Preparação de gigantes Vesículas Encapsulamento microesferas por centrifugação de uma emulsão de água-em-óleo
24 de janeiro de 2017
Vesículas gigantes contendo componentes micrométricos altamente compactados são modelos de células úteis. O método de centrifugação em emulsão água-em-óleo é uma ferramenta simples e poderosa para a preparação de vesículas gigantes com materiais encapsulados.
O objetivo geral deste método de centrifugação de emulsão de água em óleo é preparar facilmente uma vesícula gigante de camada fina. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da biologia sintética, como a criação de uma célula artificial baseada em uma vesícula gigante. Para iniciar este procedimento, prepare uma solução estoque 25 milimolar de DOPC e uma solução estoque zero vírgula dois milimolares de Texas Red DHPE em clorofórmio.
Em seguida, forme um filme lipídico na superfície interna de um frasco de vidro de cinco mililitros, evaporando uma mistura das soluções estoque DOPC e Texas Red DHPE sob gás nitrogênio fluindo. Depois de incubar o filme sob pressão reduzida durante a noite, adicione um mililitro de parafina líquida ao frasco. Embrulhe o frasco em papel alumínio e incube a mistura a 80 graus Celsius durante a noite.
Em um microtubo com tampa de um vírgula cinco mililitros, misture 237 vírgula cinco microlitros de microesferas não fluorescentes de um micrômetro e 12 vírgula cinco microlitros de microesferas fluorescentes de um micrômetro. Agora adicione 64 miligramas de sacarose seguidos por 125 microlitros de uma solução tamponada Tris molar e 875 microlitros de água deionizada ao microtubo. Vortex a mistura por 30 segundos e depois sonicar por 10 minutos.
Após a preparação de 10 mililitros de uma solução tamponada Tris, coloque um mililitro em um microtubo com tampa de um ponto e cinco mililitros. Uma vez que a solução tenha sido vórtice e sonicada, misture um mililitro da solução de óleo com 300 microlitros da solução aquosa interna em um microtubo de um vírgula cinco mililitros. Emulsione os dois componentes do microtubo usando um homoginizador mecânico operado a 10.000 rpm por dois minutos à temperatura ambiente.
Em seguida, coloque suavemente 300 microlitros da emulsão de água em óleo na superfície superior de um mililitro da solução aquosa externa a quatro graus Celsius em um microtubo com tampa de um vírgula cinco mililitros. Imediatamente após o resfriamento do microtubo por 10 minutos, centrifugue a mistura a 18.000 vezes G por 30 minutos. Quando terminar, obtenha as vesículas gigantes precipitadas ou GVs perfurando a parte inferior do microtubo com um alfinete e coletando uma gota em um microtubo esterilizado de um vírgula cinco mililitros.
Coloque uma câmara de incubação adesiva para reação em cadeia da polimerase NC duas e hibridização em cima de uma lamínula de microscópio. Usando uma micropipeta, deposite 25 microlitros dos GVs preesperados diluídos na área da amostra e coloque imediatamente uma lamínula de cinco milímetros de espessura no topo da câmara de incubação. Após registrar as imagens de microscopia das vesículas, realize a microscopia de fluorescência inserindo primeiro as unidades de espelho de fluorescência UFBNA e UFMCHE no microscópio.
Em seguida, instale as unidades com filtros de excitação e filtros de emissão para a análise. O determinante mais importante do sucesso do método da água em óleo é que a gravidade específica da solução aquosa interna deve ser maior do que a da solução aquosa externa, de modo que os GVs precipitem durante a centrifugação. A microscopia de interferência diferencial e a microscopia de fluorescência dos GVs sem microesferas e com microesferas confirmaram a formação de GVs com baixa lamelaridade.
Dos 160 GVs obtidos, 55 microesferas encapsuladas e 105 estavam vazias, dando uma proporção de 34% de encapsulamento. A fração de volume das microesferas nos GVs foi estimada em cerca de 11 mais ou menos três por cento de volume e a precisão da fração de volume calculada foi de 10 a 30% Encapsulamento de outros materiais em 100 por cento de mol DOPC GVs usando a mesma solução aquosa externa e o mesmo protocolo foi bem-sucedido, conforme mostrado por microscopia de interferência diferencial e microscopia de fluorescência. Após este procedimento, outros métodos, como citometria de fluxo, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como a elucidação da célula modelada.
Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como preparar vesículas gigantes com materiais encapsulados.
Visão Geral
Este artigo discute a preparação de vesículas gigantes utilizando um método de centrifugação de emulsão água-em-óleo. Essas vesículas servem como modelos úteis para a pesquisa em biologia sintética, particularmente na criação de células artificiais.
Principais Componentes do Estudo
Área da Ciência
- Biologia Sintética
- Preparação de Vesículas
- Modelos Celulares
Antecedentes
- Vesículas gigantes podem encapsular materiais, tornando-as valiosas para a pesquisa.
- O método de emulsão água-em-óleo simplifica o processo de preparação.
- Compreender a formação de vesículas é fundamental para o avanço da biologia sintética.
- A eficiência de encapsulação é uma métrica fundamental para avaliar o método.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um método simples para a preparação de vesículas gigantes.
- Explorar o potencial dessas vesículas em aplicações de biologia sintética.
- Avaliar o encapsulamento de diversos materiais dentro das vesículas.
Métodos Utilizados
- Preparação de filmes lipídicos a partir de DOPC e Texas Red DHPE.
- Formação de emulsões água-em-óleo utilizando homogeneização mecânica.
- Centrifugação para isolamento de vesículas gigantes.
- Técnicas de microscopia para análise das propriedades das vesículas.
Resultados Principais
- Formação bem-sucedida de vesículas gigantes com diferentes taxas de encapsulação.
- 34% das vesículas encapsularam microesferas.
- A fração volumétrica de microesferas foi estimada em aproximadamente 11%.
- Outros materiais foram encapsulados com sucesso utilizando o mesmo protocolo.
Conclusões
- O método de água em óleo é eficaz para a preparação de vesículas gigantes.
- A eficiência de encapsulação pode ser otimizada para diversas aplicações.
- Essa técnica abre caminhos para pesquisas futuras em biologia sintética.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
O encapsulamento eficiente de microesferas dentro de vesículas gigantes (GVs) permite a construção de modelos de células artificiais, apoiando descobertas em biologia sintética e biotecnologia em estágios iniciais. Este método fornece uma plataforma reprodutível para investigar compartimentalização, aglomeração molecular e eficiência de encapsulamento, fatores críticos para a confiança preditiva em sistemas miméticos de células. A abordagem é diretamente relevante para pipelines de validação de alvos e desenvolvimento de ensaios, nos quais modelos de células artificiais auxiliam na redução de riscos mecanicistas e na continuidade translacional.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Facilita a montagem ascendente de modelos celulares artificiais para testes de hipóteses.
- Permite o encapsulamento de diversas biomoléculas ou partículas para imitar ambientes celulares.
- Apóia a redução de riscos mecanicistas ao modelar o efeito de empacotamento molecular e a compartimentalização.
- Oferece uma plataforma para validação funcional de alvos em sistemas sintéticos.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Prepara sistemas padronizados baseados em vesículas para fluxos de trabalho de triagem subsequentes.
- Fornece métricas quantitativas de encapsulação para informar a reprodutibilidade do ensaio.
- Permite a produção escalável de vesículas para aplicações de triagem de alto conteúdo.
- Apóia a avaliação confiável de interações de compostos ou biomoléculas dentro de compartimentos definidos.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Modela características celulares relevantes para doenças, como concentração molecular e compartimentalização.
- Alinha sistemas celulares artificiais a estudos translacionais de biomarcadores ao encapsular moléculas relevantes.
- Proporciona continuidade da validação de modelos sintéticos ao desenvolvimento de ensaios pré-clínicos.
- Reduz riscos em descobertas iniciais ao permitir manipulação controlada e quantitativa do sistema.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este método de centrifugação de emulsão água-em-óleo integra-se na interface entre a descoberta inicial e o desenvolvimento de ensaios, permitindo a geração de modelos celulares artificiais para pesquisas orientadas por hipóteses e triagem.
- Biologia da Descoberta: Apoia testes de hipóteses sobre compartimentalização e eficiência de encapsulação em sistemas sintéticos.
- Triagem: Fornece preparações reprodutíveis e quantitativas de vesículas para padronização de ensaios.
- Análises: Permite a medição de razões de encapsulação e frações de volume para análise comparativa.
- Pesquisa Translacional: Conecta descobertas em modelos sintéticos ao desenho de ensaios pré-clínicos ao encapsular moléculas relevantes para doenças.
- Reutilização Empresarial: Oferece um protocolo reutilizável, adaptável a diversos encapsulantes e composições de vesículas.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva em ensaios baseados em células artificiais e na validação de alvos.
- Valor Operacional: Oferece preparação padronizada e escalonável de vesículas com resultados quantificáveis.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de prosseguir ou não prosseguir ao reduzir a ambiguidade mecanicista na fase inicial de descoberta.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de projetos de biologia sintética e de células miméticas.
Considerações sobre a Implementação
- Exige conhecimento especializado em química de lipídios, manipulação de emulsões e análise por microscopia.
- Requer acesso a homogeneizadores, centrífugas e infraestrutura de microscopia de fluorescência.
- Exige padronização entre equipes dos protocolos de encapsulação e análise.
- Adaptável a diferentes encapsulantes e tamanhos de vesículas mediante otimização do protocolo.
- A eficiência de encapsulação e a lamelaridade das vesículas podem variar e exigem validação empírica.
