Abordagens genéticas e bioquímicas para In Vivo e In Vitro Avaliação de oligomerização da proteína: A Case Study rianodina Receptor

O objetivo geral dessas três técnicas experimentais complementares, a saber, levedura de dois híbridos, co-imunoprecipitação e reticulação química, é avaliar as interações proteína-proteína e, em particular, a auto-associação, e determinar a composição estequiométrica dos homo-oligômeros de proteínas. Esses métodos podem ajudar a responder a questões-chave no campo das cardiopatias, como oligomerização de receptores ultra-secos, arritmias cardíacas subjacentes e morte súbita. As principais vantagens dessas técnicas são sua triagem de rendimento relativamente alto, facilidade de uso e resultados altamente reprodutíveis, exigindo equipamentos e reagentes mínimos.

As implicações dessas técnicas se estendem à terapia da doença cardíaca arritmogênica, pois ajudam a estabelecer o mecanismo molecular de ação das drogas antiarrítmicas. Geralmente, os indivíduos novos na co-imunoprecipitação terão dificuldades devido ao descarte potencial das esferas de agarose da proteína, que são muito pequenas, ao aspirar o sobrenadante durante as etapas de centrifugação. Neste ensaio de dois híbridos de levedura, células de levedura na fase intermediária são usadas para transformação.

Colha as células por centrifugação, ressuspenda cada pellet em cinco mililitros de água estéril e agrupe as suspensões celulares. Centrifugar a suspensão celular. Depois de descartar o sobrenadante, ressuspenda o pellet de levedura em um mililitro de acetato de lítio one-x estéril recém-preparado e TE. As células de levedura competentes devem ser utilizadas no prazo de uma hora após a preparação.

Prepare amostras de plasmídeo misturando isca e DNA de plasma alvo com 100 microgramas de DNA transportador de testículos de arenque. Para cada tubo de 1,5 mililitro, adicione 100 microlitros da suspensão de levedura competente e 600 microlitros de acetato de lítio one-X e solução de PEG, e vórtice por cerca de 30 segundos. Incubar a 30 graus Celsius por 30 minutos, com agitação.

Adicione 80 microlitros de dimetilsulfóxido e misture bem por inversão suave. Choque térmico por 15 minutos em banho-maria a 42 graus Celsius, enquanto mistura a cada dois ou três minutos. Resfrie a suspensão celular no gelo por dois minutos e centrifugue para recuperar o fermento.

Ressuspenda cada pellet celular em 100 microlitros de TE um-X. Coloque as células em placas médias SD mínimas apropriadas para manter a pressão seletiva nos plasmídeos da isca e do alvo. Incube as placas de cabeça para baixo a 30 graus Celsius por quatro a cinco dias. As colônias de leveduras estão prontas para este ensaio quando têm cerca de dois milímetros de diâmetro.

Pipete 2,5 mililitros de tampão Z recém-preparado e solução X-gal para uma placa limpa de 100 milímetros e coloque um papel de filtro de celulose na placa. Coloque um novo papel de filtro sobre a superfície da placa com as colônias de levedura a serem analisadas. Use uma pinça para esfregar suavemente o papel de filtro na placa e deixe por aproximadamente cinco minutos para que as colônias se fixem.

Ao usar equipamento de proteção individual adequado, levante cuidadosamente o papel de filtro e mergulhe-o em uma poça de nitrogênio líquido por 30 segundos. Deixe o papel de filtro congelado descongelar em temperatura ambiente por dois minutos. Coloque o papel de filtro com o lado da colônia para cima em cima do papel de filtro pré-embebido dentro da placa de 100 milímetros e incube a 30 graus Celsius até que as colônias azuis apareçam.

Um dia antes da transfecção, alimente as células HEK293 em uma placa de Petri de 100 milímetros, para que as células sejam 60 a 70 por cento confluentes no dia seguinte. Cultivar por 16 a 18 horas em incubadora umidificada. No dia da transfecção, diluir 24 microgramas de DNA plasmático com 60 microlitros de cloreto de cálcio 2,5 molar e água desionizada estéril para obter um volume total de 600 microlitros.

Vórtice para misturar. Adicione o DNA plasmático mais a solução de cálcio gota a gota em um tubo de 50 mililitros contendo 600 microlitros de solução salina tamponada com HEPES 2X enquanto mistura constante e vigorosamente por vórtice. Incubar durante 20 minutos à temperatura ambiente para permitir a formação de complexos de ADN plasmáticos de fosfato de cálcio.

Após a incubação de 20 minutos, vórtice brevemente e adicione a solução gota a gota nas células HEK293 para cobrir toda a área da superfície da placa de Petri. Incube as células a 37 graus Celsius em cinco por cento de dióxido de carbono. Após aproximadamente seis horas, troque o meio de crescimento e coloque as células de volta na incubadora.

24 horas após a transfecção, colha as células conforme descrito no texto do protocolo. Ressuspenda o pellet celular em 500 microlitros de tampão de homogeneização gelado e transfira a suspensão celular para um tubo de 1,5 mililitro contendo contas de vidro. Use uma agulha fina presa a uma seringa de um milímetro para homogeneizar as células no gelo.

Com a tampa do tubo fechada, perfure a tampa com a agulha e disperse a suspensão celular vigorosamente através das esferas de vidro. Centrifugue a 1500 vezes G por 10 minutos a quatro graus Celsius para remover núcleos e células intactas. Guardar o sobrenadante que representa a fracção pós-nuclear para utilização em experiências de co-imunoprecipitação ou de reticulação.

Para ser este procedimento, solubilize a fração subcelular pós-nuclear com 0,5 por cento de rachaduras e incube por pelo menos duas horas a quatro graus Celsius com mistura constante. Centrifugue a 20.000 vezes G por 10 minutos a quatro graus Celsius para granular o material insolúvel. Salve o sobrenadante.

Isso é chamado de lisado celular. Prepare grânulos de agarose de proteína A em tampão de imunoprecipitação, conforme descrito no texto do protocolo. Adicione um micrograma do anticorpo imunoprecipitante a um tubo contendo proteína A.

Como controlo negativo, adicionar um micrograma de IGG não imune ao outro tubo contendo proteína A. Incubar durante pelo menos duas horas a quatro graus Celsius, com mistura constante. Recuperar os grânulos por centrifugação e eliminar cuidadosamente o sobrenadante por pipetagem.

Transfira 200 microlitros do lisado celular para cada um dos dois tubos contendo anticorpo e grânulos de proteína A. Incubar por pelo menos duas horas a quatro graus Celsius com mistura constante para permitir a ligação antígeno-anticorpo. Recupere as esferas e lave com 200 microlitros de tampão de imunoprecipitação.

Incube por 10 minutos a quatro graus Celsius com mistura. Após três lavagens, descarte cuidadosamente o sobrenadante pipetando. Adicione 30 micorlitros de tampão de carga de proteína aos grânulos e centrifugue a 1500 vezes G por dois minutos a quatro graus Celsius.

Salve o sobrenadante contendo a amostra co-IP aludida para a página SDS subsequente e immunoblotting. Para realizar a reticulação química, centrifugue a fração subcelular pós-nuclear em agregados de proteínas de pellets. Guarde o sobrenadante e divida em oito alíquotas de 20 microlitros cada.

Adicione glutaraldeído de 0,0025% volume por volume a apenas uma amostra. Inicie o cronômetro e deixe o glutaraldeído reagir à temperatura ambiente pelo período de tempo indicado. Pare a reação de glutaraldeído no tempo especificado com dois por cento de hidrazina volume por volume e adicione cinco microlitros de tampão de carga de proteína 5X para desnaturar as proteínas.

A levedura de dois híbridos foi usada para rastrear construções sobrepostas abrangendo todo o comprimento da sequência do peptídeo do receptor de rianodina para interação com AD4L e fragmento terminal final. Os ensaios beta-gal de papel de filtro de elevação de colônia produziram colônias de cor azul vívida apenas para o par BT4L / AD4L, mostrando que o AD4L interage consigo mesmo. Colônias azuis pálidas foram detectadas para o par BT8 / AD4L, sugerindo uma associação secundária e mais fraca com o domínio C-terminal extremo.

Os resultados quantitativos dos ensaios de beta-gal líquido indicaram interação robusta BT4L/AD4L, equivalente em força à associação conhecida entre a proteína P53, pVA3 e o antígeno T grande SV40, pTD1. A interação BT8/AD4L foi consideravelmente mais fraca. Os achados de dois híbridos de levedura são reforçados por experimentos de co-imunoprecipitação após a expressão transitória de AD4L marcado com HA e BT4L marcado com cMyc em uma linhagem celular de mamíferos.

Foi observada imunoprecipitação direta de AD4L marcado com HA por um anticorpo 2 HA, e BT4L marcado com cMyc foi recuperado apenas na imunoprecipitação anti-HA. A reticulação química foi realizada em homogeneizado celular expressando cMyc BT4L seguido de página SDS e immunoblotting, usando um anticorpo para cMyc. Além do monômero de 100 kilodaltons, uma banda de proteína de alta massa molecular de aproximadamente 400 kilodaltons foi detectada de maneira dependente do tempo, indicando a formação de receptor de rianodina e tetrâmero terminal.

Ao tentar a transfecção de células de mamíferos por precipitação de fosfato de cálcio, é importante lembrar de vórtice constante e vigorosamente o tampão fosfato em um tubo grande para aeração eficiente, enquanto adiciona muito lentamente a solução de consumo de DNA plasmático. Após esses procedimentos, outros métodos como confocal em microscopia em imagens de cálcio podem ser realizados. Essas técnicas devem ajudar a responder a perguntas adicionais, como a localização e as propriedades de liberação de cálcio dos canais receptores de rianodina em células vivas.

Após seu desenvolvimento, essas técnicas abriram caminho para pesquisadores em diversos campos da sinalização celular avaliarem a homo-oligomerização de proteínas, um processo biológico fundamental que regula a atividade de fatores de transcrição, enzimas, canais iônicos e receptores.