Name: Preparação de gigantes Vesículas Encapsulamento microesferas por centrifugação de uma emulsão de água-em-óleo (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 43 s
Description: Aprenda a preparar vesículas gigantes encapsulando microesferas por centrifugação de emulsão água-em-óleo. Este método simplificado utiliza DOPC e Texas Red DHPE para criar modelos celulares artificiais em biologia sintética.

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Agradecemos Tomoko Yamaguchi para desenhar a imagem esquemática na Figura 1. Este estudo foi apoiado pelo Projeto Okazaki ORION do Instituto Okazaki for Integrative Bioscience da National Institutes of Natural Sciences (NINS); pelo Centro de Projetos de Astrobiologia (sem AB281010.) de NINS; por um Grant-in-Aid para a Investigação Científica em áreas inovadoras (ordenação dinâmica de sistemas biomoleculares para a criação de funções integradas) da Sociedade Japonesa para a Promoção da Ciência (JSPS) (sem 25.102.008.); por um Grant-in-Aid para Jovens Cientistas (B) (para KK, não 15K17850.) a partir JSPS; andby um Grant-in-Aid para a Investigação Atividade Start-Up (para YN, não. 15H06653) a partir de JSPs. Apoio adicional foi fornecido por um subsídio do Instituto Noguchi, uma bolsa da Fundação Kao de Artes e Ciências, e uma bolsa da Água Kurita e Fundação do Meio Ambiente.

1. Preparação da GVS pela W / O método de centrifugação da emulsão <ol><li> Prepara-se uma solução de estoque de 1,2-dioleoyl- sn-glicero-3-fosfocolina (DOPC, 25 mM) e uma solução de estoque de 1,2-Texas Red dihexadecanoyl--sn-glicero-3-fosfoetanolamina, sal de trietilamónio (vermelho do Texas DHPE, 0,20 mM) em clorofórmio e armazenar as soluções de reserva a -20 ° C. </li><li> Prepara-se uma solução de óleo. <ol><li> Formar uma película lipidica na superfície interior de um frasco de vidro de 5 ml por evaporação de uma mistura da solução de estoque de DOPC (51,0 ul e a solução estoque Texas Red DHPE (19,2 mL) sob uma corrente de azoto gasoso. </li><li> Incubar a película sob pressão reduzida durante a noite e, em seguida, adicionar 1,0 ml de parafina líquida (0,86-0,89 g / cm 3) ao frasco. Enrole o frasco em folha de alumínio e incubar-lo a 80 ° CO / N em repouso. As concentrações finais de DOPC e vermelho do Texas DHPE são 1,3 e 3,8 x 10-3 mM, Respectivamente, e a de DOPC: proporção molar de vermelho do Texas DHPE é de 100: 0,3. </li></ol></li><li> Preparar a dispersão aquosa interna. <ol><li> Em um microtubo de 1,5 mL com tampa, misturar 237,5 ul de uma dispersão de 1,0 um microesferas não fluorescentes (2,5% vol) e 12,5 uL de uma dispersão de 1,0 um microesferas fluorescentes (2,5% vol); isto corresponde a um 95: proporção de 5 (v / v) de não fluorescente a microesferas fluorescentes. </li><li> Adicionar 64 mg de sacarose, seguida por 125 ul de solução tamponada com Tris (TBS, 1 M) e 875 ul de água desionizada. A fracção de volume final de microesferas é de 0,5% em volume, e as concentrações finais de Tris-HCl (pH 7,5) e sacarose são de 0,1 e 0,15 M, respectivamente. </li><li> Vortex microtubo durante 30 segundos e, em seguida, sonicar-lo durante 10 min. </li></ol></li><li> Preparar a solução aquosa exterior. <ol><li> Após a preparação de 10 ml de uma solução tamponada com Tris (Tris-HCl 0,1 M [pH 7,5], glic 0,15 MOSE) no mesmo procedimento como meios aquosos interior, colocar 1 ml da solução num microtubo de 1,5 mL com tampa. Vortex microtubo durante 30 segundos e, em seguida, sonicar-lo durante 10 min. </li></ol></li><li> Prepare a emulsão a / o contendo microesferas. <ol><li> Misturar 1 ml da solução de óleo (parafina líquida contendo DOPC e vermelho do Texas DHPE) com 300 ul da solução aquosa interior num microtubo de 1,5 mL. </li><li> Emulsionar os dois componentes no microtubo usando um homogeneizador mecânico (um agitador com pás que rodam a alta velocidade) operado a 10.000 rpm durante 2 min à temperatura ambiente. </li></ol></li><li> Precipitar o GVs. <ol><li> Suavemente camada 300 ul de emulsão W / O na superfície superior de um ml da solução aquosa externa a 4 ° C num microtubo de 1,5 mL com tampa. Arrefeça a microtubo durante 10 min a 4 ° C. </li></ol></li><li> Recolher os GVs. <ol><li> Imediatamente após a refrigeração do microtubo,centrifugar a 18000 que x g durante 30 min. Obter os GVs precipitados por perfuração da parte inferior do microtubo com um alfinete e recolhendo uma gotícula num microtubo esterilizado de 1,5 mL. </li><li> Diluir o GV precipitado gota 10-100 vezes em volume com a solução aquosa exterior se os GVs obtidos são obtidos em quantidades grandes o suficiente para fazer a observação difícil. </li></ol></li></ol> 2. Microscopia Observação da GVS <ol><li> Prepare a amostra de microscopia. <ol><li> Coloque uma câmara de incubação adesivo para reacção in situ em cadeia de polimerase e hibridização (dimensão da câmara de 9 mm x 9 mm x 0,3 mm de espessura) no topo de uma tampa de vidro de microscópio. </li><li> Usando uma micropipeta, depósito de 25 ul da diluído precipitou GVs na área do espécime e colocar imediatamente uma outra tampa de vidro (aproximadamente 0,15 mm de espessura) na parte superior da câmara de incubação. </li></ol></li><li> Grave contras de interferência diferencialAs imagens de microscopia t dos GVs. <ol><li> As imagens de microscopia registro das vesículas com um microscópio (10X, 20X e 40X objectivos) equipado com uma lâmpada de halogéneo 12V100WHAL-L. </li></ol></li><li> Efectuar observações de microscopia de fluorescência. <ol><li> Insira U-FBNA e U-FMCHE unidades de espelho para fluorescência no microscópio. Montar as unidades com filtros de 470-495 nm e 565-585 nm de excitação, respectivamente, e com filtros de emissão que transmitem 510-550 nm e 600-690 nm de luz, respectivamente. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

<html> Os pesos específicos do meio de dispersão aquosa interna e da solução aquosa exterior deve ser escolhida com cuidado. Para a W / O emulsão para precipitar na solução aquosa externa, durante a centrifugação, a gravidade específica do meio de dispersão aquosa interior deve ser maior do que a da solução aquosa exterior. Tentámos para preparar soluções utilizando GVs interior e exterior, sem açúcares, mas não obtivemos GVs sob estas condições, porque a solução aquosa interna não tem massa suficiente para atravessar a interferência entre as duas fases. Se houver uma diferença grande pressão osmótica entre as duas soluções, a GVS que precipitam na solução aquosa externa pode encolher ou de ruptura. Por conseguinte, a pressão osmótica no interior e no exterior dos GVs deve ser igual. Para conseguir isso, utilizou-se sacarose como um soluto no interior dispersão aquosa e glucose como soluto na solução aquosa externa; ambos os açúcares foram na mesma concentração. ambos salSS = &quot;refex&quot;&gt; 22 e açúcar 23, 35, 38 foram utilizados para esses fins, mas o açúcar é geralmente empregue porque é menos tóxico e mais solúvel do que o sal. No entanto, se demasiado açúcar é adicionado, os GVs podem entrar em contacto com a parte inferior do vidro de cobertura e colapso. Existem várias estratégias para evitar isso. Uma estratégia é a de reduzir a diferença de gravidade especifica entre as soluções aquosas interiores e exteriores de modo que os GVs precipitam sob condições moderadas; especificamente, o sobrenadante da dispersão GV precipitado pode ser permutado com uma solução que é idêntica à solução aquosa interna para reduzir a possibilidade de ruptura vesicular por adesão ao vidro de cobertura como resultado da flutuação. Outra estratégia consiste em pré-revestimento, tanto vidros de cobertura com uma película fina de lípidos 29. A preparação apropriada e incubação da emulsão estáimportante. Nós usamos parafina líquida para preparar a solução de óleo. Óleo mineral 26, 31, dodecano 21, 33, e esqualano 33, 39 são também frequentemente utilizados como óleos solventes. Uma vez que estes materiais variam em gravidade específica, a viscosidade e tensão de superfície, diferentes números de vesículas formar-se mesmo quando as mesmas condições de centrifugação são utilizados 33. Para obter as vesículas com as propriedades alvo, que é essencial para optimizar as gravidades e viscosidades das soluções aquosas internas e externas específicos, bem como a preparação acceleration.For centrífuga da fase de óleo, a incubação deve ocorrer a uma temperatura elevada e numa seco ambiente, tal como uma incubadora ou um desidratador. Neste estudo, foram aquecidos a parafina líquida a 80 ° C para dissolver completamente o lípido molecules.In disso, a emulsão deveser preparados única conforme necessário e deve ser imediatamente submetida a centrifugação porque é instável apenas depois de ter sido preparado e a W / O gotículas facilmente fundir um ao outro. A emulsão pode ser preparada em grandes quantidades por sonicação, agitação em vórtice, ou de toques. No entanto, usando um homogeneizador permite a preparação rápida de grandes quantidades de emulsão e mais fácil de emulsificação em óleo com uma alta viscosidade. É também importante que a emulsão ser mergulhado na solução aquosa externa suavemente e rapidamente e em seguida arrefecida a 4 ° C. Para encurtar o tempo entre emulsificação e centrifugação, o sistema de solução aquosa de óleo exterior pode ser pré-arrefecido antes da emulsão é em camadas sobre ele, e todo o sistema pode então ser centrifugado immediately.If a turvação branco aparece mais rápido ou mais lento do que o normal, a mecânica homogeneizador devem ser cuidadosamente lavados para remover detergentes de limpeza. Além disso, antes da emulsif icação, a solução de óleo, solução aquosa interna, e emulsionante deve ser returned até à temperatura ambiente. aceleração centrífuga adequada também é importante. Por centrifugação a 18000 x g, fomos capazes de preparar GVs com um único material interior encapsulado numa concentração elevada. Quando é necessária a encapsulação de vários materiais, é melhor para reduzir a aceleração centrífuga. Por exemplo, um sistema de montagem de actina encapsular sete compostos foi conseguida com centrifugação a menos do que 350 x g 35. Nos casos em que é indesejável centrifugação, GVs pode ser obtido ajustando a concentração de açúcar ou por precipitação a emulsão sob a influência da sua própria massa 38, 40, 41. O método aqui relatado tem duas limitações principais. Um é que as moléculas de petróleo (parafina, neste caso) podem ser solubilizados na membrana GV, como já foi apontado por o Weitgrupo z 21. Quando a inserção de uma proteína de membrana na membrana GV é desejada, devem ser considerados os efeitos de moléculas de óleo co-existente na proteína. A outra limitação é a variação de percentagem, em volume. Neste estudo, estimou-se que as fracções em volume de microesferas nos GVs variaram 4-30% em volume; as fracções de volume não eram idênticas à fracção de volume da solução aquosa interna, usado para a preparação GV. Embora nós fomos capazes de encapsular microesferas nos GVs a uma fracção de volume suficientemente elevado para observação microscopia, este método não é adequado para a preparação de GVs com uma fracção do volume de distribuição uniforme. Tem sido relatado que a distribuição das fracções de volume de microsferas muda durante a centrifugação 34. O método de emulsão centrifugação W / O é comumente utilizado para a formação da GVS contendo materiais encapsulados. No entanto, poucos relatos têm descrito o preparação da GVS encapsulando materiais microescala 34, 42. Recentemente, robôs moleculares que contenham um dispositivo de ADN encapsulado ou um dispositivo molecular foram construídos 43, 44. GVs com compartimentos são a primeira escolha para esses tipos de aplicações; portanto, técnicas, tal como o nosso, que poderiam ser utilizados para a encapsulação de microesferas magnéticas e com microesferas de funcionalização da superfície pode ser diversificada esperado que seja útil 44.

<html> A abordagem construtiva, ou sintética, a biologia é uma avenida fascinante para explorar a fronteira entre vida e matéria inanimada. Porque a célula é a unidade mínima necessária para a vida como nós atualmente compreendê-lo, vários investigadores têm tentado construir células artificiais de produtos químicos simples e bem compreendidas para que fenômenos que ocorrem dentro dessas células artificiais podem ser estudadas, com o objetivo final de elucidar as origens da vida e estudar as funções fundamentais das células vivas 1, 2, 3. Em particular, as vesículas 4, que são microcompartments esféricas feitas de moléculas anfifílicas e podem encapsular moléculas biológicas tais como proteínas 5, 6 e DNA 7, 8, 9,lass = &quot;refex&quot;&gt; 10, têm sido muitas vezes utilizados como modelos de membranas biológicas. As vesículas podem ser classificados como pequenas (definido como tendo um diâmetro de &lt;100 nm), de grandes dimensões (diâmetro &lt;1 | iM), ou gigante (diâmetro&gt; 1 uM). vesículas gigantes (GVS) têm sido estudados extensivamente, porque eles são semelhantes a células vivas em tamanho, forma e estrutura. Devido ao tamanho da GVS, as alterações morfológicas nas membranas GV pode facilmente ser observada em tempo real, sob um microscópio óptico. Vários métodos para a preparação de GVs foram relatados 11, incluindo o método de hidratação 12, 13, o método de congelação-descongelação 14, o método da eletroformação 15, 16, e o método de dispositivo de fluidos 17, 18. Entretanto, encapsulantes proteínas e outras MACROMolecules na GVS em concentrações elevadas por meio destes métodos é difícil. Em particular, é extremamente difícil para encapsular materiais biológicos em quantidade suficiente (20-30% em volume) para imitar o ambiente cheia no interior das células 19, 20. Para formar GVs instantaneamente, Weitz e colegas de trabalho estabeleceu uma água-em-óleo método de emulsão centrifugação 21, 22 (/ o w). Este método tem cinco características importantes. Em primeiro lugar, porque GVs preparados por este método tem baixo lamelaridade 23, 24, as suas membranas são muito finas que podem ser facilmente deformado. GV deformação da membrana induzida por FtsZ (uma proteína divisão celular bacteriana), a tubulina, e outras macromoléculas foi estudado 25, 26, 27, 28, e observou-se polyhe<html> Dron-como a deformação das membranas GV induzida por encapsulamento de microesferas de 29, 30. Em segundo lugar, as proteínas de membrana pode ser inserida na membrana vesicular por este método, embora com dificuldade 31. Por exemplo, o grupo Yomo usado este método para estudar a síntese in vitro e a actividade formadora de poros de membrana da proteína α-hemolisina 32. Em terceiro lugar, é possível gerar GVs assimétricos em que os componentes lipídicos dos folhetos interior e exterior são diferentes 22. Por exemplo, Whittenton et ai. geradas GVs assimétricas com lipídios catiônicos na folheto interno para encapsular polinucleótidos carregados negativamente, e com lipídios neutros no folheto externo para diminuir a toxicidade e captação celular não específica 33. Em quarto lugar, a fracção de volume e concentração de substâncias no interior dos GVs pode ser relativamente altas = &quot;xref&quot;&gt; 28, 34. Em quinto lugar, múltiplos tipos de materiais podem ser encapsulados 35. Por exemplo, Nishimura et ai. encapsulado um sistema de transcrição-tradução in vitro em GVs e usou o sistema para expressar a proteína fluorescente verde (GFP) na GVs 36. Estas cinco características fazem w / o emulsão centrifugação um método indispensável para a geração de GVs-imitando celulares. Em trabalhos anteriores, a GVS gerados por centrifugação foram recolhidos por meio de uma seringa equipada com uma agulha 16 G de aço inoxidável longa contendo alguma da solução aquosa final 22. Nas mãos de técnicos inexperientes, este método de coleta poderia facilmente resultar em contaminação do GV ​​com um pouco do óleo. Neste estudo, foi utilizado o w / o protocolo de emulsão centrifugação desenvolvido pelo grupo Yomo 23, 37,em que precipitaram GVs são recolhidos através de um orifício aberto na parte inferior do tubo de centrifugação, em que eles são preparados. Nós preparamos GVs encapsulando 1,0 mm microesferas, que são semelhantes em tamanho a organelas intracelulares. O uso de microesferas permitiu estimar a sua concentração por meio do cálculo da fração de volume. Estabelecimento de um método para a preparação da GVS em que os materiais são densamente é um passo importante para a criação de células artificiais. Para confirmar a utilidade do nosso protocolo de vários tipos de materiais interiores, que também demonstrado que a GFP e um pequeno solúvel em água molécula fluorescente (uranina) pode ser encapsulado nos GVs.

<table><tbody><tr><td><forte>REAGENTES:</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,2-Dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DOPC)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850375C</td><td>Molécula de membrana vesicular</td></tr><tr><td>Texas Red 1,2-dihexadecanoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina, sal de trietilamônio (Texas Red DHPE)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>T1395MP</td><td></td></tr><tr><td>1 M Tris-HCl (pH 7,5)</td><td>Nippon Gene Co.</td><td>318-90225</td><td>Solução tampão</td></tr><tr><td>D(+)-Glicose</td><td>Wako Pure Chemical Industries</td><td>049-31165</td><td>Para solução de água externa</td></tr><tr><td>Sacarose</td><td>Wako Pure Chemical Industries</td><td>196-00015</td><td>Para solução de água interna</td></tr><tr><td>Microesferas de carboxilato de polibead 1.0 &micro; m</td><td>Polysciences</td><td>08226-15</td><td>Não fluorescente, 2R = 1.0 &micro; m</td></tr><tr><td>Microesferas de carboxilato Fluoresbrite YG 1.0 &micro; m</td><td>Polysciences</td><td>15702-10</td><td>Fluorescente, 2R = 1.0 &micro; m</td></tr><tr><td>Microesferas de carboxilato Fluoresbrite YG 0.10 &micro; m</td><td>Policiências</td><td>16662-10</td><td>Fluorescente, 2R = 0.10 &micro; m</td></tr><tr><td>Sal de sódio de fluoresceína (uranina)</td><td>Sigma Aldrich Japan</td><td>F6377-100G</td><td></td></tr><tr><td>Padrão GFP (recombinante)</td><td>Vector Laboratories</td><td>MB-0752</td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>EQUIPAMENTO: </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga 5427R</td><td>Eppendorf&nbsp;</td><td>5409000233</td><td>Rotor da centrífuga: FA-45-48-11</td></tr><tr><td>Physcotron</td><td>Microtec Co.</td><td>NS-310EIII</td><td>Eixo gerador de microhomogeneizador prático</td></tr><tr><td></td><td>Microtec Co.</td><td>Acessório do homogeneizador</td> <td>NS-4</td></tr><tr><td>Câmaras de incubação Frame-Seal para in situ PCR e hibridização</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>SLF0201</td><td>Volume da câmara de hibridização: 25 &micro; L Tamanho da câmara: 9 &vezes; 9 &vezes; </td></tr><tr><td>Câmaras de incubação Frame-Seal de 0,3 mm para in situ PCR e hibridização</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>SLF0601</td><td>Volume da câmara de hibridização: 65 &micro; L&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Tamanho da câmara: 15 &vezes; 15 &vezes; Pipeta</td></tr><tr><td>Microman E</td><td>Gilson</td><td>FD10006</td> de 0,3 mm <td>para líquido viscoso. Medimos a parafina líquida usando isso.</td></tr><tr><td>Microscópio invertido</td><td>Olympus Co.</td><td>IX73</td><td></td></tr><tr><td>Unidade de espelho</td><td>Olympus Co.</td><td>U-FBNA</td><td>Filtro de excitação: 470 - 495 nm Filtro de emissão: 510 - 550 nm</td></tr><tr><td>Unidade de espelho</td><td>Olympus Co.</td><td>U-FMCHE</td><td>Filtro de excitação: 565 - 585 nm Filtro de emissão: 600 - 690 nm</td></tr></tbody></table>

preparação de gigantes vesículas encapsulamento microesferas por centrifugação de uma emulsão de água-em-óleo

Preparation of Giant Vesicles Encapsulating Microspheres by Centrifugation of a Water-in-oil Emulsion

A biologia construtivo e a abordagem de biologia sintética para criar vida artificial envolvem a montagem de baixo para cima de materiais biológicos ou não biológicos. Tais abordagens têm recebido uma atenção considerável na investigação sobre a fronteira entre a vida e a matéria não-vivo e têm sido utilizados para construir células artificiais ao longo das últimas duas décadas. Em particular, gigante vesículas (GVs) têm sido frequentemente utilizados como membranas celulares artificiais. Neste trabalho, nós descrevemos a preparação da GVS encapsulando microesferas altamente embalado como um modelo de células contendo biomoléculas altamente condensada. Os GVs foram preparados por meio de um método de centrifugação da emulsão água-em-óleo simples. Especificamente, um homogeneizador foi usado para emulsionar uma solução aquosa contendo os materiais a ser encapsulado e um óleo contendo fosfolípidos dissolvidos, e a emulsão resultante foi cuidadosamente em camadas sobre a superfície de uma outra solução aquosa. O sistema em camadas foi então centrifugado tO gerar os GVs. Este método poderoso foi usado para encapsular materiais que variam de pequenas moléculas com as microesferas.

O método de emulsão centrifugação W / O é ilustrado fotograficamente e esquematicamente na Figura 1. A imagem esquemática na figura 1 sugere que o determinante mais importante do sucesso deste método é que a gravidade específica da solução aquosa interior deve ser maior do que a da solução aquosa externa, de modo que os GVs irá precipitar durante a centrifugação. Além disso, a formação de uma monocamada de lípido na interface w / o exige que o sistema de ser refrigerada durante 10 min, depois a emulsão é mergulhado na solução aquosa externa. Porque a forma GVs por transferência de gotículas de emulsão através da interface de w / o, as pressões osmóticas das camadas aquosas interna e externa deve ser o mesmo. Como um experimento controle, foram também preparadas contendo GVs não há microesferas por meio do processo mostrado na Figura 1 e a etapa 1.3, excepto que a solução aquosa foi internapreparada sem microesferas. Recolha dos GVs precipitados após centrifugação é mostrado na Figura 2. Em adição à fase semi-transparente na parte inferior do microtubo, também observamos uma fase intermediária branca, turva no exterior solução aquosa (Figura 2a). Esta fase intermediária era rica em agregações de microesferas e óleo, enquanto que a fase de fundo continha os GVs. Portanto, depois de perfurar o fundo do microtubo com um pino (Figura 2b), foram colhidos apenas a primeira gota (Figura 2c), que continha grandes quantidades de GVs. É importante certificar-se que não mais de duas gotas são recolhidas; quaisquer gotas adicionais podem conter agregados de microesferas e lípidos, o que resultará numa densidade inferior da GVS. A dispersão vesicular obtidas muitas vezes continha materiais encapsulados fora dos GVs porque os GVs ofteN ruptura durante a centrifugação. Para obter Somente a GVS, um método de triagem, tais como diálise, filtração em gel, ou de células activadas por fluorescência deve ser escolhido, devido aos tamanhos dos materiais encapsulantes. Se necessário para a finalidade para a qual os GVs são precipitados a ser usado, que pode ser diluído com a solução aquosa externa. Em alguns casos, a fase intermédia alargada para o fundo do tubo, o que sugere que quaisquer vesículas que se formaram foram mantidas juntas por o óleo. Foram obtidas por microscopia de interferência e microscopia de fluorescência imagens diferenciais dos GVs sem microesferas (Figura 3a, 3b) e com microesferas (Figura 3c -3 F). Consistente com relatórios anteriores 23, 37, GVs com baixa lamelaridade foram formados por nosso protocolo. Lipídios conjugadas com Texas Red DHPE, que emite FLUORES vermelhascência, foram usados ​​de modo que a formação de vesículas pode ser confirmada directamente através da visualização da membrana fina. Dos 160 GVs que obtivemos, 55 microesferas encapsuladas e 105 estavam vazias, dando uma proporção de encapsulação de 34%. Determinou-se a fracção de volume (φ, vol%) de microesferas nos GVs por meio do método seguinte. Porque cada GV contém dezenas a várias centenas de microesferas, contando todas as microesferas sob um microscópio óptico é um desafio. Por isso, misturou-se as microesferas não fluorescentes 1,0 um com uma pequena quantidade de microesferas fluorescentes, que foram contadas manualmente sob o microscópio de fluorescência. O número total (N) de microesferas encapsulado foi calculado multiplicando o número (n) de microesferas fluorescentes contadas manualmente por 20 (com base no original 95: 5 [v / v] razão de não fluorescente a microesferas fluorescentes). O valor de66; em seguida, foi estimada como 100 Nv / V, em que V é o volume das microesferas e V é o volume do GV indivíduo. Note-se que a estimativa de N a partir de N dá origem a erros de contagem, e estes erros deve ser tida em conta no cálculo φ. O valor de φ foi estimada a partir de N, que foi calculada directamente como 20 N, e esta por sua vez, resultou em que a probabilidade &amp; Phi representa com precisão o verdadeiro valor é &lt;50%. Na verdade, N flutua em certa medida, em torno de 20 n, por isso temos de considerá-lo como 20 (n ± i), onde i é o erro no n. Estimou-se que, a fim de que uma probabilidade de n ± i poderia ser mais do que 50%, obtido a partir de uma distribuição de Poisson. Estimou-se i, que por sua vez permitiu calcular 20 (n ± i) e os valores de66; que incluiu contagem de erros para GVs com diâmetros de 10 e 15 uM (Tabela 1). De acordo com este procedimento, a fracção de volume de microsferas no GV mostrados na Figura 3c foi estimada em 11 ± 3% em volume. A precisão da fracção de volume calculado foi de 10-30%. Os nossos resultados indicam que encapsulados com êxito 1 uM microesferas na GVS a uma fracção de elevado volume. Nós também foram capazes de encapsular outros materiais em 100% em moles de DOPC GVs utilizando a mesma solução aquosa externa e o mesmo protocolo (Figura 4). Especificamente, foram preparados GVs contendo 0,1 uM microesferas a partir de uma solução de Tris-tamponada contendo Tris-HCl 0,1 M (pH 7,5), 0,15 M de sacarose e 0,5% em volume de microesferas fluorescentes por meio do protocolo descrito por GVs contendo microesferas de 1,0 mícrons ( Figura 4a). Seguindo o protocolo descrito above, DOPC GVs contendo GFP (0,1 M de Tris-HCl [pH 7,5], 0,15 M de sacarose, e 100 ug / mL de GFP; Figura 4b) e GVs contendo uranina (Tris-HCl 0,1 M [pH 7,5], 0,15 M de sacarose, e 30 uM uranina; Figura 4c) também foram preparadas. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> n </td><td> N </td><td> φ (10 um de diâmetro) </td><td> φ (15 um de diâmetro) </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 60 ± 20 </td><td> 6,0 ± 2,0 </td><td> 1,8 ± 0,6 </td></tr><tr><td> 4 </td><td> 80 ± 20 </td><td> 8,0 ± 2,0 </td><td> 2,4 ± 0,6 </td></tr><tr><td> 5 </td><td> 100 ± 20 </td><td> 10 ± 2 </td><td> 3,0 ± 0,6 </td></tr><tr><td> 6 </td><td> 120 ± 30 </td><td> 12 ± 4 </td><td> 3,6 ± 1,2 </td></tr><tr><td> 10 </td><td> 200 ± 32 </td><td> 20 ± 3 </td><td> 5.9 ± 0,9 </td></tr><tr><td> 20 </td><td> 400 ± 45 </td><td> 40 ± 5 </td><td> 12 ± 2 </td></tr><tr><td> 30 </td><td> 600 ± 55 </td><td> - </td><td> 18 ± 2 </td></tr><tr><td colspan="4"> um erros foram determinados como descrito no texto; n = número de microesferas contados manualmente; N = número total de microesferas encapsuladas. </td></tr></tbody></table> Tabela 1: Números e Volume fracções (φ, vol%) de microesferas a. um erros foram determinados como descrito no texto; n = número de microesferas contados manualmente; N = número total de microesferas encapsuladas. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/55282/55282fig1.jpg" /> Figura 1: Fluxo de Ch<html> arte e esquemática Representação de W / O emulsão método de centrifugação. (A) solução de óleo consistindo de DOPC e vermelho do Texas DHPE (100: 0,3 razão molar) em parafina líquida. (B) dispersão aquosa interna que consiste em sacarose e microsferas em tampão Tris-HCl. (C) solução aquosa exterior constituída de glicose em tampão Tris-HCl. (D) mistura de 1 ml de solução de óleo e 300 ml de dispersão aquosa interna. (E) A emulsificação com um homogeneizador (10,000 rpm, 2 minutos). (F) A W / O emulsão. (G) A divisão em camadas de 300 mL da emulsão em 1 ml de solução aquosa exterior. (H) precipitou GVs apenas após a centrifugação. (I) Representação esquemática do princípio do método de emulsão centrifugação w / o. A seta preta indica a direcção da aceleração centrífuga..jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/55282/55282fig2.jpg" /> Figura 2: Piercing do microtubo. (A) precipitou GVs apenas após centrifugação (também representado na Figura 1h). A elipse vermelha indica a gota da dispersão GV precipitado. (B) Piercing do microtubo com um alfinete. O sedimento contendo a GVs foi obtida pela perfuração da microtubo perto da parte inferior com um pino e recolher gotas a partir do furo. (C) Gota dos GVs precipitados (indicado pela seta amarela) dispersão diluída com a solução aquosa externa. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55282/55282fig2.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> Figura 3: As imagens de microscopia da GVS. (A) Imagem de microscopia de contraste de interferência diferencial de um GV sem microesferas. O diâmetro de GV era cerca de 10 um. Barra de escala = 10 mm. Imagem de microscopia (b) A fluorescência de uma GV sem microesferas. A fluorescência vermelha foi emitida por Texas Red DHPE. (C) imagem de microscopia de contraste de interferência diferencial de uma GV contendo microesferas. (D) Microscopia de Fluorescência imagem de 1,0 uM microesferas (microesferas YG carboxilato) dentro de uma GV. O número de microesferas fluorescentes contados (n) foi estimada 6. os erros (i = 2) com base na distribuição de Poisson. Em seguida, estimado o número total de microesferas interiores (N = 20 (N ± i)) foi de 120 ± 40. Foi calculado que oGV continha 1,0 pM microesferas a uma fracção de volume (φ = Nv 100 / V) de cerca de 11 ± 3% em volume, em que V é o volume das microesferas e V é o volume dos GVs. (E) Microscopia de Fluorescência imagem de uma membrana GV. A fluorescência vermelha foi emitida por Texas Red DHPE. (F) Incorporada imagem das imagens em painéis d e e. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55282/55282fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/55282/55282fig4.jpg" /> Figura 4: interferência diferencial contraste e microscopia de fluorescência Imagens da GVS, com diferentes materiais encapsulados. microscopia de contraste de interferência diferencial (topo) e microscopia de fluorescência (inferior) de imagensGVs contendo (a) 0,1 uM microesferas, (b) GFP, e (c) uranina. Barras de escala = 10 uM. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55282/55282fig4large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Vesículas gigantes contendo componentes micrométricos altamente compactados são modelos de células úteis. O método de centrifugação em emulsão água-em-óleo é uma ferramenta simples e poderosa para a preparação de vesículas gigantes com materiais encapsulados.

Preparação de gigantes Vesículas Encapsulamento microesferas por centrifugação de uma emulsão de água-em-óleo

The constructive biology and the synthetic biology approach to creating artificial life involve the bottom-up assembly of biological or nonbiological ...

O objetivo geral deste método de centrifugação de emulsão água-em-óleo é preparar facilmente uma camada fina de vesículas gigantes. Este método pode ajudar a responder questões-chave na área de biologia sintética, como a criação de uma célula artificial baseada em uma vesícula gigante. Para iniciar este procedimento, prepare uma solução estoque de 25 milimolar de DOPC e uma solução estoque de zero vírgula dois milimolar de Texas Red DHPE em clorofórmio.Em seguida, forme um filme lipídico na superfície interna de um frasco de vidro de cinco mililitros evaporando uma mistura das soluções estoque de DOPC e Texas Red DHPE sob fluxo de gás nitrogênio. Após incubar o filme sob pressão reduzida durante a noite, adicione um mililitro de parafina líquida ao frasco. Envolva o frasco com folha de alumínio e incube a mistura a 80 graus Celsius durante a noite.Em um microtubo com tampa de 1,5 mililitro, misture 237,5 microlitros de microesferas não fluorescentes de 1 micrometro e 12,5 microlitros de microesferas fluorescentes de 1 micrometro. Adicione agora 64 miligramas de sacarose, seguidos por 125 microlitros de solução tampão de Tris 1 molar e 875 microlitros de água deionizada ao microtubo. Vortexe a mistura por 30 segundos e, em seguida, sonique por 10 minutos.Após o preparo de 10 mililitros de uma solução tampão com Tris, coloque um mililitro em um microtubo com tampa de 1,5 mililitro. Depois que a solução tiver sido agitada em vórtex e sonicada, misture um mililitro da solução oleosa com 300 microlitros da solução aquosa interna em um microtubo de 1,5 mililitro. Emulsifique os dois componentes no microtubo utilizando um homogeneizador mecânico operado a 10.000 rpm durante dois minutos à temperatura ambiente.Em seguida, sobreponha cuidadosamente 300 microlitros da emulsão água-em-óleo sobre a superfície superior de um mililitro da solução aquosa externa a quatro graus Celsius em um microtubo com tampa de um ponto cinco mililitros. Imediatamente após resfriar o microtubo por 10 minutos, centrifugue a mistura a 18.000 vezes G durante 30 minutos. Ao finalizar, obtenha as vesículas gigantes precipitadas, ou GVs, perfurando a base do microtubo com um alfinete e coletando uma gota em um microtubo esterilizado de um ponto cinco mililitros.Coloque uma câmara de incubação adesiva para NC, duas reações em cadeia da polimerase e hibridização, sobre um vidro de cobertura de microscópio. Usando uma micropipeta, deposite 25 microlitros dos GV precipitados e diluídos na área do espécime e imediatamente coloque um vidro de cobertura de 0,15 milímetro de espessura sobre a câmara de incubação. Após registrar as imagens de microscopia das vesículas, realize microscopia de fluorescência inserindo primeiro os conjuntos de espelho de fluorescência UFBNA e UFMCHE no microscópio.Em seguida, configure as unidades com filtros de excitação e filtros de emissão para a análise. O fator mais importante para o sucesso do método de água-em-óleo é que a densidade específica da solução aquosa interna deve ser maior do que a da solução aquosa externa, para que as VGs precipitem durante a centrifugação. A microscopia de interferência diferencial e a microscopia de fluorescência das VGs sem microesferas e com microesferas confirmaram que foram formadas VGs com baixa lamelaridade.Dos 160 GV obtidos, 55 continham microesferas encapsuladas e 105 estavam vazios, resultando em uma proporção de encapsulação de 34%. A fração volumétrica de microesferas nos GV foi estimada em cerca de 11 ± 3% em volume, e a precisão da fração volumétrica calculada foi de 10 a 30%. A encapsulação de outros materiais em GV de DOPC a 100% molar, utilizando a mesma solução aquosa externa e o mesmo protocolo, foi bem-sucedida, conforme demonstrado por microscopia de interferência diferencial e microscopia de fluorescência. Após este procedimento, outros métodos, como citometria de fluxo, podem ser realizados com o objetivo de responder perguntas adicionais, como a elucidação da célula modelada.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como preparar vesículas gigantes com materiais encapsulados.

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JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Este protocolo descreve um método de extrusão para a preparação de vesículas lipídicas de sub-micron tamanhos com um elevado grau de homogeneidade. Este método utiliza um sistema de pressão controlada, com taxas de azoto controlados de fluxo para a preparação de lipossomas. A preparação de...

Método de extrusão constante pressão controlada para a Preparação de vesículas lipídicas nanométricas

Aqui nós apresentamos dois protocolos ultra rápidos para reconstituição das proteínas de membrana em fusogenic proteoliposomes e fusão de tais proteoliposomes com bilayers do lipid alvo para detergente livre entrega destas proteínas de membrana para a BICAMADA postfusion. A combinação dessas abordagens permite montagem rápida e facilmente controlada de sistemas complexos de membrana multi-componentes.

Livre de detergente ultra reconstituição das proteínas de membrana em lípidos Bilayers usando Fusogenic Proteoliposomes complementares carregada.

Lipossomas contendo amphiphiles de cadeia única, particularmente os ácidos gordos, apresentam propriedades distintas, em comparação com aqueles que contém diacylphospholipids devido às propriedades químicas únicas de cadeia única amphiphiles. Aqui descrevemos técnicas para a preparação, purificação e utilização de lipossomas composto em parte ou toda a estes amphiphiles.

Preparação, purificação e utilização de lipossomas contendo ácido graxo

Apresentamos uma técnica para micromanipulação sem contacto das vesículas, usando gradientes de íons cálcio localizadas. Microinjeção de uma solução de íons cálcio, nas proximidades de uma vesícula lipídica gigante, é utilizada para remodelar a membrana lipídica, resultando na produção de saliências de membrana tubular.

Remodelação de membrana das vesículas gigantes em resposta a gradientes de íons cálcio localizadas

Este estudo descreve a hidratação clássica utilizando o método de filme lipídico fino para preparo de nanolipoalguns seguido de caracterização de nanopartículas. Uma proteína 47 kDa-hidrófilo e globular, Tarin, é encapsulada com sucesso como uma estratégia para melhorar a estabilidade, evitar o afastamento rápido, e promover a liberação controlada. O método pode ser adaptado ao encapsulamento de moléculas hidrofóbicas.

Preparação e caracterização de Nanolipossomas para a aprisionamento de proteínas globulares hidrofílicas bioativas

O objetivo do protocolo é medir de forma confiável as propriedades mecânicas da membrana de vesículas gigantes por aspiração micropipette.

Obtenção de vesículas híbridas unilamellares gigantes por eletroformação e medição de suas propriedades mecânicas pela aspiração micropipette

Este artigo introduz um método simples para a produção rápida de vesículas unilamellar gigantes com proteínas citoesqueletal encapsuladas. O método se mostra útil para a reconstituição de estruturas citoesqueletal em interações de confinamento e citoesqueleto-membrana.

Encapsulamento rápido do Citoesqueleto Reconstituído Dentro de Vesículos Unilamellar Gigantes

Neste manuscrito, demonstramos as técnicas experimentais para encapsular o citoesqueleto F-actin em vesículas lipídicas unilamellar gigantes (também chamadas lipossomos), e o método para formar uma camada de F-actin de córtex biomimicing no folheto interno da membrana lipossosome.

In vitro Reconstituição do Actin Cytoskeleton Dentro de Vesículos Gigantes Unilamellar

Apresentamos um protocolo para reconstituição de proteínas de membrana e encapsulamento de enzimas e outros componentes solúveis em água em vesículas lipídicas de tamanho submicrométrico e micrométrico.

Construção de redes metabólicas fora de equilíbrio em vesículas nanométricas e micrométricas

Este guia para iniciantes apresenta um protocolo geral para a preparação de vesículas unilamelares gigantes (GUVs) por meio do método de transferência de gotículas, discutindo as etapas críticas e fornecendo insights para ajudar a possíveis ajustes necessários para diferentes aplicações, incluindo biologia sintética e microrrobótica.

Usando o método de transferência de gotículas para preparar de forma confiável vesículas unilamelares gigantes

Este artigo apresenta uma reconstituição simples de redes do citoesqueleto dentro de vesículas gigantes separadas por fase. O método pode ser generalizado e aplicado ao encapsulamento ou confinamento de uma ampla gama de biomoléculas.

In vitro Reconstituição de Redes Citoesqueléticas no Interior de Vesículas Unilamelares Gigantes Separadas por Fase (GUVs)

Aprenda a preparar vesículas gigantes encapsulando microesferas por centrifugação de emulsão água-em-óleo. Este método simplificado utiliza DOPC e Texas Red DHPE para criar modelos celulares artificiais em biologia sintética.

Preparação de gigantes Vesículas Encapsulamento microesferas por centrifugação de uma emulsão de água-em-óleo

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