Formação Automated Lipid bicamada da membrana Usando um polidimetilsiloxano Thin Film

O objetivo geral deste procedimento é descrever um método que pode ser usado para estudar a formação automatizada de bicamadas lipídicas usando um filme fino de polidimetilsiloxano. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo dos nanobiossensores em relação às interações membrana-proteína. A principal vantagem dessa técnica é que a formação da bicamada lipídica é automatizada e reprodutível.

Para começar, prepare a solução tampão combinando cloreto de potássio, cloridrato de tris e EDTA em água destilada. Em seguida, ajuste o PH da solução para 8,0. Em seguida, filtre a solução usando um filtro de 0,2 mícron e autoclave a solução a 121 graus Celsius por 15 minutos.

Em seguida, prepare a solução lipídica para pré-pintura dissolvendo 3% do lipídio em uma mistura composta por duas partes de undecano e oito partes de hexadecano em volume. Agite a solução durante a noite usando um rotador. Além disso, prepare a solução lipídica para a formação da membrana dissolvendo 0,1% do lipídio na mesma mistura de duas partes de undecano e oito partes de hexadecano em volume.

Mexa esta solução durante a noite em um rotador também. Para preparar um filme fino PDMS, misture nove partes de pré-polímero com uma parte de agente de cura em um copo de mistura. Coloque cinco gramas dessa mistura em uma placa de Petri e gire a camada a 800 rpm por 10 segundos para formar um filme de 200 a 250 mícrons de espessura.

Em seguida, coloque a placa de Petri em um dessecador a vácuo e puxe um vácuo de 100 militorr por duas horas para remover as bolhas de ar residuais. Em seguida, asse o filme fino em um forno por cinco horas a 70 graus Celsius para polimerizar o PDMS. Depois de resfriado, corte o filme fino polimerizado em quadrados de dois centímetros por dois centímetros e use um punção de 500 mícrons de diâmetro para fazer uma pequena abertura no centro do quadrado.

Em seguida, use uma micropipeta para pré-pintar as aberturas com um microlitro da solução lipídica a 3%. Para criar a câmara de membrana lipídica preta, projete dois blocos simétricos para a câmara usando um software de desenho 3D. Em seguida, fabrique a câmara usando um bloco de PTFE e uma máquina CNC.

Para montar a câmara, coloque o filme fino PDMS pré-pintado entre os dois blocos de PTFE, de modo que a abertura do filme fino PDMS seja centralizada com o orifício na câmara. Use vidro de cobertura e graxa a vácuo para selar as bordas externas da câmara. Uma vez selada, imobilize a câmara montada usando porcas e parafusos.

É importante certificar-se de que a câmara esteja bem vedada para que não haja vazamento de líquido. Usando uma pipeta, deposite 0,5 microlitros da solução lipídica a 0,1% na abertura do filme fino PDMS, montado com a câmara. Em seguida, coloque a câmara em um ambiente resfriado abaixo de 10 graus Celsius e guarde-a até que seja necessário.

Para formar uma membrana lipídica preta com automontagem acelerada, retire a câmara da geladeira e adicione dois mililitros da solução tampão em cada lado da câmara. Deixe a câmara de lado por 10 minutos até que o precursor da membrana congelada descongele. Em seguida, coloque a câmara em um micromanipulador para controlar com precisão a elevação em relação à fonte de luz e ao microscópio.

Usando um iluminador de fibra óptica halógena, ilumine um lado da câmara para iluminar a abertura do filme fino PDMS. Do outro lado, coloque uma objetiva de 20x alinhada com a abertura e observe o centro onde a cor se torna mais brilhante que o anel. Para medição elétrica, prepare eletrodos de cloreto de prata colocando um fio de prata de 208 micrômetros de espessura em uma solução de hipoclorito de sódio por pelo menos um minuto.

Em seguida, conecte os eletrodos a um amplificador de microeletrodo. Em seguida, coloque os eletrodos de cloreto de prata em cada lado da câmara, de modo que fiquem na solução tampão. Usando um software de eletrofisiologia, aplique uma forma de onda triangular de 10 milivolts através da membrana para adquirir uma onda quadrada.

Registre as propriedades elétricas da membrana clicando no botão de gravação. Continue gravando até que uma onda quadrada uniforme seja observada. Em seguida, saia da gravação clicando no ícone quadrado preto.

Dois métodos podem ser empregados para incorporar a gramicidina A na bicamada lipídica. Primeiro, a gramicidina A pode ser adicionada diretamente à solução lipídica antes de espalhar a solução lipídica na abertura do filme fino do PDMS. Em segundo lugar, a solução de gramicidina A pode ser adicionada à câmara quando uma bicamada lipídica se forma.

Para observar as atividades do canal de gramicidina A, aplique 100 milivolts através da membrana a uma taxa de amostragem de 5 kilohertz para medir o potencial de retenção da membrana. Registre as propriedades elétricas como feito anteriormente, clicando no botão de gravação. À medida que as atividades do canal iônico são mostradas, continue gravando até que vários saltos de corrente sejam observados para confirmar a incorporação do canal iônico.

Uma vez confirmado, saia da gravação clicando no ícone de quadrado preto. Quando a gravação terminar, filtre os dados com um filtro de Bessel passa-baixa a 100 hertz usando um software de eletrofisiologia. Observe os saltos atuais nos dados de potencial de retenção filtrados.

Esses saltos representam a dimerização de um canal iônico gramicidina A. Quando o precursor da membrana congelada foi levado à temperatura ambiente para descongelar, a formação da bicamada lipídica é facilitada devido à extração de solvente hidrofóbico no filme fino do PDMS. Esta sequência de imagens mostra a formação de uma bicamada lipídica, que se auto-monta quando aquecida a partir de sua forma congelada.

Aqui, a condutância elétrica ilustra a incorporação e dimerização da gramicidina A. Após a dimerização, a gramicidina A forma um canal iônico e os níveis de condutância saltam para 28 picosiemens, o que é consistente com os resultados de relatórios anteriores e mostra a incorporação imediata desse antibiótico na bicamada. Nossa técnica de formação de membrana fornece uma ferramenta poderosa para estudos de membranas celulares e nanocanais, em contraste com as técnicas convencionais que têm potenciais limitados para aplicação prática. Nosso sistema não requer experiência para formação de membrana ou incorporação de canalização iônica, tornando-o adequado para aplicações de triagem de medicamentos e biossensoriamento.