Preparação de gigantes Vesículas Encapsulamento microesferas por centrifugação de uma emulsão de água-em-óleo

Vesículas gigantes contendo componentes micrométricos altamente compactados são modelos de células úteis. O método de centrifugação em emulsão água-em-óleo é uma ferramenta simples e poderosa para a preparação de vesículas gigantes com materiais encapsulados.

O objetivo geral deste método de centrifugação de emulsão de água em óleo é preparar facilmente uma vesícula gigante de camada fina. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da biologia sintética, como a criação de uma célula artificial baseada em uma vesícula gigante. Para iniciar este procedimento, prepare uma solução estoque 25 milimolar de DOPC e uma solução estoque zero vírgula dois milimolares de Texas Red DHPE em clorofórmio.

Em seguida, forme um filme lipídico na superfície interna de um frasco de vidro de cinco mililitros, evaporando uma mistura das soluções estoque DOPC e Texas Red DHPE sob gás nitrogênio fluindo. Depois de incubar o filme sob pressão reduzida durante a noite, adicione um mililitro de parafina líquida ao frasco. Embrulhe o frasco em papel alumínio e incube a mistura a 80 graus Celsius durante a noite.

Em um microtubo com tampa de um vírgula cinco mililitros, misture 237 vírgula cinco microlitros de microesferas não fluorescentes de um micrômetro e 12 vírgula cinco microlitros de microesferas fluorescentes de um micrômetro. Agora adicione 64 miligramas de sacarose seguidos por 125 microlitros de uma solução tamponada Tris molar e 875 microlitros de água deionizada ao microtubo. Vortex a mistura por 30 segundos e depois sonicar por 10 minutos.

Após a preparação de 10 mililitros de uma solução tamponada Tris, coloque um mililitro em um microtubo com tampa de um ponto e cinco mililitros. Uma vez que a solução tenha sido vórtice e sonicada, misture um mililitro da solução de óleo com 300 microlitros da solução aquosa interna em um microtubo de um vírgula cinco mililitros. Emulsione os dois componentes do microtubo usando um homoginizador mecânico operado a 10.000 rpm por dois minutos à temperatura ambiente.

Em seguida, coloque suavemente 300 microlitros da emulsão de água em óleo na superfície superior de um mililitro da solução aquosa externa a quatro graus Celsius em um microtubo com tampa de um vírgula cinco mililitros. Imediatamente após o resfriamento do microtubo por 10 minutos, centrifugue a mistura a 18.000 vezes G por 30 minutos. Quando terminar, obtenha as vesículas gigantes precipitadas ou GVs perfurando a parte inferior do microtubo com um alfinete e coletando uma gota em um microtubo esterilizado de um vírgula cinco mililitros.

Coloque uma câmara de incubação adesiva para reação em cadeia da polimerase NC duas e hibridização em cima de uma lamínula de microscópio. Usando uma micropipeta, deposite 25 microlitros dos GVs preesperados diluídos na área da amostra e coloque imediatamente uma lamínula de cinco milímetros de espessura no topo da câmara de incubação. Após registrar as imagens de microscopia das vesículas, realize a microscopia de fluorescência inserindo primeiro as unidades de espelho de fluorescência UFBNA e UFMCHE no microscópio.

Em seguida, instale as unidades com filtros de excitação e filtros de emissão para a análise. O determinante mais importante do sucesso do método da água em óleo é que a gravidade específica da solução aquosa interna deve ser maior do que a da solução aquosa externa, de modo que os GVs precipitem durante a centrifugação. A microscopia de interferência diferencial e a microscopia de fluorescência dos GVs sem microesferas e com microesferas confirmaram a formação de GVs com baixa lamelaridade.

Dos 160 GVs obtidos, 55 microesferas encapsuladas e 105 estavam vazias, dando uma proporção de 34% de encapsulamento. A fração de volume das microesferas nos GVs foi estimada em cerca de 11 mais ou menos três por cento de volume e a precisão da fração de volume calculada foi de 10 a 30% Encapsulamento de outros materiais em 100 por cento de mol DOPC GVs usando a mesma solução aquosa externa e o mesmo protocolo foi bem-sucedido, conforme mostrado por microscopia de interferência diferencial e microscopia de fluorescência. Após este procedimento, outros métodos, como citometria de fluxo, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como a elucidação da célula modelada.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como preparar vesículas gigantes com materiais encapsulados.