Olhando para Cérebro polissomos com Microscopia de Força Atômica

O objetivo geral deste protocolo é fornecer um pipeline detalhado para a purificação e deposição precisas de polirribossomos cerebrais na mica e obter milhares de imagens na resolução em nanoescala sem a necessidade de pós-processamento pesado ou análises de reconstrução 3D. Este método pode ajudar a responder a questões-chave nos campos da tradução e controle translacional, como a compreensão do impacto da organização do ribossomo dentro dos polissomos durante a religação da expressão gênica. As principais vantagens desta técnica são que não é necessária fixação ou marcação de amostras, e as medições podem ser realizadas em condições quase fisiológicas para identificar facilmente os ribossomos e os suportes de RNA nus.

Embora esse método possa fornecer informações sobre a organização do polirribossomo de mamíferos, ele também pode ser aplicado a outros microrganismos, como leveduras, bactérias e insetos, bem como ao status envolvendo controles translacionais da expressão gênica. A demonstração visual desse método é crítica, pois o manuseio de amostras polissomais para absorção de mica e as etapas de lavagem são bastante complicadas e exigem habilidades e experiência de manuseio. Demonstrando o procedimento estarão Paola Bernabo e Lorenzo Lunelli.

Para começar, colete e congele o tecido cerebral conforme descrito no protocolo de texto que acompanha. Em seguida, retire o lenço congelado do freezer e leve-o para a bancada. Coloque o tecido cerebral congelado e o nitrogênio líquido em um almofariz pré-resfriado e pulverize-o usando um pilão até formar um pó.

Transfira cerca de 25 miligramas do pó cerebral para um tubo de microcentrífuga frio e adicione imediatamente 0,8 mililitros de tampão de lise. Pipete a mistura para cima e para baixo 25 vezes rapidamente para romper as células. Em seguida, centrifugue o tubo a 12.000 x g por um minuto a quatro graus Celsius para pellet os detritos celulares.

Transfira o sobrenadante para um novo tubo de microcentrífuga e mantenha o tubo no gelo por 15 minutos. Em seguida, centrifugue o tubo por cinco minutos para granular núcleos e mitocôndrias. Em seguida, remova cuidadosamente um mililitro do topo de um gradiente de sacarose previamente preparado.

Sobrepor a sacarose gota a gota com o sobrenadante do lisado citosólico. Com a amostra agora carregada no topo do gradiente, abaixe cuidadosamente o tubo e um tubo de contrapeso nos baldes de um rotor de caçamba oscilante. Centrifugue o gradiente por 100 minutos.

Após a ultracentrifugação, deixe os tubos em seus baldes por 20 minutos a quatro graus Celsius, para permitir que o gradiente se estabilize. Em seguida, remova cuidadosamente o tubo de amostra e monte-o no dispositivo coletor de um sistema de fracionamento de gradiente de densidade. Colete frações de um mililitro enquanto monitora a absorbância de ácidos nucléicos a 260 nanômetros com um detector de luz visível UV e coloque-as no gelo.

Em seguida, prepare alíquotas de 30-40 microlitros das frações de interesse e mantenha-as no gelo. Se as amostras não forem usadas imediatamente, armazene-as a 80 graus Celsius e tome medidas para limitar o número de ciclos de congelamento e descongelamento. Para preparar amostras para a imagem latente do AFM, cubra primeiramente uma folha lavada da mica com 200 microlitros de um sulfato milimolar do níquel ii e incube a folha por três minutos na temperatura ambiente.

Em seguida, remova a solução, seque a superfície com ar comprimido e coloque a placa de Petri no gelo. Em seguida, adicione delicadamente toda a alíquota da fração de interesse gota a gota na mica. Usando uma ponta de 100 ou 200 microlitros, espalhe a amostra por toda a superfície da mica e incube a amostra no gelo por três minutos.

Em seguida, cubra a folha de mica gota a gota com 200 microlitros de tampão frio AFM e incube a amostra no gelo por uma hora. Manter a amostra a 40 graus e usar tampão frio que foi preparado em água livre de RNase são importantes para preservar a organização do polirribossomo. Após a incubação, remova cuidadosamente o tampão e lave a mica três a quatro vezes com 200 microlitros de tampão frio AFM para remover qualquer excesso de sacarose.

Em seguida, lave a mica três vezes com solução de lavagem a frio e escorra o excesso de água da mica usando papel. A remoção completa da sacarose das amostras absorventes é crucial agora que você cortou o ribossomo e o RNA nu no polissomo. Deixar a amostra secar sob a cobertura química com a parte superior da placa de Petri parcialmente aberta.

Após duas horas, feche a placa de Petri. A amostra agora pode ser armazenada em temperatura ambiente. Anexe a amostra preparada ao suporte de amostra do AFM usando fita dupla face.

Em seguida, insira o porta-amostras no estágio AFM de acordo com as instruções do fabricante. Após a calibração, aproxime-se da amostra até que a ponta do cantilever se encaixe na superfície. Selecione uma área de varredura de dois por dois mícrons, uma resolução de pelo menos 512 x 512 pixels, escolha o modo de subtração de fundo ao vivo e selecione uma escala Z de 20 a 25 nanômetros.

Em seguida, comece a aquisição da imagem. Inspecione a imagem, procurando a presença de objetos redondos caracterizados por uma altura entre 10 e 15 nanômetros ao adquirir imagens no ar. Em seguida, ajuste o ponto de ajuste e os parâmetros de feedback até que objetos pontiagudos sejam visualizados.

O fundo deve parecer relativamente plano em boas amostras com objetos de cerca de dois a quatro nanômetros de altura. Quando a imagem estiver boa, adquira várias varreduras de dois por dois mícrons em diferentes áreas de amostra. Após a deposição de alíquotas de sacarose na mica, o AFM fornece descrições precisas do tamanho de polissomas únicos que aparecem como aglomerados de ribossomos compactados.

Olhando mais de perto um dos picos ribossômicos usando a análise de seção transversal, revela que a altura dos picos ribossômicos é de cerca de 14 nanômetros. Isso corresponde ao que foi observado anteriormente para ribossomos e polissomos humanos após a secagem ao ar. Na imagem à direita, uma macro foi usada para identificar a localização do ribossomo e marcar cada ribossomo com um círculo vermelho.

Usando essas informações, a distribuição de frequência do número de ribossomos por polissomo pode ser analisada. Esta distribuição experimental foi ajustada com uma curva gaussiana centrada em 5,8 ribossomos por polissomo, com um desvio padrão de 1,3. Uma vez dominada, essa técnica, desde a pulverização cerebral até a aquisição de imagens de polirribossomos, pode ser feita em menos de oito horas se for realizada corretamente.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de manter a amostra no gelo e usar tampões frios para a deposição da amostra na mica. Seguindo este procedimento, e usando o plugin ImageJ de um desenvolvedor para disponibilizar em seu artigo, você pode contar com precisão o número de ribossomos por polissomo. Após cada desenvolvimento, esta técnica abrirá caminho para entender a cinética da formação de polissomos e identificar as mudanças na organização do polissoma e suas diferentes condições celulares ou teciduais.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como obter milhares de imagens polissômicas para analisar e estudar sistematicamente sua organização.