monocamada. </li><li> Prepare a sobreposição (10 ml / placa) NOTA: A sobreposição é composta por 5 ml de 2x DMEM, tripsina (2 ug / ml concentração final), 20 ul de 1 mg / ml e 5 ml de fibras de algodão de celulose (ver a Lista de Materiais). </li><li> Remover o inoculo. </li><li> Adicionar a sobreposição (200 ul a cada poço). Incubar durante a noite a 37 ° C, sem ser perturbado. NOTA: O brotamento vírus ocorre após cerca de 4 horas, por isso, é importante que a placa não é perturbada após esse tempo. </li><li> Aspirar a sobreposição dos poços. </li><li> Adicionar gelada 4% de paraformaldeído em PBS A (200 ul / poço). Colocá-los a 4 ° C durante 30 min ou a temperatura ambiente durante 20 min. NOTA: PBS Um é natural do pH de solução salina tamponada com fosfato com 10 Gof NaCl, 0,25 g de KCl, 1,437 g de Na 2 HPO 4, 0,25 g de KH 2 PO 4, e 1 L de água destilada (consulte a lista de materiais). NOTA: O paraformaldeído é prejudicial quando inalado e pode causar queimaduras por ingestão. Há também uma evidência limitada de um efeito cancerígeno e pode causar sensibilização após contato com a pele. </li><li> Aspirar o paraformaldeído e lavar as placas duas vezes com PBS A (200 ul / poço). </li><li> Armazenar as placas em PBS A a 4 ° C para uso futuro, ou continuar com os seguintes passos. </li><li> Adicionar tampão de permeabilização (100 ul / poço). Deixe-o em temperatura ambiente por 30 min. </li><li> Lavar a placa duas vezes com PBS A (200 ul / poço). </li><li> Adicionar 50 ul de o primeiro anticorpo, o MAb de rato contra a influenza do tipo A (1: 1000 em tampão de ELISA), por cavidade. Incubar-la à temperatura ambiente durante 1 h (ou durante a noite a 4 ° C), com agitação. </li><li> Lavar 3 vezes em 100 ul de tampão de lavagem (0,05% de Tween 80 em PBS Um, v / v) PER bem. Incubar-la à temperatura ambiente durante 5 min entre as lavagens. Como alternativa, lave-o 3 vezes sem incubação com 300 ul por poço. </li><li> Adicionar 50 ul do segundo anticorpo, anticorpo de cabra anti-IgG de ratinho (H + L) conjugado com HRP (1: 1000 em tampão de ELISA), por cavidade. Incubar-la à temperatura ambiente durante 1 h, com agitação. </li><li> Lavar 3 vezes tal como descrito no passo 1.17. </li><li> Adicionar o substrato (50 ^ l / poço). Incubar-la à temperatura ambiente durante 30 min ou até que o desenvolvimento de uma cor azul é claramente visível. </li><li> Para parar a reacção, lava-se a placa duas vezes com 200 ul de água destilada por poço, incubando à temperatura ambiente durante 2 -3 min entre as lavagens. </li><li> Ar seco a placa e armazená-lo em um local escuro (por exemplo, envolvê-la em papel de alumínio). </li></ol> 2. Titulação quantificação <ol><li> Colocar uma placa bem na área de digitalização de um digitalizador de mesa, como mostrado na Figura 2a. Use o limite em forma de L posição deassegurar uma localização óptima e repetível imagiologia. NOTA: É possível imagem Duas placas de poços em uma varredura. </li><li> Digitalizar uma imagem. NOTA: As definições são apresentadas na Tabela 2. </li><li> Executar o software &quot;Wellplate Reader&quot; para calcular a concentração de vírus necessária (Figura 3). <ol><li> Clique no botão &quot;Carregar imagem&quot; para carregar uma imagem. Deslize a barra vermelha no histograma da guia &quot;Threshold global&quot; para ajustar o limite de amostragem. Clique no botão &quot;Update&quot; para examinar o efeito na imagem. </li><li> Marque a caixa &quot;Calcular Neutralização / titulação&quot;. Clique no botão &quot;Sampling&quot; para quantificar o ICP. Clique no botão &quot;Save&quot; para salvar os resultados de amostragem quando solicitado. NOTA: Após o processo de amostragem, uma nova janela chamada &quot;neutralização e titulação de cálculo&quot; aparece automaticamente se a caixa &quot;Calcular Neutralização / Titulação&quot; é assinalada. </li><li>De carga ou de entrada do mapa definição bem-placa. Indicam o limite (por exemplo, 30%) em &quot;Titulação: população de vírus óptima (%)&quot;. Selecione a aba &quot;processo de titulação&quot; para calcular os resultados da titulação. Confira os resultados da titulação. Clique no botão &quot;Save &amp; Close&quot; para salvar os resultados da titulação. NOTA: Consulte Suplementar S1 para a instrução mais detalhada sobre o software. Uma cópia do software sob medida está disponível mediante solicitação. NOTA: Normalmente, a melhor diluição do vírus para os rendimentos de ensaio de redução de placa cerca de 50% (20-85%) ICP do total de células dentro de cada poço 11. </li></ol></li></ol> Neutralização 3. Virus NOTA: Calcular o número de placas necessárias para o ensaio de neutralização. Cada placa pode acomodar um vírus e uma série de anti-soros. NOTA: Dependendo do número de anti-soros e o número de duplicações, uma placa bem pode ser configurado com the flexibilidades seguinte: (1) A diluição do soro podem ser dispostos ao longo de cada linha ou uma coluna (Figura 4). Cada soro deve ocupar uma linha ou coluna separada. (2) O aumento da diluição do soro é flexível, mas deve começar com a concentração mais alta de soro, no canto superior esquerdo de uma placa. (3) O número de duplicados equilibra o número de anti-soros. Mais duplicados pode ajudar a suavizar as variações experimentais. (4) O número de VC e o número de células de controlo (CC) duplicados são flexíveis, mas também deve ser em linhas ou colunas separadas. Espera-se que o número de repetições de VC é significativamente maior do que o dos anti-soros. <ol><li> Preparar a monocamada de células, tal como nos passos 1,1-1,3, 2 ou 3 dias de antecedência. </li><li> Adicionar 50 ul de VGM a cada poço da placa. </li><li> Use Colunas 11 e 12 para VC e CC, respectivamente. Adicionar 50 ul de aliquotas de 1:20 enzima destruidora de receptor (RDE) tenha sido tratada com soro para a primeira linha (A) de Columns 1-10. NOTA: Para cada combinação de vírus e soro, o ensaio é realizado em duplicado, de modo que uma placa pode, por exemplo, conter um vírus testados contra cinco soros. </li><li> Executar dois diluições em série por transferência de 50 uL da linha A para a linha H (colunas 1-10 na Figura 4) e descartando 50 ul da linha H. </li><li> Adicionar 50 ul de diluente para cada poço da coluna CC (coluna 12 na Figura 4). </li><li> Adicionar 50 ul do vírus a cada poço da placa, excepto para a coluna CC (colunas 1-11, linhas AH na Figura 4). </li><li> Incubar-lo a 37 ° C durante 2-3 h. Remover o inoculo. Adicionar a sobreposição (200 ul) a cada poço. Incubar durante a noite a 37 ° C, sem ser perturbado. Fix e manchar as placas como para a titulação do vírus (passos 1,11-1,22). </li></ol> 4. Neutralização Quantificação <ol><li> Colocar uma placa bem na área de digitalização de um scanner de mesa, como mostrado na Figure 2a. Use o limite em forma de L posição para garantir uma localização óptima e repetível de imagem. NOTA: É possível imagem Duas placas de poços em uma varredura. </li><li> Digitalizar a placa, tal como descrito na etapa 2.2. </li><li> Executar o software &quot;Wellplate Reader&quot; para calcular os títulos virais requeridas (Figura 3, passo 2.3). <ol><li> Clique no botão &quot;Carregar imagem&quot; para carregar uma imagem. Deslize a barra vermelha no &quot;Threshold global&quot; para ajustar o limite de amostragem. Clique no botão &quot;Update&quot; para examinar o efeito. </li><li> Marque a caixa &quot;Calcular Neutralização / titulação&quot;. Clique no botão &quot;Sampling&quot; para quantificar o ICP. Clique no botão &quot;Save&quot; para salvar os resultados de amostragem quando solicitado. NOTA: Após o processo de amostragem, uma nova janela chamada &quot;neutralização e titulação de cálculo&quot; aparece automaticamente se a caixa &quot;Calcular Neutralização / Titulação&quot; é assinalada. </li><li> De carga ou de entrada o bem-pmapa final. Indicam o limite (por exemplo, 50%) em &quot;Neutralização: dedução Infecção (%).&quot; </li><li> Seleccionar &quot;processo de neutralização&quot; para calcular os títulos. Confira os títulos e clique no botão &quot;Save &amp; Close&quot; para salvar os resultados de neutralização. NOTA: A neutralização é relatada como o recíproco da diluição mais elevada do soro pré-definido, com a redução ICP (tal como 50% ou 80%) contra o VC (a média da coluna 11 na Figura 4). Uma redução ICP 50% foi usado nos resultados representativos. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Neste estudo, descrevemos um ensaio MN baseada em imagem para quantificar as verdadeiras relações antigênicas entre vírus. Em comparação com outros ensaios de redução da placa, o método de medição enfatiza o ICP de um poço inteiro, assegurando a cobertura completa da população infecciosa. A independência da formação de placas também se alarga a aplicação do ensaio de vírus que podem formar pequenas placas essencialmente invisíveis ou que só pode controlar a infecção de uma única célula. Portanto, o ensaio é capaz de examinar mais vírus e os efeitos de uma ampla gama de anticorpos do que HI, e que ajuda a reflectir de forma mais abrangente as semelhanças ou diferenças entre os vírus 12 antigênicas. Por exemplo, quando carboxilato de oseltamivir está incluído, o ensaio MN é menos afectado pela NA-ligação dependente, refletindo as diferenças antigênicas com mais precisão. Durante o desenvolvimento do ensaio, foram feitos grandes esforços para melhorar a consistência experimento, a velocidade, e a detecçãosensibilidade, inclusive por meio do controle de vírus de entrada através de titulação quantificada, imagens em alto rendimento com um scanner de mesa, e implementação de uma plataforma de processamento de dados user-friendly. Os resultados têm sido geralmente consistente com e confirmou os da HI. Notavelmente, os resultados também revelaram diferenças antigênicas entre variantes de deriva antigênicas dos vírus recentes do tipo A e vacinas B, assim como as mudanças antigênicas causadas por mudanças selecionadas de cultura ou esporádicos, como a substituição G155E em HA1 de certas (H1N1) vírus pdm09 A 12. O protocolo combinava com o vírus tipo ou subtipo com a selecção de linhas celulares que deram a infecção mais forte, que melhorou substancialmente o sinal de imagem. variação experimental foi alisado com o design de duplicados que em relação com o número de anti-soros testados. Incertezas também pode vir de a qualidade da imagem, que é influenciado principalmente pelo dispositivo de imagem. Uma cor scanner de mesa decente pode signivamente melhorar o contraste de imagem e reduzir o ruído. A quantidade de vírus de entrada na neutralização deve ser quantitativamente determinado previamente a partir da titulação correspondente enquanto os vírus ainda manter um estado semelhante. Durante a neutralização, a resposta anti-soro a uma infecção é normalizada contra a diferença entre o vírus de referência (VC) e o nível de fundo (CC). medições precisas de VC e CC são essenciais para uma experiência de neutralização. Mais duplicatas são recomendados (oito duplicatas foram utilizados nos resultados representativos). Finalmente, compreendendo o software é vital para o sucesso de uma experiência. O software foi testado para a caracterização do vírus de rotina no Centro de Influenza da OMS, Reino Unido por mais de dois anos. As instruções detalhadas para o tratamento de várias situações é fornecido no S1 suplementar. Este ensaio de manganês é adequado para aplicações em que as amostras cobrem uma extgrande campo remely de vista, mas só exigem resolução de imagem moderada. O baixo custo ea configuração simples tornar o sistema prontamente disponível para a maioria dos laboratórios de virologia. A variação nas medidas de uma mesma amostra foi inferior a 3%, ou menos, que define a incerteza introduzida durante o varrimento 11. Tal reprodutibilidade é suficiente em muitos estudos virológicos e pode ser ainda mais reduzida pela média imagens de vários exames. Em conclusão, este estudo demonstra um ensaio MN robusto que pode ser utilizado rotineiramente em estudo antigênica e para suportar dados HI em análises detalhadas de vírus da gripe actualmente em circulação, nomeadamente para a seleção semestral do vírus para inclusão em vacinas contra a gripe humana.

Micro-neutralização (Mn) Os ensaios são usados ​​em virologia para a quantificação de anticorpos neutralizantes e de actividades antivirais. Como uma alternativa de inibição da hemaglutinação (Hl) ensaios, ensaios de MN pode superar os efeitos não-antigénicos influenciadas pelas mudanças de afinidade de receptor de ligação ao vírus da gripe, em que podem complicar a interpretação dos resultados 1,2,3 HI. Até recentemente, a maioria dos ensaios de MN foram baseados em efeitos citopáticos (CPE) ou ensaios imunossorventes ligados a enzima (ELISA) de 4,5. Ensaios MN com base na redução de foco e placas foram desenvolvidas em 1990 6,7,8. Ensaios de redução de placas confiar em contar placas visíveis para quantificar a infecciosidade. No entanto, contagens visuais só cobrir grandes placas que são resolvido pelo olho humano, mesmo que a maioria das placas são pequenos e invisível para muitos vírus corrente circulante. Esta cobertura incompleta pode causar uma variação significativa entre os examinadores e entre experimentos, levando a iresultados ncomparable. É também possível usar o método em que alguns vírus mostrar infecção abortiva de células individuais ou muito pequenas placas. A resolução de contagem pobre pode ser melhorada através da introdução de um protocolo baseado em imagiologia. Com os avanços da tecnologia, microscopia óptica e de alto rendimento leitores bem-placa pode fornecer meio preciso para contar as células infectadas 9. Sob um microscópio trans-iluminado, as células infectadas marcadas com certos marcadores podem ser visualizados por sua absorção ou fluorescência contraste na resolução de sub-celular. Uma amostra pode, então, ser analisadas num ecrã de computador. Infelizmente, devido à limitação no campo de vista, mais do que uma centena de imagens em azulejo são necessários para cobrir um único poço. Analisando uma placa com 96 poços exigiria a criação de imagens e processamento de cerca de dez mil imagens. Tal processo é trabalhoso e demorado, caro, e a resolução obtida é em génerosl desnecessária para a caracterização de rotina de infecções virais. Laboratórios com um orçamento limitado pode achar que a abordagem construído em torno de um scanner de mesa oferece uma alternativa de alto rendimento rentável. Neste artigo, descreve-se um ensaio de redução de placas MN melhorada que é adequado para a caracterização antigénica de um grande número de vírus e para medir quantitativamente as actividades antivirais e anticorpos de neutralização. O ensaio tem várias vantagens: em primeiro lugar, é um ensaio à base de imagens, que é capaz de medir a infecções por vírus a nível celular, independentemente do tamanho da placa. Contando da população total de células infectadas (ICP) dentro de um bem aumenta grandemente a sensibilidade de detecção, que permitem caracterizar os vírus com baixa infectividade. Em segundo lugar, uma titulação quantitativa mais preciso é introduzido antes da neutralização para determinar a quantidade de vírus de entrada. O vírus de entrada quantitativa reduz significativamente o Variação entre as diferentes experiências e torna os resultados mais comparáveis ​​entre laboratórios. Em terceiro lugar, os títulos de neutralização pode ser determinada directamente através da análise de imagens, tornando a quantificação rápida e fácil de usar. Finalmente, o protocolo fornece uma alternativa de baixo custo e de alto rendimento com a resolução e precisão necessária. A quantificação é baseada em um scanner de mesa e software de processamento de dados livre. Toda a configuração tem uma pegada pequena e pode ser implantado na maioria dos laboratórios. O protocolo apresentado neste documento consiste em quatro etapas principais, incluindo titulação do vírus, a quantificação de titulação, a neutralização do vírus, e quantificação de neutralização. titulação do vírus é um experimento de preparação que determina a quantidade de vírus de entrada a serem usados ​​na neutralização. Durante a titulação, uma série de concentrações virais são aplicados às monocamadas de células numa placa de 96 poços. As células infectadas são então quantificados na seção 2. O Dilu viralção, que produz 20% -85% ICP é, por sua vez aplicada como vírus de entrada para a neutralização correspondente no Seção 3. Os títulos do protocolo de neutralização são quantificados usando seção 4. As experiências que se seguiram os protocolos acima são apresentados nos resultados representativos. O ensaio foi testado exaustivamente durante os últimos dois anos, com a maior parte das correntes que circulam os vírus da gripe, tais como A (H1N1) pdm09, A (H3N2), e B vírus. Os resultados da caracterização do vírus da gripe foram incluídos nos relatórios para a reunião de consulta da OMS, que deu recomendações sobre vacinas contra a gripe para uso no Hemisfério Sul em 2016 e do Hemisfério Norte em 2016-2017.

<table><tbody><tr><td>VGM</td><td>Sigma</td><td>D6429, P0781</td><td>500 ml DMEM+5 ml Pen/Strepb</td></tr><tr><td>PBS A</td><td></td><td></td><td>Nature pH Phosphate-buffered salina: NaCl 10&nbsp; g, KCl 0,25&nbsp; g, Na2HPO4 1,437 g, KH2PO4 0,25 g, e Dist. Água 1 L.</td></tr><tr><td>Avicell</td><td>FMC</td><td>RC-581F</td><td>2,4 g em 100 ml de água destilada dissolvida por agitação em um agitador magnético por 1 hora. Esterilizar em autoclavagem.</td></tr><tr><td>2x DMEM</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>21935-028</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Sigma</td><td>T1426</td><td></td></tr><tr><td>Overlay (10 ml/placa):</td><td></td><td></td><td>5 ml 2x DMEM, Tripsina 2&nbsp; &mu; g/ml de concentração final, Avicell 5&nbsp; ml</td></tr><tr><td>Triton X- 100e</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>T8787</td><td>Tampão de permeabilização: 0,2% em PBS A (v/v)</td></tr><tr><td>Tween 80</td><td>Sigma</td><td>P5188</td><td>Tampão de lavagem: 0,05% Tween 80 em PBS A (v/v)Soro</td></tr> de <tr><td>cavalo</td><td>PAA Labs Ltd</td><td>B15-021</td><td>Tampão ELISA: 10% em PBS A (v/v) + 0,1% Tween 80</td></tr><tr><td>Mouse MAb contra influenza tipo A</td><td>Biorad</td><td>MCA 400</td><td>1st Anticorpo: 1:1.000 em ELISA Buffer</td></tr><tr><td>Goat anti-mouse IgG (H+L) HRP conjugado</td><td>Biorad</td><td>172-1011</td><td>2nd Anticorpo: 1:1.000 em ELISA Buffer</td></tr><tr><td>True Blu peroxidase substrato</td><td>KPL&nbsp;</td><td>50-78-02</td><td>Substrato: True blue +0,03% H2O2g (1:1.000 de solução a 30%)</td></tr><tr><td>Placas de microtitulação de fundo plano de 96 poços</td><td>Costar&nbsp;</td><td>3596</td><td></td></tr><tr><td>Arruela e coletor de placas multifoliadas de 8 canais</td><td>Sigma</td><td>M2656</td><td></td></tr><tr><td>Scanner de placas de perfeição</td><td>Epson</td><td>V750 Pro</td><td>O software de imagem pode ser baixado gratuitamente em <a href="http://www.epson.com/cgi-bin/Store/support/supDetail.jsp?oid=66134&amp; infoType=Downloads">http://www.epson.com/cgi-bin/Store/support/supDetail.jsp?oid=66134&amp; infoType=Downloads</a>.</td></tr><tr><td>Ambiente operacional de software: LabVIEW</td><td>National Instruments Corporation</td><td>Janela baseada no NI Vision Builder</td><td>Versão: LabVIEW2012 ou superior</td></tr></tbody></table>

optimização de um micro-quantitativa ensaio de neutralização

Optimization of a Quantitative Micro-neutralization Assay

O ensaio de microneutralização (MN) é uma técnica padrão para medir a infectividade do vírus influenza e a inibição da replicação do vírus. Neste estudo, apresentamos o protocolo de um ensaio de MN baseado em imagem para quantificar as verdadeiras relações antigênicas entre os vírus. Ao contrário dos ensaios típicos de redução de placas que dependem de placas visíveis, este ensaio quantifica toda a população de células infectadas de cada poço. O protocolo combina o tipo ou subtipo de vírus com a seleção de linhagens celulares para obter a máxima infectividade, o que aumenta o contraste da amostra durante a imagem e o processamento da imagem. A introdução da titulação quantitativa define a quantidade de vírus de entrada de neutralização e permite que os resultados de diferentes experimentos sejam comparáveis. A configuração de imagem com um scanner de mesa e software gratuito para download torna a abordagem de alto rendimento, econômica, fácil de usar e fácil de implantar na maioria dos laboratórios. Nosso estudo demonstra que o ensaio MN aprimorado funciona bem com os atuais vírus influenza circulantes A (H1N1) pdm09, A (H3N2) e B, sem ser significativamente influenciado por substituições de aminoácidos na neuraminidase (NA) dos vírus A (H3N2). É particularmente útil para a caracterização de vírus que crescem até baixo título de HA e/ou sofrem uma infecção abortiva, resultando na incapacidade de formar placas em células cultivadas.

Seguindo os procedimentos acima, apresentamos alguns resultados de experimentos recentes caracterização antigênica. A configuração titulação foi concebido para analisar oito vírus de entrada, com duplicatas duplos para cada diluição. As diluições virais foram testados entre 1,0 x 10 -1 e 1,0 x 1,0 -6-se a cobrir as variações entre os vírus. Os vírus de teste eram do subtipo H3N2, incluindo A / Camarões / 15V-3538/2015, A / Vladivostok / 36/2015, A / Moscow / 103/2015, A / Tomsk / 5/2015 /, A / Moscow / 101 / 2015, A / Moscow / 100/2015, A / Moscow / 133/2015, e A / Bratislava / 437/2015. Os resultados da titulação são ilustradas na Figura 5. A Figura 5D mostra a diminuição de PIC com o aumento da diluição do vírus. As curvas foram normalizados contra os ICPs dos mesmos vírus que produziram infecções em todas as células dentro de um poço 12 (definido como a saturação de ICP). Se o ICP não atingir a saturação com a oighest concentração de vírus, a média ICP de duplicatas correspondentes foi usado em vez (A / Moscow / 103/2015, em Figura 5d). As diluições de vírus que produziram 30% de saturação de ICP foram escolhidos como a diluição do vírus de entrada para a neutralização (Tabela 3). Neutralização destinada a ter uma entrada de vírus contra cinco soros, com duplicatas duplas em cada placa. O vírus de referência mostrado é H3N2 A / Stockholm / 63/2015. Os cinco anti-soros são A / HK 4801/14 Egg F12 / 15, A / HK 7295/14 MDCK F02 / 15, A / África R2665 / 15 South SIAT F50 / 15, A / Swiss 9715923/13 SIAT NIBF F18 / 15, e A / Holandês 525/14 SIAT F23 / 15. Os resultados de neutralização estão ilustradas na Figura 6. A Figura 6d mostra o andamento da infecção com o aumento da diluição do soro. A população positiva normalizada sobre o eixo vertical representa a relação dos ICPs a partir da resposta anti-soros contra o correspondente média ICPdo vírus de referência 12. O ICP fundo de células de controlo não infectadas foi subtraída durante a normalização. Os títulos de neutralização foram determinados como os recíprocos das diluições de anti-soro correspondente a uma redução de 50% ICP (Tabela 4). interpolação linear foi utilizada para estimar os títulos caem entre dois diluições de soro adjacentes. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/54897/54897fig1.jpg" /> Figura 1: Exemplo de uma configuração bem-placa numa experiência de titulação de vírus. vírus de teste são atribuídos a linhas separadas (A a H). As colunas são concebidos para diferentes diluições virais (1 a 12). Duas colunas foram usadas como duplicadas para cada diluição virai. Barra de escala = 10 mm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54897/54897fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> Figura 2: Esquema de um sistema de digitalização de amostra. (A) Uma placa de 96 poços na posição de imagem de um digitalizador de mesa (republicado de de Referência 11 com a permissão de Elsevier), e (b) dimensões do limite da posição em forma de L mostrados em (a). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54897/54897fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54897/54897fig3.jpg" /> Figura 3: Desktop diagrama do software quantificação &quot;Wellplate Reader&quot;. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54897/54897fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> </p&gt; <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54897/54897fig4.jpg" /> Figura 4: Exemplo de uma configuração bem-placa numa experiência de neutralização. Cada antisoro é atribuído a duas colunas com duplicados (1 a 10). As linhas são projetados para diferentes diluições de soro (A a H). O controle de vírus leva Coluna 11, com oito repetições (A11 para H11). O controlo de células é na coluna 12, com oito duplicados (A12 a H12). Barra de escala = 10 mm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54897/54897fig4large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/54897/54897fig5.jpg" /> Figura 5: resultados de uma experiência de titulação. (A) A configuração bem-plate, (b) digitalizada bem placa de imagem, (c) Ilustraçãodo, quantificados, codificados população de células-cor infectadas com vírus, e (d) as populações de células infectadas com vírus normalizados contra diluições de vírus. 30% ICP foi usado como o limiar. As barras de erro em (d) são os desvios padrão (SD) das duplicações de amostra (± 1 SD). As barras de escala em (b) e (c) = 10 mm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54897/54897fig5large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/54897/54897fig6.jpg" /> Figura 6: resultados de uma experiência de neutralização. (A) A configuração bem-placa, (b) imagem digitalizada bem-placa, (c) a ilustração do, população de células infectada com vírus quantificada, e (d) população de células infectadas com vírus normalizada contra a diluição de soro. O vi de entradarus (VC) é A / Stockholm / 63/2015. 50% ICP foi usada para calcular os títulos. As barras de erro em (d) são os desvios padrão (SD) das duplicações de amostra (± 1 SD). As barras de escala em (b) e (c) = 10 mm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54897/54897fig6large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> S1 Suplementar: <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54897/Supplementary_S1.pdf" target="_blank">Por favor, clique aqui para fazer o download deste arquivo.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="3"> diluição típica </td></tr><tr><td></td><td> células MDCK </td><td> Células MDCK-SIAT1 </td></tr><tr><td> 2 dias </td><td> 1: 5 (1 + 4) </td><td> 1:10 (1 + 9) </td></tr><tr><td> 3 dias </td&gt; <td> 1:10 (1 + 9) </td><td> 1:20 (1 + 19) </td></tr><tr><td colspan="3"> Número típico de células por ml </td></tr><tr><td></td><td> células MDCK </td><td> Células MDCK-SIAT1 </td></tr><tr><td> 2 dias </td><td> 2 x 10 5 </td><td> 1 x 10 5 </td></tr><tr><td> 3 dias </td><td> 1 x 10 5 </td><td> 5 x 10 4 </td></tr></tbody></table> Tabela 1: diluições típicas sobre uma subcultura de frascos confluentes de células MDCK ou células MDCK-SIAT1. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Modo </td><td> Modo profissional </td></tr><tr><td> tipo de documento </td><td> Film (com o Guia Area Film) </td></tr><tr><td> Tipo Auto Exposição </td><td> foto </td></tr><tr><td> Eu estouTipo idade </td><td> 24-bit Cor </td></tr><tr><td> Resolução </td><td> 1.200 dpi </td></tr><tr><td> Formato de imagem salva </td><td> TIFF </td></tr></tbody></table> Tabela 2: Configuração típica de um scanner de mesa. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Linha </td><td> Vírus </td><td> diluição recomendada </td></tr><tr><td> UMA </td><td> A / Cameron / 15V-3538/2016 </td><td> 1,0 x 10 -2 </td></tr><tr><td> B </td><td> A / Vladivostok / 36/2015 </td><td> 1,0 x 10 -3 </td></tr><tr><td> C </td><td> A / Moscow / 103/2015 </td><td> 1,1 x 10 -1 </td></tr><tr><td> D </td><td> A / Tomsk / 5/2015 </td><td> 5,9 x 10 -1 </td></tr><tr><td> E </td><td> A / Moscow / 101/2015 </td><td> 8,3 x 10 -1 </td></tr><tr><td> F </td><td> A / Moscow / 100/2015 </td><td> 1,4 x 10 -2 </td></tr><tr><td> G </td><td> A / Moscow / 133/2015 </td><td> 1,3 x 10 -2 </td></tr><tr><td> H </td><td> A / Bratislava / 437/2015 </td><td> 1,3 x 10 -4 </td></tr></tbody></table> Tabela 3: diluições virais calculados a partir de uma população de 30% ICP. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Coluna </td><td> Os anti-soros </td><td> título recomendado </td></tr><tr><td> 1 - 2 </td><td> A / HK4801 / 2014 </td><td> 110 </td></tr><tr><td> 3-4 </td><td> A / HK7295 / 2014 </td><td> 213,3 </td></tr><tr><td&gt; 5-6 </td><td> A / África do Sul / R2665 / 2015 </td><td> 2155,8 </td></tr><tr><td> 7-8 </td><td> A / Suíça / 9715293/2013 </td><td> 89,4 </td></tr><tr><td> 9-10 </td><td> A / Holanda / 525/2014 </td><td> 78,6 </td></tr></tbody></table> Tabela 4: Os títulos em 50% ICP de A / Stockholm / 63/2015 contra o anti-soros.

Este estudo descreve uma -Imagem baseada ensaio de micro-neutralização para analisar as relações antigênicas entre vírus. O protocolo emprega um digitalizador de mesa e tem quatro passos, incluindo titulação, a quantificação de titulação, neutralização, e quantificação de neutralização. O ensaio funciona bem com pdm09 corrente circulante vírus influenza A (H1N1), A (H3N2), e B vírus.

Optimização de um Micro-quantitativa Ensaio de neutralização

The micro-neutralization (MN) assay is a standard technique for measuring the infectivity of the influenza virus and the inhibition of virus replication. ...

O objetivo geral deste ensaio de micro-neutralização é caracterizar todos os tipos de vírus da influenza atualmente em circulação, bem como a atividade de anticorpos e medidas antivirais, de maneira quantitativa, de alto rendimento e altamente sensível. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de virologia, como a caracterização antigênica de vírus da influenza, a neutralização quantitativa de anticorpos e as atividades antivirais. A principal vantagem desta técnica é que ela caracteriza toda a população de células infectadas, incluindo placas visíveis e invisíveis, bem como infecções em célula única.O ensaio de micro-neutralização será demonstrado pelo Dr. Yipu Lin, diretor assistente do Centro Colaborador da OMS para Influenza em Londres. O nível de biossegurança, ou BSL, para o seguinte protocolo é BSL 2 para vírus de influenza sazonal e BSL 3+ para vírus de influenza com potencial pandêmico. Para começar, alíquotas suficientes de células devem ser distribuídas em placas de 96 poços.Incube as células a 37 graus Celsius e 5%CO2 por dois a três dias para atingir confluência. Com etanol 70%, esterilize um lavador de placas multipoços e use PBS ou VGM para enxaguá-lo. Em seguida, use 200 microlitros de meio de crescimento viral, ou VGM, para lavar as células confluentes.Aspire o VGM das células e adicione imediatamente 50 microlitros de VGM a cada poço. Em seguida, adicione 900 microlitros de VGM a cada um dos seis tubos estéreis. Depois, pipete 100 microlitros do vírus para o primeiro tubo e misture bem.Prepare diluições seriadas do vírus começando com o primeiro tubo, trocando as ponteiras entre cada diluição. Adicione 50 microlitros de cada diluição do vírus, começando com a diluição mais alta, em poços duplicados de uma placa de 96 poços. Em seguida, coloque a placa a 37 graus Celsius por duas a três horas para permitir que o vírus infecte as células.Após preparar a camada de sobreposição de acordo com o protocolo descrito, remova o inóculo dos poços. Em seguida, adicione 200 microlitros de camada de sobreposição a cada poço e incube a 37 graus Celsius durante a noite, sem perturbar. Adicione 200 microlitros de PFA a 4% gelado em PBS A aos poços e incube a quatro graus Celsius por 30 minutos ou à temperatura ambiente por 20 minutos.Após a incubação, aspire o PFA e use 200 microlitros por poço de PBS A para lavar a placa duas vezes. Adicione 100 microlitros de tampão de permeabilização à placa e incube à temperatura ambiente por 30 minutos. Em seguida, use PBS A para lavar a placa duas vezes.Em seguida, adicione 50 microlitros por poço de um anticorpo monoclonal de camundongo contra o tipo A da influenza aos poços e incube em temperatura ambiente com agitação por uma hora. Após a incubação, utilize 300 microlitros de tampão de lavagem para lavar o poço três vezes. Então, adicione 50 microlitros de um anticorpo secundário conjugado à HRP de cabra aos exemplos e incube em temperatura ambiente por uma hora.Após lavar as placas três vezes como antes, adicione 50 microlitros de substrato por poço e incube à temperatura ambiente por 30 minutos ou até que o desenvolvimento de uma coloração azul seja claramente visível. Para interromper a reação, use 200 microlitros de água destilada para lavar os poços duas vezes. Em seguida, após secar a placa ao ar, armazene-a em local escuro.Coloque uma placa de poços na área de digitalização de um scanner de mesa, utilizando o limite de posição em forma de L para garantir uma localização de imagem ótima e repetível. Digitalize a placa usando as configurações mostradas aqui. Em seguida, execute o software do leitor de placas de poços para calcular a concentração requerida do vírus, clicando no botão Carregar Imagem para carregar uma imagem.Em seguida, na aba de limiar global, mova a barra vermelha no histograma para ajustar o limiar de amostragem. Depois, clique no botão atualizar para examinar o efeito sobre a imagem. Agora, marque a caixa Calcular Neutralização/Titulação.Clique no botão Amostragem para quantificar a população de células infectadas, ou PIC. Em seguida, quando solicitado, clique no botão Salvar para salvar os resultados da amostragem. Para obter os resultados da titulação, carregue ou insira o mapa de definição da placa de poços.Em Titulação: População Ótima de Vírus, indique o limite. Selecione a guia Processo de Titulação para calcular os resultados da titulação. Em seguida, verifique os resultados da titulação antes de clicar no botão Salvar e Fechar para salvar os resultados.Consulte o suplemento S1 para obter instruções mais detalhadas sobre o software. Para realizar a neutralização viral, prepare a monocamada celular dois ou três dias com antecedência. Em seguida, adicione 50 microlitros de VGM a cada poço da placa.Use as colunas 11 e 12 para o controle do vírus e o controle celular, respectivamente. Adicione alíquotas de 50 microlitros de uma diluição de um para 20 da enzima destruidora de receptor, ou RDE, tratada com soro à primeira linha das colunas de um a 10. Realize diluições seriadas em duas vezes transferindo 50 microlitros da linha A para a linha H e descartando 50 microlitros da linha H. Em seguida, adicione 50 microlitros de diluente a cada poço da coluna de controle celular.Adicione 50 microlitros do vírus a cada poço da placa, exceto na coluna de controle celular. Incube a placa a 37 graus Celsius por duas a três horas. Em seguida, remova o inóculo e adicione a cobertura a cada poço.Incube a placa durante a noite a 37 graus Celsius sem perturbação. Em seguida, fixe e cora as placas conforme demonstrado anteriormente neste vídeo. Para quantificar a neutralização, coloque uma placa de poços na área de digitalização de um scanner de mesa conforme demonstrado anteriormente neste vídeo.Analise a placa e execute o software do leitor de placas para calcular as titulações virais necessárias, como antes. Após carregar ou inserir o mapa da placa, em Neutralização:Dedução de Infecção, indique o limite. Em seguida, selecione Processo de Neutralização para calcular as titulações.Por fim, verifique os títulos e clique no botão Salvar e Fechar para salvar os resultados da neutralização. São mostrados aqui os resultados de titulação de experimentos recentes de caracterização antigênica de oito vírus de entrada com diluições entre 1,0 vezes 10 à potência negativa um e 1,0 vezes 10 à potência negativa seis. O gráfico ilustra que os PIC diminuem com o aumento da diluição do vírus.As curvas foram normalizadas em relação aos PIC dos mesmos vírus que provocaram infecções em todas as células dentro de um poço. Listadas nesta tabela estão as diluições de vírus que produziram 30% da saturação de PIC e que foram escolhidas como diluição de entrada do vírus para neutralização. Esta figura mostra os resultados de um experimento de neutralização utilizando um vírus de entrada contra cinco soros antisséricos.O gráfico ilustra o processo de infecção com o aumento da diluição do soro. A população positiva normalizada no eixo vertical representa a razão entre as PIC provenientes da resposta dos antissoros correspondentes e a PIC média do vírus de referência. Por fim, os títulos de neutralização foram determinados como os recíprocos das diluições dos antissoros correspondentes à redução de 50% da PIC.Este ensaio enfoca consistência, velocidade e sensibilidade de detecção, incluindo titulação quantificada de vírus de entrada, imageamento de alto rendimento e processamento de dados. É econômico, fácil de usar e tem sido rotineiramente empregado em estudos antigênicos virais.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Este vídeo demonstra ensaios de microneutralização para medir anticorpos neutralizantes usando células renais caninas Madin-Darby que superexpressam ácido siálico ligado a α2,6 em soros humanos. Este ensaio é frequentemente usado para sorologia humana para...

Um ensaio de microneutralização para medir títulos de anticorpos neutralizantes em soro humano

Este vídeo demonstra o ensaio de microneutralização baseado em imagem para analisar as relações antigênicas entre os vírus influenza A e B. Ele fornece uma maneira quantitativa e visual de avaliar a eficácia de anticorpos ou outros tratamentos na prevenção da infecção viral.

Analisando a relação antigênica entre vírus usando um ensaio de microneutralização baseado em imagem

Descrevemos um ensaio digital de ponto final para quantificar ácidos nucléicos com uma leitura simplificada (analógica). Medimos a fluorescência em massa de ensaios digitais baseados em gotículas usando uma máquina de qPCR padrão em vez de instrumentação especializada e confirmamos nossos resultados por microscopia.

Simples massa de Leitura Digital de Ácido Nucleico Quantificação Assays

Um protocolo para a determinação da atividade anti-apoptotic relativo de um mAb anti-TNFa usando um mecanismo de neutralização com células WEHI 164 é aqui apresentado. Este protocolo é útil para comparar a força de neutralização das moléculas diferentes com a mesma funcionalidade biológica.

Determinação da potência relativa de um anti-TNF anticorpo Monoclonal (mAb) por neutralizando TNF usando um método de Bioanalytical In Vitro

Um imunoensaio baseado no capilar, usando uma plataforma comercial para medir as proteínas alvo de preparações de proteína total é demonstrado. Além disso, o ensaio parâmetros de tempo de exposição, concentração de proteína e diluição de anticorpo são otimizados para um sistema de modelo de cultura de células.

Procedimento e estratégias de otimização de chave para um método automatizado capilar imunoensaio eletroforética com base em

Anticorpos neutralizantes gripe correlacionam com proteção de infecções de gripe. Microneutralization ensaios medem anticorpos neutralizantes em soros humanos e são frequentemente utilizados para sorologia humana da gripe. Descrevemos um ensaio de microneutralization usando células MDCK-SIAT1 para medir os anticorpos neutralizantes para contemporâneas 3C.2a e 3C.3a A(H3N2) vírus após vacinação gripe ou infecção.

Medição da gripe neutralizando Antibody Responses to A(H3N2) vírus em soros humanos por Microneutralization ensaios usando as células MDCK-SIAT1

Aqui nós apresentamos um protocolo para descrever o desenvolvimento e validação de uma única molécula matriz digital ensaio de ELISA, que permite a detecção de ultra sensível de todos os subtipos de IFN-α em amostras humanas.

Desenvolvimento e validação de uma única molécula ultra-sensível de matriz Digital ensaio imunossorvente ligado à enzima para humana Interferon-α

Aqui, é apresentado um protocolo de reação em cadeia de polimerase em tempo real quantitativo para a determinação do conteúdo de microRNA nativo (absoluto/relativo) de partículas de lipoproteína. Além, um método para aumentar o nível do Micro-RNA, assim como um método para determinar a taxa de captação celular de partículas da lipoproteína, é demonstrado.

Enriquecimento de partículas de lipoproteína nativa com microRNA e subsequente determinação de seu conteúdo de microRNA absoluto/relativo e sua taxa de transferência celular

Um sistema de análise de fluxo para ensaios multiplexados baseados em contas que fornece uma leitura de dois repórteres foi usado para o desenvolvimento de ensaios sorológicos e de neutralização de anticorpos multiplex que podem medir simultaneamente anticorpos IgG e IgM neutralizantes para SARS-CoV-2.

Um teste de neutralização rápido e multiplex dual reporter IgG e IgM SARS-CoV-2 para um sistema de análise de fluxo baseado em contas multiplexadas

Um protocolo de laboratório abrangente e um fluxo de trabalho de análise são descritos para um ensaio rápido, econômico e simples baseado em células coloridas para detectar elementos neutralizantes contra o AAV6.

Um método passo-a-passo para detectar anticorpos neutralizantes contra a AAV usando um ensaio baseado em células coloridas

Aqui, é apresentado um protocolo para testar enzimas metabolizadoras de ácidos nucleicos, usando exemplos de enzimas ligase, nuclease e polimerase. O ensaio utiliza oligonucleotídeos marcados e não marcados com fluorescência que podem ser combinados para formar duplexes que imitam danos ao RNA e/ou DNA ou intermediários da via, permitindo a caracterização do comportamento enzimático.

Usando oligonucleotídeos sintéticos modificados para testar enzimas metabolizadoras de ácidos nucleicos

Aprenda a otimizar um ensaio de micro-neutralização para caracterização antigênica de vírus influenza usando scanner de mesa. Este método quantitativo de alta sensibilidade permite analisar relações antigênicas entre cepas circulantes.

Optimização de um Micro-quantitativa Ensaio de neutralização

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