Olhando para Cérebro polissomos com Microscopia de Força Atômica
16 de março de 2016
Embora a estrutura do ribossomo tenha sido extensivamente caracterizada, a organização dos polissomos ainda é pouco estudada. Para superar essa falta de conhecimento, apresentamos aqui um protocolo de preparação detalhado para imagens precisas de polissomos de mamíferos por microscopia de força atômica (AFM) em ar e líquido.
O objetivo geral deste protocolo é fornecer um fluxo detalhado para a purificação precisa e deposição de politribossomos cerebrais sobre mica e para obter milhares de imagens com resolução em escala nanométrica, sem a necessidade de pós-processamento intenso ou análises de reconstrução tridimensional. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais nas áreas de tradução e controle translacional, como compreender o impacto da organização dos ribossomos dentro dos polissomos durante a reorganização da expressão gênica. As principais vantagens desta técnica são a ausência da necessidade de fixação ou marcação da amostra, e a possibilidade de realizar medições em condições próximas às fisiológicas, facilitando a identificação de ribossomos e fitas de RNA nuas.
Embora este método possa fornecer informações sobre a organização do politribossomo de mamíferos, ele também pode ser aplicado a outros microrganismos, como leveduras, bactérias e insetos, bem como a condições envolvendo controles traducionais da expressão gênica. A demonstração visual deste método é fundamental, pois o manuseio da amostra polysomal para adsorção em mica e as etapas de lavagem são bastante delicadas e exigem habilidade e experiência. A demonstração do procedimento será realizada por Paola Bernabo e Lorenzo Lunelli.
Para começar, colete e congele o tecido cerebral conforme descrito no protocolo textual complementar. Em seguida, retire o tecido congelado do congelador e leve-o para a bancada. Coloque o tecido cerebral congelado e nitrogênio líquido em um almofariz pré-resfriado e pulverize-o usando um pistilo até que se transforme em um pó.
Transfira cerca de 25 miligramas do pó cerebral para um tubo de microcentrifugação gelado e adicione imediatamente 0,8 mililitros do tampão de lise. Pipete a mistura para cima e para baixo 25 vezes rapidamente para romper as células. Em seguida, centrifugue o tubo a 12.000 × g por um minuto a quatro graus Celsius para sedimentar os detritos celulares.
Transfira o sobrenadante para um novo tubo de microcentrifugação e mantenha o tubo em gelo por 15 minutos. Em seguida, centrifugue o tubo por cinco minutos para sedimentar os núcleos e mitocôndrias. A seguir, remova cuidadosamente um mililitro do topo de uma gradiente de sacarose previamente preparado.
Sobreponha a solução de sacarose gota a gota com o sobrenadante do lisado citosólico. Com a amostra agora carregada sobre o gradiente, abaixe cuidadosamente o tubo e um tubo de contrabalanço nos compartimentos de um rotor de rotor oscilante. Centrifugue o gradiente por 100 minutos.
Após a ultracentrifugação, deixe os tubos em seus respectivos suportes por 20 minutos a quatro graus Celsius, para permitir a estabilização do gradiente. Em seguida, remova cuidadosamente o tubo de amostra e fixe-o no dispositivo coletor de um sistema de fracionamento por gradiente de densidade. Colete frações de um mililitro enquanto monitora a absorbância de ácidos nucleicos a 260 nanômetros com um detector de luz visível e ultravioleta e coloque-as no gelo.
Em seguida, prepare alíquotas de 30-40 microlitros das frações de interesse e mantenha-as sobre gelo. Se as amostras não forem usadas imediatamente, armazene-as a 80 graus Celsius e tome cuidados para limitar o número de ciclos de congelamento e descongelamento. Para preparar as amostras para imagem em AFM, cubra primeiro uma lâmina de mica lavada com 200 microlitros de sulfato de níquel II um milimolar e incube a lâmina por três minutos em temperatura ambiente.
Em seguida, remova a solução, seque a superfície com ar comprimido e coloque a placa de Petri sobre gelo. A seguir, adicione cuidadosamente toda a alíquota da fração de interesse, gota a gota, sobre a mica. Usando uma ponteira de 100 ou 200 microlitros, espalhe a amostra por toda a superfície da mica e incube a amostra em gelo por três minutos.
Em seguida, cubra a lâmina de mica gota a gota com 200 microlitros de tampão AFM frio e incube a amostra no gelo por uma hora. Manter a amostra a 40 graus e usar tampão frio preparado em água livre de RNase são aspectos importantes para preservar a organização dos polirribossomos. Após a incubação, remova cuidadosamente o tampão e lave a mica três a quatro vezes com 200 microlitros de tampão AFM frio para remover qualquer excesso de sacarose.
Em seguida, lave a mica três vezes com solução de lavagem fria e remova o excesso de água da mica usando papel. A remoção completa da sacarose das amostras absorventes é crucial agora que você cortou tanto os ribossomos quanto o RNA nu no polissoma. Deixe a amostra secar sob a capela química com a tampa da placa de Petri parcialmente aberta.
Após duas horas, feche a placa de Petri. A amostra pode agora ser armazenada à temperatura ambiente. Fixe a amostra preparada no suporte da amostra do AFM utilizando fita dupla face.
Em seguida, insira o suporte da amostra na platina do AFM conforme as instruções do fabricante. Após a calibração, aproxime a amostra até que a ponta da alavanca entre em contato com a superfície. Selecione uma área de varredura de dois por dois mícrons, uma resolução de pelo menos 512 x 512 pixels, escolha o modo de subtração de fundo em tempo real e selecione uma escala Z de 20-25 nanômetros.
Em seguida, inicie a aquisição de imagens. Inspecione a imagem, procurando a presença de objetos arredondados caracterizados por uma altura entre 10 e 15 nanômetros ao adquirir imagens no ar. Ajuste, então, os parâmetros de ponto de ajuste e feedback até que objetos nítidos sejam visualizados.
O fundo deve parecer relativamente plano em amostras boas, com alguns objetos de dois a quatro nanômetros de altura. Uma vez que a imagem pareça boa, adquira várias varreduras de dois por dois mícrons em diferentes áreas da amostra. Após a deposição de alíquotas de sacarose sobre mica, a microscopia de força atômica (AFM) fornece descrições precisas do tamanho de polissomos individuais, que aparecem como aglomerados de ribossomos fortemente compactados.
Observando mais de perto um dos picos ribossômicos por meio de análise de seção transversal, revela-se que a altura dos picos ribossômicos é de aproximadamente 14 nanômetros. Isso corresponde ao que foi previamente observado para ribossomos e polissomos humanos após secagem ao ar. Na imagem à direita, foi utilizado um macro para identificar a localização dos ribossomos e marcar cada ribossomo com um círculo vermelho.
Com base nessas informações, pode-se analisar a distribuição de frequência do número de ribossomos por polissomo. Essa distribuição experimental foi ajustada a uma curva gaussiana centrada em 5,8 ribossomos por polissomo, com um desvio padrão de 1,3. Após dominar a técnica, desde a pulverização do tecido cerebral até a aquisição das imagens de polirribossomos, o procedimento pode ser realizado em menos de oito horas, se executado corretamente.
Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de manter a amostra sobre gelo e usar tampões frios para a deposição da amostra sobre a mica. Após este procedimento, e utilizando o plugin ImageJ de um desenvolvedor para disponibilizar em seu artigo, é possível quantificar com precisão o número de ribossomos por polissomo. Após cada desenvolvimento, esta técnica abrirá caminho para compreender a cinética da formação de polissomos e identificar as alterações na organização dos polissomos em diferentes condições celulares ou teciduais.
Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como obter milhares de imagens de polissomos para analisar e estudar sistematicamente sua organização.
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Visão Geral
Este artigo apresenta um protocolo detalhado para o imageamento de polissomos de mamíferos utilizando microscopia de força atômica (AFM). O método permite o imageamento em alta resolução sem a necessidade de fixação ou marcação da amostra.
Componentes Principais do Estudo
Área de Ciência
- Neurociência
- Bioquímica
- Biologia Celular
Contexto
- A organização de polissomos é pouco explorada, apesar da extensa caracterização da estrutura dos ribossomos.
- Compreender a organização dos ribossomos é essencial para obter insights sobre a regulação da expressão gênica.
- Este método pode ser aplicado a diversos organismos, incluindo leveduras e bactérias.
- A demonstração visual é essencial devido à complexidade do manuseio de amostras polissomais.
Objetivo do Estudo
- Fornecer um protocolo confiável para a purificação e imagem de politribossomos cerebrais.
- Facilitar o estudo do controle traducional e da expressão gênica.
- Permitir a obtenção de imagens em condições próximas às fisiológicas.
Métodos Utilizados
- Microscopia de força atômica (AFM) para imageamento.
- Purificação de politribossomos cerebrais em mica.
- Imageamento sem pós-processamento pesado ou reconstrução tridimensional.
- Técnicas de manipulação para absorção da amostra e lavagem.
Resultados Principais
- Imagem bem-sucedida de polirribossomos com resolução em escala nanométrica.
- Identificação de ribossomos e fitas de RNA nuas em amostras.
- Informações sobre a organização de polirribossomos de mamíferos.
- Aplicações potenciais no estudo de controles traducionais em diferentes organismos.
Conclusões
- O protocolo aprimora a compreensão da organização dos ribossomos em polissomos.
- Ele fornece uma ferramenta valiosa para pesquisadores que estudam a expressão gênica.
- A aplicabilidade do método a diversos organismos amplia seu impacto.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Compreender a organização dos polissomos fornece insights mecanicistas sobre o controle da tradução, uma camada crítica de regulação da expressão gênica relevante para a validação de alvos em programas de neurociência e doenças metabólicas. A capacidade de imagear polissomos em condições próximas à fisiológica, sem fixação ou marcação, permite uma análise reprodutível e quantitativa da dinâmica dos ribossomos, apoiando testes iniciais de hipóteses e a redução de riscos biológicos. Esta abordagem oferece um método complementar e livre de marcação para avaliar estados traducionais em sistemas relevantes para doenças, auxiliando na priorização de alvos com uma fundamentação mecanicista sólida.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêuticos
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a visualização direta da organização dos ribossomos para investigar hipóteses traducionais e esclarecer os efeitos em nível de via decorrentes de perturbações genéticas ou farmacológicas.
- Valor Operacional: Fornece uma leitura de imagem reprodutível e livre de marcadores, reduzindo a variabilidade associada a artefatos de fixação ou coloração.
- Valor Preditivo: Apoia a avaliação de alterações no estado traducional como biomarcador funcional para o engajamento do alvo e mecanismo de ação.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Prontidão do ensaio: Gera dados quantitativos de imagem de polissomos adequados para análise de alto conteúdo do número e distribuição de ribossomos.
- Reprodutibilidade: Permite a aquisição de milhares de imagens com resolução em escala nanométrica sob condições consistentes, possibilitando robustez estatística.
- Escalabilidade: Compatível com fluxos de trabalho de fracionamento que podem ser adaptados a campanhas de triagem com múltiplas amostras.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Relevância para Doenças: Aplicável a tecido cerebral, permitindo o estudo direto da organização de polissomos em modelos de doenças neurodegenerativas e neuropsiquiátricas.
- Continuidade Translacional: Conecta achados in vitro a sistemas cerebrais ex vivo, apoiando a redução de riscos mecanicistas antes da validação in vivo.
- Utilidade entre Espécies: Pode ser estendido a leveduras, bactérias e insetos, permitindo estudos de conservação e validação de alvos em diferentes organismos modelo.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este método insere-se no continuum de descoberta que vai da validação da hipótese do alvo até a eliminação de riscos mecanicistas, fornecendo dados biofísicos sobre a organização da maquinaria traducional que complementam abordagens genômicas e proteômicas.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses ao associar alterações na estrutura de polissomos ao controle traducional durante a reprogramação da expressão gênica.
- Análises: Permite a extração de métricas quantitativas, como a contagem de ribossomos por polissomo e distribuição espacial, facilitando análises comparativas entre condições.
- Reutilização Empresarial: Representa uma capacidade de imagem reutilizável para o estudo da dinâmica traducional em diversos sistemas relevantes para doenças, sem necessidade de marcação dependente de reagentes.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Reduz a ambiguidade mecanicista no controle da tradução ao fornecer observação direta em escala nanométrica da arquitetura de polissomos.
- Valor Operacional: Elimina a necessidade de fixação, marcação ou processamento pesado pós-coleta, simplificando o fluxo de trabalho e reduzindo a variabilidade.
- Valor Estratégico: Orienta decisões de prosseguimento ou interrupção ao oferecer insights precoces sobre a relação estrutura-função nos efeitos traducionais mediados pelo alvo.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de alvos com base em mecanismos traducionais validados em tecidos relevantes para a doença.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência na purificação de polissomos, fracionamento em gradiente de densidade e operação de microscopia de força atômica (AFM).
- Depende do acesso à ultracentrifugação, instrumentação de AFM e preparação de tampões livres de RNase.
- Necessita de manuseio padronizado das amostras para garantir deposição consistente sobre a mica e preservação da estrutura nativa dos polissomos.
- Deve levar em conta a variabilidade específica do tecido quanto ao rendimento e estabilidade dos polissomos, especialmente em amostras cerebrais pós-mortem ou congeladas.
- É limitado pela necessidade de treinamento especializado nas técnicas de preparação de amostras e de imagem por AFM, conforme observado no requisito de demonstração do procedimento.
