Um método simplificado e eficiente para isolar os queratinócitos humanos primários do tecido da pele de adultos

O objetivo geral deste vídeo é apresentar um novo método simples para isolar e cultivar células epidérmicas humanas primárias de um tecido cutâneo adulto. Este método avançado é mais adequado para produzir um grande número de células epidérmicas de alto potencial para aplicações laboratoriais e clínicas. Lave o lenço com PBS antes de pesar.

Pesar o tecido cutâneo por meio de balança eletrônica. Enxágue o tecido da pele com etanol 70% por 30 segundos. Incube o tecido em PBS com antibióticos duas vezes por cinco minutos de cada vez.

Transfira o tecido para outro prato estéril e homogeneize completamente usando lâminas de bisturi. Adicione 200 microlitros de PBS a cada cinco minutos para manter o tecido úmido. Transferir o tecido homogeneizado para um tubo de 50 mililitros.

Adicione 10 mililitros de mistura enzimática para cada grama de tecido da pele. Misture bem as enzimas com os tecidos homogeneizados. Incube a mistura em banho-maria a 37 graus Celsius com agitação.

Depois disso, adicione 1/5 do volume de 0,25% de tripsina. Continue a incubação por 30 minutos em banho-maria a 37 graus Celsius. Adicione a solução de Dnase I à mistura na proporção de um para 100.

Em seguida, incube por mais cinco minutos. Pare o processo de digestão adicionando o mesmo volume de meio de neutralização. Pipete a solução para cima e para baixo cerca de 20 vezes.

Filtre as células dissociadas através de um filtro de células de 100 micrômetros para remover os detritos do tecido. Centrifugar a 200 g durante cinco minutos. Observe o pellet no fundo do tubo.

Remova os sobrenadantes e lave o pellet celular com 10 mililitros de meio neutralizante. Em seguida, centrifugue a 200 g durante cinco minutos. Ressuspenda o sedimento celular no meio de inoculação com inibidor de ROCK 10 micromolar.

Colocar duas vezes 10 elevado à sexta célula numa placa de cultura de 100 milímetros. Após três dias, substituir o meio de inoculação por meio de queratinócitos isento de soro. Troque o meio a cada dois dias.

Quando as células atingirem cerca de 80% da densidade, passe as células. Lave as células com PBS. Se necessário, tripsinize por dois minutos e lave as células com PBS para remover as células dérmicas contaminadas.

Adicione o mesmo volume de meio de neutralização. Centrifugar a 200 g durante cinco minutos. Por fim, remova os sobrenadantes e ressuspenda o pellet celular.

Os queratinócitos isolados de tecidos da pele humana foram incubados separadamente por dois métodos. O método convencional é uma digestão em duas etapas que envolve um procedimento de dois dias. Por outro lado, o novo método é uma digestão em uma etapa que leva cerca de três horas para ser executada.

No terceiro dia, podemos encontrar facilmente muitos aglomerados de células cultivados pelo novo método, enquanto esse fenômeno não ocorre ao usar o método convencional. No quinto dia, observou-se que o novo método produziu uma maior quantidade de células primárias. Para testar o estado de diferenciação de queratinócitos cultivados, analisamos o marcador basocelular K5 e o marcador de diferenciação terminal Loricrin.

Descobrimos que 90% do total de células eram K5 positivas, mas menos de 10% das células expressaram Loricrina na passagem três, indicando que são queratinócitos indiferenciados. Verificamos a expressão de vimentina que é expressa no fibroblasto dérmico para examinar a contaminação das células dérmicas durante o isolamento. Descobrimos que cerca de 3% das células dérmicas apareceram na passagem inicial, mas apenas cerca de 0,02% das células dérmicas foram detectadas na passagem três, indicando uma alta pureza das células epidérmicas após a passagem.