Isolando células-tronco do folículo piloso e epidérmico queratinócitos da Dorsal rato Pele

O objetivo geral deste protocolo é isolar diferentes populações de células-tronco e queratinócitos epidérmicos da pele dorsal do camundongo. Este protocolo permite ao usuário isolar simultaneamente várias populações de células da pele dorsal do camundongo. As principais vantagens dessa técnica são que ela é rápida, confiável e pode ser usada para isolar tipos específicos de células de interesse de uma mistura de populações heterogêneas de células da pele.

Demonstrando o procedimento estará o Dr. Yahav Yosefzon do meu laboratório. Comece usando uma tesoura elétrica para raspar todos os pelos da pele dorsal de um camundongo de 50 a 80 dias na fase telógena do ciclo do folículo piloso, mantendo a tesoura o mais próximo possível da pele, sem danificar a pele e a camada subcutânea. Em seguida, use etanol 70% para desinfetar a pele e remover qualquer resíduo de cabelo.

Coloque o mouse em uma almofada de dissecação. Em seguida, use uma pinça para levantar a pele perto da cauda e corte a pele com uma tesoura. Para colher toda a pele dorsal, corte cuidadosamente o tecido na direção póstero-anterior, separando a pele da fáscia.

Quando toda a pele tiver sido removida, prenda as duas bordas adjacentes do tecido em um tapete de dissecação, com o cabelo voltado para baixo. Em seguida, usando uma pinça curva, aplique uma leve pressão para evitar que a pele rasgue e raspe suavemente a gordura com um bisturi embotado até que a derme esteja clara e limpa. Quando toda a gordura tiver sido removida, coloque a derme da pele voltada para baixo em uma placa de cultura estéril de 100 milímetros e endireite o tecido até que não haja dobras.

Lave a pele com 10 mililitros de PBS sem cálcio e magnésio, alisando a pele novamente conforme necessário. Em seguida, remova o PBS e incube o tecido em 10 mililitros de 0,25% de tripsina, cuidando para que a pele fique desdobrada e flutuando livremente. No final da incubação, usando uma pinça curva para manter a pele no lugar, raspe todo o cabelo da pele, começando pela cauda e seguindo a direção do crescimento do cabelo.

Como os folículos tendem a formar pequenos aglomerados, raspe pequenas áreas de cada vez para reduzir o tamanho dos aglomerados o máximo possível. Quando todos os folículos pilosos tiverem sido coletados, transfira a pele sem pelos para uma nova placa de cultura e hidrate o tecido com 10 mililitros de PBS sem cálcio e magnésio. Confirme se todos os folículos pilosos foram removidos.

Em seguida, use um bisturi e uma pinça para quebrar os folículos até obter uma única suspensão do folículo piloso. Em seguida, triture vigorosamente a solução do folículo piloso com uma pipeta de 10 mililitros por alguns minutos para quebrar todos os aglomerados. Em seguida, transfira as células para tubos de 50 mililitros no gelo, pré-rotulados com o animal e os números das amostras.

Agora aspire o PBS da pele e use-o para enxaguar o prato de cultura de células que continha a suspensão do folículo piloso. Junte a lavagem com as células do folículo piloso e filtre a suspensão celular através de um filtro de células de 70 mícrons em um novo tubo de 50 mililitros. Lave o primeiro tubo de 50 mililitros e o filtro com 10 mililitros de tampão de coloração.

Em seguida, filtre a suspensão através de um filtro de 40 mícrons em um novo tubo de 50 mililitros e lave o segundo tubo com cinco a 10 mililitros de tampão de coloração recente. Em seguida, gire as células duas vezes, lavando-as em cinco mililitros de tampão de filtragem fresco durante a segunda centrifugação. Após a segunda centrifugação, ressuspenda o pellet em 800 microlitros de tampão de coloração fresco.

Em seguida, transfira 25 a 50 microlitros de células para os tubos de controle não corados e DAPI e adicione tampão de coloração suficiente para elevar o volume total em cada tubo de controle para 300 microlitros. Agora adicione os anticorpos primários e DAPI aos tubos de amostra apropriados e misture as células com movimentos suaves. Rotule as células por 30 minutos no gelo no escuro com movimentos a cada 10 minutos para mantê-las em suspensão.

No final da incubação, lave as células com aproximadamente quatro mililitros de tampão de coloração por tubo e ressuspenda os pellets em 800 microlitros de tampão de coloração. Em seguida, filtre as células em tubos de fax com tampas de filtro de células para garantir uma suspensão de célula única durante a análise. Nesses gráficos, são mostrados diferentes padrões de expressão da superfície celular CD34 e Sca-1 dentro da população alfa seis beta positiva de células epiteliais da pele.

As células foram primeiro fechadas de acordo com sua expressão de integrina alfa seis e integrina beta um. As células positivas para integrina alfa seis positivas foram então bloqueadas de acordo com sua expressão de CD34 e Sca-1. Duas populações distintas de células foram observadas.

As células alfa seis beta CD34 positivas para Sca-1 negativo, que representam as células-tronco do folículo piloso, e as células alfa seis beta uma Sca-1 positivas para CD34 negativas, que representam os queratinócitos epidérmicos. Normalmente, 1,5 a cinco vezes 10 elevado a quinto alfa seis beta um células positivas por animal ou células-tronco do folículo piloso CD34 positivas. Uma vez dominada, essa técnica pode ser concluída em aproximadamente oito horas, se executada corretamente.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como dissociar a pele dorsal do camundongo e isolar as células-tronco do folículo piloso e os queratinócitos epidérmicos.