Name: Abordagens genéticas e bioquímicas para In Vivo e In Vitro Avaliação de oligomerização da proteína: A Case Study rianodina Receptor (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 43 s
Description: Aprenda a avaliar oligomerização do receptor rianodina usando ensaio de dois híbridos em levedura, co-imunoprecipitação e reticulação química. Esses métodos revelam interações proteicas cruciais para compreender arritmias cardíacas.

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Este trabalho foi financiado pela British Heart Foundation de Bolsas de SZ (FS / 08/063 e FS / 15/30/31494).

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Os autores não têm nada a declarar.

A formação de homo-oligómeros de proteínas é um processo biológico fundamental que regula a actividade de factores de transcrição, enzimas, canais iónicos e receptores 25,26. Importante, oligomerização proteína tem também implicações patológicas incluindo neurodegeneração e doença cardíaca arritmogênica 4,27. As metodologias descritas neste artigo são usados ​​para identificar interações de domínio do domínio de mediação proteína auto-associação e oligomerização. Abaixo, destacamos nas etapas críticas dentro de cada protocolo, e discutimos considerações importantes, limitações e solução de problemas. O sistema Y2H pode ser utilizado pela primeira vez para o rastreio de potenciais parceiros de proteína interagindo por causa de sua relativamente alta throughput screening, facilidade de uso e resultados altamente reprodutíveis. procedimentos y2h são realizadas em um laboratório de microbiologia com incubadoras padrão (placa ou shaker) e instalações de sala de contenção. A utilização de FRcélulas competentes preparadas eshly (passo 1.1.8) é crítica para a transformação de levedura de alta eficiência, enquanto que para obter os melhores resultados em ensaios β-Gal, recém colónias de levedura crescido (até 5 dias de idade) deve ser utilizada (passo 1.2.3). Sistemas baseados em outros do que GAL4 e / ou genes repórter adicionais / alternativas fatores de transcrição estão disponíveis e, portanto, isca e plasmídeos presa deve ser combinado com a estirpe Y2H adequado. Algumas estirpes devem ser cultivadas na presença de 3-amino-1,2,4-triazole, um inibidor competitivo da proteína HIS3, de modo a extinguir qualquer expressão constitutiva do gene repórter HIS3 de 7,8. Expressão de proteínas de fusão de iscas e de destino deverá ser verificada por imunotransferência 17. No caso de isca / proteínas de fusão de presa são tóxicos para as leveduras, os níveis mais baixos de proteína toleráveis ​​poderia ser conseguido por clonagem em diferentes vectores de isco, onde / é presa expressão conduzido por um promotor diferente. Além disso, é essencial para assegurar tproteínas de fusão de isca / rapina chapéu não exibem a atividade do gene repórter autónoma. activação do gene repórter Autónoma pode ser resgatado por modificar a construção para remover a região responsável, ou trocando o GAL4 DNA-BD e fusões AD para as duas proteínas testadas. Além disso, os domínios transmembranares são melhor omitido de construções de isca / presa porque pode induzir misfolding ou mislocalization de proteínas de fusão em compartimentos de membrana intracelular. Com efeito, a principal desvantagem do sistema Y2H é que as proteínas isco e alvo estão localizadas no núcleo de levedura de distância da sua localização subcelular fisiológico e potencialmente desprovido modificações pós-traducionais específicas, resultando em falsos-positivos ou falsos negativos interacções 6-9 . Os sistemas de expressão heterólogos de mamífero são mais adequados para o estudo de proteínas de membrana integrais de mamífero em termos de conformação, de modificações pós-traducionais e localização subcelular.Um dos métodos de transfecção celular mais utilizado é a precipitação de fosfato de cálcio, principalmente por causa do equipamento mínimo e reagentes necessários 11,15. Métodos alternativos, ou seja, electroporação, lipos somas, lípidos catiónicos e polímeros, podem originar uma maior eficiência de transfecção, dependendo da linha celular e construção utilizada. Em geral, os factores que afectam a eficiência da transfecção primárias são a qualidade do ADN de plasmídeo e de células de saúde / viabilidade. Os melhores resultados são obtidos quando o DNA de plasmídeo de mais alta pureza (260 nm / 280 nm Taxa de absorção de ~ 1,8) e células que se dividem activamente são utilizados. As células devem, portanto, ser transfectado em não mais do que 60 - 70% de confluência (passo 2.1.2), porque a capacidade de tomar-se DNA estranho está relacionada com a área de superfície da célula exposta ao meio 11. Além disso, a inclusão de antibióticos no meio de cultura durante a transfecção (passo 2.1.3) não é aconselhável devido a um aumento da morte celular 15. Fou precipitação com fosfato de cálcio, em particular, a preparação, cuidadosa e ajustamento do pH (de 7,05 precisamente) da solução de HBS 2x (passo 2.1.1), e a formação correcta de DNA plasmídeo / cálcio / fosfato complexos por mistura vigorosa (passo 2.1.5) são passos críticos para alta transfecção eficiência. Tipicamente, a expressão da proteína por picos de transfecção transiente dentro de 24-72 horas. Uma vez que as células são colhidas, procedimentos subsequentes devem ser realizadas a 4 ° C para minimizar a actividade de protease, e adição de inibidores de protease é recomendado. homogeneização celular deve ser seguido por um passo de centrifugação para remover os núcleos porque o ADN cromossómico pode aumentar a viscosidade da solução e aumentar a ligação não específica. Assim, homogeneização por meios mecânicos em um tampão iso-osmótico é preferido, usualmente na (0,3 M) de sacarose, ou (150 mM) de NaCl. De um modo geral, os tampões à base de sacarose são conhecidos para melhorar a estabilidade da proteína e reduzir a agregação de proteínas não-nativo potencial, mas devido a phidratação referencial na superfície da proteína, as interacções proteína-proteína electrostáticas são favorecidos. Por outro lado, tampões à base de sal influenciar a carga líquida de grupos laterais de aminoácidos carregados na superfície da proteína, tendo assim um viés para mais interações hidrofóbicas à base 28. Co-IP é o ensaio bioquímico mais vulgarmente empregues para avaliar as interacções proteína-proteína, especialmente a partir de tecido nativo. Sua principal desvantagem é a exigência de anticorpos altamente específicos validados para uso em IP e immunoblotting 10,16,18. Assim, as proteínas recombinantes são frequentemente marcado com um epítopo de péptido, por exemplo., Hemaglutinina da gripe (YPYDVPDYA) ou cMyc humana (EQKLISEEDL), para o qual os anticorpos específicos de elevada afinidade estão disponíveis comercialmente. Se desejado, o anticorpo imunoprecipitação pode ser quimicamente conjugados para a Proteína-A resina para evitar a sua eluição e detecção durante a fase de imunotransferência que podem obscurecer o co-precipitado PRotein 16; Para conseguir isso, temos utilizado com sucesso o agente de ligação cruzada química 3,3&#39;-ditiobis (sulfosuccinimidylpropionate) 24. É imperativo que um detergente apropriado está incluído no tampão de IP e o material insolúvel das células homogeneizadas é removido por centrifugação para minimizar a ligação não específica (passo 3.1.3). A escolha e a concentração de detergente são considerações importantes: detergentes fortes e / ou concentrações mais elevadas reduzem substancialmente não específico de ligação, mas podem também abolir X: interacção proteína Y, enquanto que concentrações mais baixas ou detergentes mais leves pode permitir uma interacção fraca para ser observada, mas pode resultará em ligação não-específica excessiva. Detergentes força intermediários são os preferidos, por exemplo, Triton X-100 a 0,5 -. 1% de concentração. Para reduzir ainda mais a ligação não específica, uma proteína neutro (por exemplo, albumina de soro bovina a 100 ug / ml) pode ser incluído no tampão de IP, e / ou do lisado celular pode ser pré-Cleared com incubação prévia com resina de Proteína-A sozinho. O número de lavagens devem ser optimizados para a X: Y par testado, tipicamente três de 10 min lavagens com tampão IP (passo 3.1.9). Em qualquer caso, uma amostra de co-IP com IgG não-imune, como o anticorpo imunoprecipitar deve sempre ser processados ​​em paralelo para servir de controlo negativo (passo 3.1.6). A principal vantagem de reticulação química é que informa sobre a composição estequiométrica da proteína de homo-oligómero. O glutaraldeído é um agente de ligação cruzada comumente usado, porque não requer equipamento especializado e gera termicamente e quimicamente ligações cruzadas estáveis ​​entre proteínas que interagem 19,20. Os compostos com grupos amino livres deve ser omitido dos buffers de ensaio (passo 3.2.1), porque eles vão parar a reacção química. a concentração de glutaraldeído e tempo de reacção (passo 3.2.4) deve ser optimizado para o complexo de proteína oligomérica de interesse. A principal desvantagem desta técnica, especialiado quando realizada em preparações de células inteiras, é a não especificidade da reacção química que poderia produzir agregados de proteínas artificiais que não têm significado biológico. Alternativa in vivo (por ex., Fluorescência de ressonância de transferência de energia, a fluorescência bi-molecular ou de complementação de luminescência) e em técnicas in vitro (por ex., Cromatografia de exclusão de tamanho, ultracentrifugação analítica, de titulação isotérmica calorimetria) estão disponíveis para a caracterização da proteína de auto-associação e de avaliação de oligomerização estequiometria 29,30. Cada método tem as suas próprias vantagens e desvantagens, e que pode ser mais adequado para o estudo de uma proteína específica, dependendo de purificação de proteína / estabilidade e disponibilidade do equipamento / reagente. Os três métodos complementares aqui descritos em detalhe, nomeadamente Y2H, co-IP e a ligação cruzada, têm sido utilizados em combinação para fornecer evidências convincentes para RyR2 homo-oligomeR formação isoladamente e dentro de uma célula viva.

A contração do músculo esquelético e cardíaco é desencadeada por retículo sarcoplasmático Ca 2+ liberação mediada por RyR. Existem três isoformas RYR de mamífero com o canal funcional composta de quatro subunidades idênticas. Cada subunidade consiste de RyR uma grande porção N-terminal citoplasmático reguladora e uma pequena parte do terminal C contendo os domínios de transmembrana que formam uma alta condutância Ca 2+ poro. Intra anormal e inter-subunidades interações subjacentes disfunção canal RyR e resultar em doenças neuromusculares e cardíacos 1. A identificação e caracterização de domínios específicos envolvidos na estrutura RyR: relação de função é, portanto, crucial para a compreensão da fisiopatologia RyR. técnicas de interacção proteína-proteína bioquímicos tradicionais exigem quantidades substanciais de proteína purificada, muitas vezes produzidos em bactérias. Isto não é possível no caso de o RyR, uma muito grande membrana de protein composto de ~ 5000 aminoácidos, enquanto que os seus fragmentos recombinantes não são facilmente passível de expressão bacteriano e purificação. Assim, são necessários sistemas de expressão alternativos que envolvem células hospedeiras eucarióticas para as proteínas de membrana integrais de mamífero. Temos anteriormente empregue Y2H, co-IP e ensaios de ligação cruzada para demonstrar que colectivamente N-terminal de tetramerização é uma característica estrutural que é conservado entre os três isoformas de mamífero RyR 2,3. Mais importante, verificou-se que uma única mutação de ponto associado à doença cardíaca arritmogénica perturba N-terminal de auto-associação e resulta em um canal de RyR disfuncional 4. Também têm aplicado estas técnicas para estudos de oligomerização do RyR cauda citoplasmática de terminal-C 5, bem como o N-terminal do canal de Ca2 + intracelular homólogo de libertação, o receptor de inositol trifosfato 1,4,5 2. No ensaio Y2H, o interactiem entre duas proteínas (X e Y) é medido pela reconstituição de um factor de transcrição funcional (GAL4) e a activação subsequente de genes repórter 6-9. Dois vectores de clonagem diferentes são usados ​​para gerar fusões das duas proteínas testadas com os dois domínios fisicamente separáveis, independentes de GAL4: DNA-Binding Domain (DNA-BD) / proteína de fusão X (isca) e Activação de domínio (AD) / proteína Y fusion (alvo). O Y2H pode ser utilizado para testar se uma proteína interage com o próprio através da geração de fusões de AD da mesma proteína GAL4 DNA-BD e. Geneticamente modificada estirpes Y2H são GAL4 e GAL80 deficiente (GAL80 a proteína é um repressor de GAL4), bem como TRP1 e LEU2 deficiente (para proporcionar selecção nutricional para isco e presa plasmídeos, respectivamente). No núcleo de levedura, os péptidos de DNA-BD e Ad recombinantes são postos em proximidade física para produzir um factor de transcrição de GAL4 híbrido apenas através das suas fusões X: Y interaction. Esta abordagem permite o mapeamento genético rápida para detectar interacções proteína-proteína de activação da transcrição através do paralelo da prototrófica (codificação de HIS3 de uma enzima necessário para a biossíntese de histidina) e cromogénico (LacZ que codifica para β-galactosidase (β-Gal)) genes repórter. A principal vantagem do Y2H é que é um ensaio in vivo que detecta interacções proteína-proteína, mesmo fracas ou transitórios. Além disso, a detecção envolve a utilização simples de seleção de crescimento (em meio sem histidina) ou de um ensaio colorimétrico (β-Gal), sem necessidade de purificação das proteínas isco e de destino ou a geração de anticorpos específicos. Além disso, o Y2H pode ser utilizado para rastrear um conjunto de clones desconhecidos aleatórios (clones biblioteca de ADNc fundido com GAL4 AD) para novos parceiros de ligação de uma proteína isco, também dão acesso directo ao ADNc da proteína biblioteca. Para estender as observações y2h, independtécnicas bioquímicas ent pode ser empregue. Os ensaios de ligação cruzada combinados com imunotransferência co-IP e são métodos utilizados para detectar associações de proteínas em amostras de misturas complexas, por exemplo., Lisados ​​de células inteiras 10. A sua principal vantagem é que eles relatam em interacções proteína-proteína a partir de tecido nativo, ao contrário de outros métodos que requerem a utilização de proteínas recombinantes. As proteínas recombinantes podem também ser utilizados, normalmente expressos numa linha de células de mamífero, onde eles são susceptíveis de ter as suas modificações de conformação correcta e pós-tradução, assim como a localização subcelular. No entanto, uma vez que a co-IP e a ligação cruzada são, em ensaios in vitro fazendo uso de células homogeneizadas, é necessário confirmar se os dois parceiros de proteína são co-localizada na célula intacta 11. Rotineiramente usar a transfecção de células de mamífero para expressar HEK293 transientemente integral da membrana de mamíferos e de proteínas citosólicas usando o método de precipitação com fosfato de cálcio 2-4,12-14, Aqui descrito em detalhe. Esta é uma forma barata para entregar eficazmente o DNA de plasmídeo dentro das células, mas é dependente da linha de célula particular utilizado e a confluência celular, bem como a pureza do ADN do plasmídeo 11,15. O ensaio de co-IP envolve o isolamento da proteína nativa ou recombinante de interesse a partir de lisados ​​de células em condições não desnaturantes, permitindo a co-purificação de parceiros de interacção 10,16 putativos. É necessária a utilização de dois anticorpos independentes, o anticorpo para o isolamento de imunoprecipitar a proteína X, e o anticorpo para a detecção de imunotransferência Y. parceiro de proteína que ele pode ser utilizado para testar se uma proteína interage com o próprio através da geração de dois diferentes fusões com dois epitopo diferente marcações (por exemplo., HA e cMyc). O anticorpo é ligado imunoprecipitação através da sua região Fe em Proteína-A (ou proteína-G, dependendo das espécies de animais em que o anticorpo foi produzido), queestá conjugado a agarose (ou sefarose) resina. Proteína X é precipitado pelo anticorpo: Proteína-A resina após a incubação com o ligado de células, ou seja, a fracção solúvel em detergente de células homogeneizadas. Proteína imuno-complexos são eluídas com tampão contendo SDS e depois analisadas por SDS-PAGE e imunotransferência, utilizando um anticorpo para detectar a presença da proteína Y 17. Co-IP deve ser realizado com proteínas solúvel em detergente para evitar excessiva ligação não-específica. A escolha do detergente e da sua concentração, bem como o número de lavagens, deve ser optimizado para cada X: Y par 10,16,18. A ligação cruzada é empregue para determinar a estequiometria do complexo de proteína oligomérica. Ele baseia-se numa reacção química para criar ligações covalentes entre protï¿½meros interagindo adjacentes, e por conseguinte, permite a preservação do estado oligomérico da proteína durante a separação por SDS-PAGE. Existem inúmeros REAGE cross-linkingNTS de vários comprimentos e química dirigidos a diferentes grupos reactivos em proteínas, aminas primárias, tipicamente carboxílico ou grupos tiol. Aqui, nós descrevemos o uso de glutaraldeído (OHC (CH2) 3-CHO), um agente de reticulação homo-bi-funcionais, com dois grupos aldeído em ambas as extremidades que reagem com grupos amino livres presentes em resíduos de lisina 19,20. A reticulação é seguido de um modo dependente da concentração-tempo ou resultando na formação do aduto. Glutaraldeído reacção é parada com hidrazina (H 2 NNH 2) e amostras de proteína são, então, analisadas por SDS-PAGE e immunoblotting 17 para avaliar o seu estado de oligomerização. Devemos notar que a ligação cruzada não induz oligomerização, mas apenas cria pontes estáveis ​​entre complexos de proteínas pré-existentes. Considerações importantes ao realizar experiências de ligação cruzada incluem a escolha do agente de reticulação, a sua concentração e tempo de reação 19,20.

<table><tbody><tr><td><forte>PARTE 1 levedura dois-híbridos</forte></td>Incubadora de <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>placas</td><td>Hereaus</td><td>B6120</td><td>Usado a 30 > C</td></tr><tr><td>Incubadora de agitador orbital</td><td>New Brunswick Scientific</td><td>INNOVA 4300</td><td>Usado a 30 &deg; C com agitação a 230 - 250 rpm</td></tr><tr><td>Espectrofotômetro</td><td>Perkin Elmer</td><td>Lambda Bio+</td><td>Para medir OD600 de cultura de levedura; para medir a Absorbância a 420 nm em ensaio líquido b-Gal</td></tr><tr><td>Kit de Sistema de Dois Híbridos</td><td>2 Takara Clontech</td><td>K1604-1</td><td>Contém vetor de isca pGBKT7, vetor de presa pACT2&nbsp; e cepa de levedura Y190&nbsp;</td></tr><tr><td>Base de Nitrogênio de Levedura</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y0626</td><td>Para preparar meio de crescimento SD mínimo&nbsp;</td></tr><tr><td>Suplemento de abandono sem leucina e triptofano</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y0750</td><td>Para preparar o mínimo de meio de crescimento SD&nbsp;</td></tr><tr><td>Suplemento de abandono sem leucina, triptofano, histidina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y2001</td><td>Para preparar o mínimo meio de crescimento SD&nbsp;</td></tr><tr><td>Testículos de arenque portadores de DNA&nbsp;</td><td>Takara Clontech</td><td>630440</td><td>Para transformação de levedura</td></tr><tr><td>Papel de filtro Whatman Grau 5&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>WHA1005070</td><td>para uso em papel de filtro de elevação de colônias ensaio b-Gal</td></tr><tr><td>X-Gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-&beta;-D-galactopiranosídeo)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4252</td><td>para uso em papel de filtro de elevação de colônias ensaio b-Gal</td></tr><tr><td>ONPG (o-nitrofenil-&beta;-D-galactopiranosídeo)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N1127</td><td>para uso em ensaio</td></tr> <tr><td>de b-Gal líquido< FORTE>PARTE 2. Expressão de proteínas em uma linhagem celular de mamíferos</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEK293 linhagem celular</td><td>ATCC</td><td>ATCC&reg; &nbsp; CRL-1573 e comércio;</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora umidificada (5% CO2, 37 > C)</td> <td>SANYO</td><td>MCO-18AIC</td><td>Para cultura de células de mamíferos</td></tr><tr><td>DMEM (meio de Eagle modificado de Dulbecco)</td> <td>Invitrogen (ThermoFisher)</td> <td>41966</td><td>Para preparar meio de crescimento para células de mamíferos</td></tr><tr><td>Soro fetal bovino</td><td>Invitrogen (ThermoFisher)</td> <td>10500</td><td>Para preparar meio de crescimento para células de</td></tr><tr><td>mamíferos Contas de vidro</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8772</td><td>Para homogeneizar células</td></tr><tr><td>Agulha 23 G (0.6 x 30 mm)</td><td>BD Microlance</td><td>300700</td><td>Para homogeneizar células</td></tr><tr><td>Coquetel de inibidores de protease (Completo)&nbsp;</td><td>Roche</td><td>11873508001</td><td>Para prevenir proteólise</td></tr><tr><td><forte>PARTE 3. Métodos bioquímicos in vitro&nbsp; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN Tetra Cell (sistema SDS-PAGE)</td><td>Bio-Rad</td><td>1658000EDU&nbsp;</td><td>Para eletroforese em gel de poliacrilamida</td></tr><tr><td>Trans-Blot SD (Sistema de transferência semi-seco)</td><td>Bio-Rad</td><td>1703940</td><td>Para transferência eletroforética</td></tr><tr><td>Processador compacto de filme de raios-X</td><td>Xograph</td><td>X4</td><td>Para uso em immunoblotting</td></tr><tr><td>Glutaraldeído</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5882</td><td>Para uso em reticulação química</td></tr><tr><td>Proteína-A sepharose beads&nbsp;</td><td>GE Healthcare Ciências da Vida</td><td>17-5280-01&nbsp;</td><td>Para uso em ensaio co-IP</td></tr><tr><td>Anti-HA (Y-11 coelho policlonal IgG)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-805</td><td>Para uso em ensaio co-IP</td></tr><tr><td>IgG não imune a coelho Santa</td><td>Cruz Biotechnology&nbsp;</td><td>sc-2027</td><td>Para uso em ensaio co-IP</td></tr><tr><td>Anti-cMyc (9E10 IgG monoclonal de camundongo</td>)<td>Santa Cruz Biotechnology&nbsp;</td><td>sc-40</td><td>Para uso em immunoblotting</td></tr><tr><td>Anti-HA (16B12 IgG monoclonal de camundongo</td>)<td>Covance</td><td>MMS-101P</td><td>Para uso em immunoblotting</td></tr><tr><td>Anti-mouse IgG-HRP</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-2005</td><td>Para uso em immunoblotting</td></tr><tr><td>Hyperfilm ECL</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>28906836</td><td>Para uso em immunoblotting</td></tr><tr><td>ECL Western Blotting Substrate</td><td>Pierce ( ThermoFisher)</td><td>32106</td><td>Para uso em immunoblotting</td></tr></tbody></table>

abordagens genéticas e bioquímicas para<em&gt; in vivo</em&gt; e<em&gt; in vitro</em&gt; avaliação de oligomerização da proteína: a case study rianodina receptor

Genetic and Biochemical Approaches for In Vivo and In Vitro Assessment of Protein Oligomerization: The Ryanodine Receptor Case Study

A oligomerização é frequentemente um requisito estrutural para que as proteínas cumpram sua função celular específica. Por exemplo, a tetramerização do receptor de rianodina (RyR) é necessária para a formação de um poro funcional do canal de liberação de Ca2+. Aqui, descrevemos protocolos detalhados para a avaliação da autoassociação de proteínas, incluindo ensaios de levedura de dois híbridos (Y2H), co-imunoprecipitação (co-IP) e reticulação química. No sistema Y2H, a autointeração proteica é detectada pelo ensaio de β-galactosidase em levedura co-expressando GAL4 isca e fusões alvo da proteína de teste. A autointeração proteica é ainda avaliada por co-IP usando fusões marcadas com HA e cMyc da proteína de teste co-expressas em células HEK293 de mamíferos. A estequiometria precisa do homo-oligômero da proteína é examinada por reticulação e análise SDS-PAGE após a expressão em células HEK293. Usando essas técnicas diferentes, mas complementares, observamos consistentemente a auto-associação do domínio RyR N-terminal e demonstramos sua capacidade intrínseca de formar tetrâmeros. Esses métodos podem ser aplicados à interação proteína-proteína e estudos de homo-oligomerização de outras proteínas integrais de membrana de mamíferos.

No sistema Y2H, a isca: presa interacção é inicialmente testado por selecção em meio de crescimento de levedura falta (triptofano, leucina e) histidina e, subsequentemente, avaliadas por β-Gal ensaios de actividade enzimática (Figura 1). Levedura cultivadas em histidina falta médio tem taxa de crescimento lento, que depende da força da isca: interação proteína presa. O ensaio β-Gal é levada a cabo em levedura (cultivadas em meio sem triptofano e leucina única) seja crescente no suporte sólido (placas de agar) ou em cultura líquida, com os últimos resultados quantitativos rendimento. Nós temos utilizado com sucesso o Y2H para identificar as interações domínio de domínio dentro do RyR2, bem como novos parceiros de proteína 2-4,12,21,22. Por exemplo, nós analisamos uma série de construções de sobreposição abrangendo todo o comprimento da sequência do péptido RyR2 para a interacção com um fragmento N-terminal (AD4L: RyR2 resíduos 1-906 fundido com GAL4 AD). 3 ensaios filtros Colony-elevador de papel β-Gal produzida vivas colónias de levedura de cor azul única para o BT4L: par AD4L (Figura 2A), mostrando que AD4L interage com ele mesmo, ou seja, a BT4L construir (resíduos RyR2 1-906 fundidos com GAL4 DNA-BD). Pálidos colónias azuis foram detectados pela BT8: par AD4L sugerindo uma associação mais fraca secundário com o domínio C-terminal extremo (BT8), enquanto leveduras co-transformada com qualquer outra construção permaneceu branca e, portanto, negativo para isco: a interação proteína presa. Os resultados quantitativos obtidos através de ensaios de β-Gal líquidos (Figura 2B), indicado BT4L robusta: equivalente interacção AD4L em força para a conhecida associação entre a proteína p53 (pVA3) e o antigénio T grande de SV40 (pTD1), ao passo que o BT8: interacção AD4L foi consideravelmente mais fracos (&lt;10% em comparação com o controlo). Nós rotineiramente realizar experiências co-IP (Figura 3) fepois expressão transiente numa linha de células de mamíferos (células HEK293), como um ensaio bioquímico independente para reforçar as conclusões Y2H 2-4,12-14,21-24. Para verificar a RyR2 N-terminal de auto-interacção, dois plasmídeos separados que codificam para os resíduos de RyR2 1-906 marcadas com tanto o epitopo péptido cMyc ou HA (BT4L e AD4L, respectivamente), foram co-transfectados em células HEK293 utilizando o método de fosfato de cálcio precipitação 3. A fracção pós-nuclear de células homogeneizadas foi solubilizado com os detergentes CHAPS, e o material insolúvel foi removido por centrifugação para produzir o lisado celular. O ligado de células, tratadas com o agente redução de ditiotreitol foi então incubado com Ac de HA e esferas de Proteína-A Sepharose para imunoprecipitar AD4L marcada com HA. Amostras co-IP, eluídas com tampão contendo SDS, foram carregadas em dois geles de SDS-PAGE separadas (1/10 e 9/10 de divisão) e analisados ​​por imunotransf erência com Ab HA e Ab cMyc, respectively. Bem sucedido IP directa de AD4L (~ 100 kDa) por Ab HA foi verificada por imunotransferência, mas não no controlo negativo utilizando IgG de coelho não imune (Figura 4A). Importante, cMyc-tagged BT4L (~ 100 kDa) foi recuperado apenas no HA IP Ab, e não no controlo negativo na ausência de AD4L imunoprecipitado (Figura 4B). ensaios y2h e co-IP forneceram evidências consistentes para RyR2 N-terminal de auto-interação, mas eles não informam sobre o estado de oligomerização do domínio N-terminal, ou seja, se ele faz apenas dímeros ou complexos mais elevados. Deve notar-se que os complexos se dissociam e apenas as subunidades compreendendo será detectada por SDS-PAGE, devido a SDS e a desnaturação de proteínas induzida pelo calor, que suprime interacções proteína-proteína. Para ultrapassar esta situação, podemos utilizar a reticulação (Figura 5) que quimicamente e estavelmente conjuga protei pré-existenten oligómeros cuja massa molecular, pode então ser analisada por SDS-PAGE tamanho separação 2-5. Por exemplo, homogenato de células HEK293 que expressam cMyc-BT4L, tratado com o agente redução de ditiotreitol, foi feita reagir com glutaraldeido e analisaram-se por SDS-PAGE e imunotransferência utilizando Ab cMyc (Figura 6). Em adição ao monómero (~ 100 kDa), uma banda de proteína de elevada massa molecular de ~ 400 kDa foi detectada de uma forma dependente do tempo, indicando RyR2 N-terminal tetrâmero formação 3. Notavelmente, tetrâmero foi a espécie predominante oligoméricas, com dímero mínimo e bandas trimer observados. Para determinar sua massa molecular aparente, o oligômero BT4L foi separado por meio de 4-15% de gel de gradiente de SDS-PAGE 3. Produzimos a massa / gel de curva padrão retardo molecular utilizando padrões de proteínas com uma gama de 30-460 kDa, e calculou-se o oligómero de ser 358 kDa 15 (n = 4). Esta massa molecular aparente está de acordo com um tetrâmero BT4L dispostos numaforma circular fechada em vez de na forma linear, como esperado a partir da disposição das quatro subunidades dentro do canal RyR2 nativa. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/54271/54271fig1.jpg" /> Figura 1. Y2H Fluxograma. Yeast, co-transformada com isca e de destino plasmídeos, é selecionada para crescimento em meio sem histidina e / ou testado quanto à actividade enzimática β-Gal. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54271/54271fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54271/54271fig2.jpg" /> Figura 2. Y2H Sugere RyR2 N-terminal Domínio A auto-interacção. (A) Representação esquemática que descreve a série (isca) de fragmentos de proteínas humanas sobreposição RyR2 testados no sistema para Y2H<html> interacção com o constructo AD4L RyR2 N-terminal (presa). Os resultados qualitativos obtidos por meio de ensaios de papel β-Gal filtro colónia-lift estão indicados em &quot;+&quot; múltiplos ou &quot;-&quot; para a interação negativa ensaios (B) líquidos Quantitative β-Gal normalizados contra o controle positivo (pVA3 codifica para GAL4 DNA-BD. fusão com a proteína p53; pTD1 codifica para a fusão AD GAL4 com antigénio T grande SV40). Modificado de 3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54271/54271fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54271/54271fig3.jpg" /> Figura 3. Co-IP fluxograma. As células de mamíferos, co-transfectadas com plasmídeos que X e Y, são homogeneizados e para produzir o lisado celular utilizada no ensaio de co-IP, seguido de SDS-PAGE e imunotransferência solubilizada por detergente.f = &quot;https://www.jove.com/files/ftp_upload/54271/54271fig3large.jpg&quot; target = &quot;_ blank&quot;&gt; Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54271/54271fig4.jpg" /> Figura 4. Co-IP indica RyR2 N-terminal Domínio A auto-interacção em células de mamífero. As células HEK293 foram co-transfectados para a co-expressão transitória de cMyc-etiquetado (BT4L) e marcada com HA domínio (AD4L) RyR2 N-terminal ( os resíduos 1-906). AD4L foi imunoprecipitada com Ab HA de solubilizadas em CHAPS e tratado com ditiotreitol HEK293 lisado, enquanto que os ensaios de controle, co-IP como negativos foram realizados com IgG de coelho não imune. As proteínas imunoprecipitadas foram aquecidos a 85 ° C durante 5 minutos e resolvidas em 20 mA durante 3 horas através de géis de SDS-PAGE 6% separadas carregadas com 1/10 ou 9/10 de amostras IP. Na sequência da transferência de proteína a 80 V durante 2 h para polyvinymembrana de difluoreto de lidene, análise de imunotransf erência foi realizada utilizando (1: 1000 de diluição) Ab HA (A) ou Ab cMyc (B), respectivamente, seguido de peroxidase de rábano conjugado com anti-IgG de ratinho (diluição de 1: 10.000) e a detecção de quimioluminescência aumentada (1 min de exposição). Uma alíquota de lisado celular, 1/50 do volume processado em amostras IP, também foi incluído para servir como padrão de massa molecular. Modificado de 3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54271/54271fig4large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/54271/54271fig5.jpg" /> Figura 5. Fluxograma de reticulação. As células de mamíferos, transf ectadas com o plasmídeo X, são homogeneizados e submetido a reacção com o glutaraldeído no ensaio de reticulação, seguido por SDS-PAGE e immunoblotting. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54271/54271fig5large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/54271/54271fig6.jpg" /> Figura 6. A ligação cruzada Indica RyR2 N-terminal Domínio A formação Tetrâmero células HEK293 que foram transfectadas para a expressão transitória de cMyc-tagged domínio (BT4L) RyR2 N-terminal (resíduos 1 - 906).. homogenato celular, tratado com o agente redução de ditiotreitol, foi incubada com glutaraldeído para os pontos de tempo indicados. As amostras foram aquecidas a 85 ° C durante 5 minutos e resolvidas por SDS-PAGE (gel de 6%) a 20 mA durante 3 horas. Após a transferência de proteína, a 80 V durante 2 horas para uma membrana de difluoreto de polivinilideno, análise de imunotransf erência foi realizada utilizando (1: 1000 de diluição) Ab cMyc, seguido de peroxidase de rábano conjugado com anti-IgG de ratinho (1:10000 diluição) e a detecção de quimioluminescência aumentada (1 min de exposição). Monomérico (H: ~ 100 kDa) e formas tetramérica (T) são indicados pelas setas. Modificado de 3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54271/54271fig6large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

A oligomerização do receptor de rianodina, um canal iônico homotetramérico que medeia a liberação de Ca2+ dos estoques intracelulares, é crítica para a contração do músculo esquelético e cardíaco. Aqui, apresentamos métodos complementares in vivo e in vitro para detectar a autoassociação de proteínas e determinar a estequiometria de homo-oligômero.

Abordagens genéticas e bioquímicas para<em&gt; In Vivo</em&gt; e<em&gt; In Vitro</em&gt; Avaliação de oligomerização da proteína: A Case Study rianodina Receptor

Oligomerization is often a structural requirement for proteins to accomplish their specific cellular function. For instance, tetramerization of the ...

O objetivo geral dessas três técnicas experimentais complementares, a saber, teste de duplo-híbrido em levedura, co-imunoprecipitação e reticulação química, é avaliar interações entre proteínas, em particular a autoassociação, e determinar a composição estequiométrica de homooligômeros proteicos. Esses métodos podem ajudar a responder perguntas fundamentais na área de cardiopatias, como a oligomerização de receptores ultrarrápidos, subjacente a arritmias cardíacas e morte súbita. As principais vantagens dessas técnicas são o screening relativamente de alto rendimento, facilidade de uso e resultados altamente reprodutíveis, exigindo equipamentos e reagentes mínimos.As implicações dessas técnicas estendem-se à terapia de doenças cardíacas arritmogênicas, porque ajudam a estabelecer o mecanismo molecular de ação de fármacos antiarrítmicos. Geralmente, indivíduos novos em co-imunoprecipitação enfrentam dificuldades devido ao risco de descartar acidentalmente as microesferas de agarose com proteína, que são muito pequenas, durante a aspiração do sobrenadante nas etapas de centrifugação. Neste ensaio de duplo-híbrido em levedura, células de levedura na fase de crescimento exponencial são utilizadas para transformação.Recolha as células por centrifugação, re-suspenda cada pellet em cinco mililitros de água estéril e reúna as suspensões celulares. Centrifugue a suspensão celular. Após descartar o sobrenadante, re-suspenda o pellet de levedura em um mililitro de acetato de lítio a um-x e TE, estéreis e recém-preparados. As células de levedura competentes devem ser usadas dentro de uma hora após a preparação.Prepare amostras de plasmídeo misturando o DNA plasmidial isca e alvo com 100 microgramas de DNA de esperma de arenque. Em cada tubo de 1,5 mililitro, adicione 100 microlitros da suspensão de levedura competente e 600 microlitros da solução de acetato de lítio a um-X e PEG, e vortex por cerca de 30 segundos. Incube a 30 graus Celsius por 30 minutos, com agitação.Adicione 80 microlitros de dimetilsulfóxido e misture bem por inversão suave. Submeta ao choque térmico por 15 minutos em banho-maria a 42 graus Celsius, agitando a cada dois a três minutos. Resfrie a suspensão celular em gelo por dois minutos e, em seguida, centrifugue para recuperar a levedura.Resuspenda cada pellet celular em 100 microlitros de tampão TE 1X. Plaque as células em placas apropriadas de meio mínimo SD para manter a pressão seletiva sobre os plasmídeos isca e alvo. Incube as placas invertidas a 30 graus Celsius por quatro a cinco dias. As colônias de levedura estão prontas para este ensaio quando atingirem cerca de dois milímetros de diâmetro.Pipete 2,5 mililitros de solução de tampão Z e X-gal recém-preparada em uma placa limpa de 100 milímetros e coloque um papel de filtro de celulose na placa. Coloque um novo papel de filtro sobre a superfície da placa com as colônias de levedura a serem analisadas. Utilize pinças para pressionar suavemente o papel de filtro contra a placa e deixe por aproximadamente cinco minutos para que as colônias adiram.Enquanto utiliza equipamento de proteção individual apropriado, levante cuidadosamente o papel filtro e mergulhe-o em uma cuba de nitrogênio líquido por 30 segundos. Deixe o papel filtro congelado descongelar à temperatura ambiente por dois minutos. Coloque o papel filtro com o lado das colônias voltado para cima sobre o papel filtro previamente embebido dentro da placa de 100 milímetros e incube a 30 graus Celsius até que colônias azuis apareçam.No dia anterior à transfeção, alimente as células HEK293 em uma placa de Petri de 100 milímetros, para que as células apresentem uma confluência de 60 a 70 por cento no dia seguinte. Incube por 16 a 18 horas em estufa úmida. No dia da transfeção, dilua 24 microgramas de DNA plasmidial com 60 microlitros de cloreto de cálcio 2,5 molar e água estéril desionizada para obter um volume total de 600 microlitros.Agite em vórtex para misturar. Adicione gota a gota a solução de DNA plasmidial com cálcio em um tubo de 50 mililitros contendo 600 microlitros de solução salina tamponada com HEPES 2X, sob agitação constante e vigorosa em vórtex. Incube por 20 minutos à temperatura ambiente para permitir a formação de complexos de DNA plasmidial com fosfato de cálcio.Após a incubação de 20 minutos, agite brevemente em vórtex e adicione a solução gota a gota sobre as células HEK293, cobrindo toda a área da superfície da placa de Petri. Incube as células a 37 graus Celsius em 5 por cento de dióxido de carbono. Após aproximadamente seis horas, troque o meio de crescimento e retorne as células ao incubador.24 horas após a transfeção, colete as células conforme descrito no texto do protocolo. Re-suspenda o pellet celular em 500 microlitros de tampão de homogenização gelado e transfira a suspensão celular para um tubo de 1,5 mililitro contendo esferas de vidro. Utilize uma agulha fina acoplada a uma seringa de um mililitro para homogenizar as células em gelo.Com a tampa do tubo fechada, perfure a tampa com a agulha e dispersar vigorosamente a suspensão celular através das esferas de vidro. Centrifugar a 1500 vezes G durante 10 minutos a quatro graus Celsius para remover núcleos e células não rompidas. Guardar o sobrenadante, que representa a fração pós-nuclear, para uso em experimentos de co-imunoprecipitação ou reticulação.Para iniciar este procedimento, solubilize a fração subcelular pós-nuclear com 0,5 por cento de chaps e incube por pelo menos duas horas a quatro graus Celsius com mistura constante. Centrifugue a 20.000 vezes G durante 10 minutos a quatro graus Celsius para obter o pellet do material insolúvel. Guarde o sobrenadante.Isso é denominado lisado celular. Prepare as esferas de agarose com proteína A no tampão de imunoprecipitação conforme descrito no texto do protocolo. Adicione um micrograma do anticorpo de imunoprecipitação a um tubo contendo proteína A.Como controle negativo, adicione um micrograma de IGG não imune ao outro tubo contendo proteína A. Incube por pelo menos duas horas a quatro graus Celsius, com mistura constante. Recupere as esferas por centrifugação e descarte cuidadosamente o sobrenadante por pipetagem.Transfira 200 microlitros do lisado celular para cada um dos dois tubos contendo anticorpo e microesferas de proteína A. Incube por pelo menos duas horas a quatro graus Celsius com mistura constante para permitir a ligação antígeno-anticorpo. Recupere as microesferas e lave com 200 microlitros de tampão de imunoprecipitação.Incube por 10 minutos a quatro graus Celsius com mistura suave. Após três lavagens, descarte cuidadosamente o sobrenadante por pipetagem. Adicione 30 microlitros de tampão de carga proteica às esferas e centrifugue a 1500 ×g por dois minutos a quatro graus Celsius.Guarde o sobrenadante contendo a amostra de co-IP para análise subsequente por eletroforese SDS-PAGE e imunoblotagem. Para realizar a reticulação química, centrifugue a fração subcelular pós-nuclear para obter o precipitado de agregados proteicos. Guarde o sobrenadante e divida-o em oito alíquotas de 20 microlitros cada.Adicione glutaraldeído a 0,0025 por cento volume por volume a apenas uma amostra. Inicie o cronômetro e deixe o glutaraldeído reagir à temperatura ambiente pelo tempo indicado. Interrompa a reação com glutaraldeído no tempo especificado com hidrazina a 2 por cento volume por volume e adicione cinco microlitros de tampão de carga proteica 5X para desnaturar as proteínas.O sistema de duplo híbrido em levedura foi utilizado para analisar construções sobrepostas que abrangem toda a extensão da sequência peptídica do receptor de rianodina, visando detectar interações com AD4L e o fragmento terminal. Ensaios de beta-galactosidase em papel-filtro por levantamento de colônias produziram colônias intensamente azuis somente para o par BT4L/AD4L, demonstrando que AD4L interage consigo mesmo. Colônias de coloração azul pálida foram observadas para o par BT8/AD4L, sugerindo uma associação secundária e mais fraca com o domínio C-terminal extremo.Resultados quantitativos de ensaios líquidos de beta-gal indicaram uma interação BT4L/AD4L robusta, equivalente em força à associação conhecida entre a proteína P53, pVA3 e o antígeno grande T do SV40, pTD1. A interação BT8/AD4L foi consideravelmente mais fraca. Os achados do teste de duplo híbrido em levedura são reforçados por experimentos de co-imunoprecipitação após a expressão transitória de AD4L com marcação HA e BT4L com marcação cMyc em uma linhagem celular de mamífero.Observou-se a imunoprecipitação direta de AD4L marcado com HA por um anticorpo anti-HA, e BT4L marcado com cMyc foi recuperado apenas na imunoprecipitação anti-HA. A reticulação química foi realizada em homogenato celular expressando BT4L com marcação cMyc, seguida de eletroforese em gel de SDS e imunoblotagem, utilizando um anticorpo contra cMyc. Além do monômero de 100 kilodaltons, uma banda proteica de alta massa molecular de aproximadamente 400 kilodaltons foi detectada de maneira dependente do tempo, indicando a formação de tetrâmeros do receptor de rianodina e da terminação. Ao tentar a transfeção de células de mamífero por precipitação de fosfato de cálcio, é importante lembrar-se de agitar constantemente e vigorosamente o tampão fosfato em um tubo grande para uma aeração eficiente, enquanto se adiciona muito lentamente a solução de DNA plasmidial. Após seguir esses procedimentos, outros métodos, como microscopia confocal em imagem de cálcio, podem ser realizados. Essas técnicas devem ajudar a responder perguntas adicionais, como a localização e as propriedades de liberação de cálcio dos canais de receptores de rianodina em células vivas.Após seu desenvolvimento, essas técnicas abriram caminho para pesquisadores em diversas áreas de sinalização celular avaliarem a homo-oligomerização proteica, um processo biológico fundamental que regula a atividade de fatores de transcrição, enzimas, canais iônicos e receptores.

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Biologia

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