Remendo Recordings Grampo na Intact gânglios das raízes dorsais de ratos adultos

O objetivo geral deste experimento é introduzir métodos para preparar os gânglios da raiz dorsal intactos e realizar o registro do patch clamp usando esta preparação. Este método permite o registro de uma única célula dos gânglios da raiz dorsal intacta enquanto estimula o nervo espinhal que entra ou a raiz dorsal que sai. Essa abordagem é especialmente útil ao estudar a contribuição dos neurônios sensoriais primários para a dor.

A principal vantagem dessa técnica é que ela mantém os neurônios e as células gliais satélites adjacentes. Portanto, esta preparação está mais próxima da situação in vivo. Neste procedimento, após o rato ter sido anestesiado, raspe sua região lombar.

Em seguida, faça uma incisão na pele e no tecido subcutâneo ao longo da linha média. Depois, desprenda os músculos periespinhais dos processos espinhosos no nível L1 a S2 usando um elevador periosteal fino. Em seguida, corte os processos espinhosos de L1 a S2. Em seguida, fazer dois cortes transversais na coluna vertebral exposta em aproximadamente L1 e S1 e remover este segmento da coluna vertebral em bloco.

Em seguida, mergulhe-o rapidamente em aCSF frio por dois a três minutos. Depois disso, lave o sangue da coluna vertebral removida e transfira a coluna vertebral para uma placa de Petri com aCSF frio e, em seguida, use um rongeur fino para remover as lâminas. Corte a dura-máter ao longo da linha média com uma microtesoura para expor a medula espinhal.

Em seguida, transfira a vértebra restante com DRG para a segunda placa de Petri cheia de aCSF frio. Identifique os DRGs L4 e L5 com base em sua posição relativa aos processos transversos e ao nervo ciático. Em seguida, libere o DRG dos tecidos conjuntivos circundantes e mantenha a raiz nervosa e o nervo espinhal ligados ao DRG.

Depois disso, transfira o DRG para a terceira placa de Petri para posterior dissecção. Corte uma abertura onde as raízes dorsal e ventral se unam ao DRG e separe a raiz ventral dele. Em seguida, use uma pinça com pontas rombas para segurar o epineuro e use outra pinça fina para rolar o DRG do epineuro.

Continue a remover o máximo possível de epineuro que está ligado ao DRG. Agora, transfira o DRG para a câmara de gravação. Certifique-se de que o lado do DRG onde as raízes nervosas se originam esteja voltado para baixo.

Em seguida, estabilize o DRG com uma âncora. Em seguida, perfunda o DRG com aCSF oxigenado através dos tubos de plástico conectados a uma bomba peristáltica e permita que as células se recuperem por 30 minutos. Após 30 minutos, avalie a qualidade do DRG sob óptica IR-DIC com ampliação de 40x por meio de uma câmera CCD.

Conecte individualmente duas seringas de um mililitro aos porta-pipetas por meio de dois pedaços de tubo de borracha de pequeno diâmetro. Em seguida, coloque uma pipeta de vidro cheia de colagenase em um dos porta-pipetas e uma pipeta de vidro vazia no outro. Em seguida, use o micromanipulador para posicionar as pipetas logo acima do DRG.

Cole as pontas de duas pipetas uma contra a outra suavemente para ampliar as aberturas das pontas das pipetas. Depois disso, mova a pipeta cheia de colagenase para perto da superfície do DRG. Aplique brevemente pressão positiva à pipeta contendo colagenase através do tubo que conecta o suporte e a seringa, deslocando o êmbolo cerca de 0,5 mililitros.

Após 10 a 15 minutos, quando os detritos do epineuro restante forem observados, aplique uma leve pressão negativa na pipeta vazia para sugar os detritos. Desta forma, os neurônios e as células gliais satélites circundantes estarão claramente expostos e prontos para o registro do patch. Neste procedimento, coloque a solução do eletrodo no gelo para evitar a degradação.

Em seguida, encha a pipeta de vidro com solução intracelular filtrada. Em seguida, coloque a pipeta no suporte da pipeta do estágio principal. Aplique uma leve pressão positiva na pipeta através de uma seringa de cinco mililitros, deslocando o êmbolo cerca de um mililitro antes de abaixar a pipeta na solução do banho.

Em seguida, escolha o modo V-Clamp no amplificador e abra a interface de teste de membrana no software. Sob o microscópio, mova a pipeta para perto do neurônio alvo. Em seguida, aplique pressão positiva da pipeta para atravessar a camada de células gliais satélites até que seja observado um aumento repentino do espaço entre o neurônio e a camada circundante de células gliais satélites.

Em seguida, continue movendo a pipeta em direção ao neurônio até que uma covinha seja observada no neurônio. Em nossa preparação, os neurônios são cercados por células gliais satélites. Portanto, para penetrar nas camadas de células gliais e atingir neurônios individuais, a pipeta de registro é mantida a uma alta pressão positiva.

Depois disso, reduza a pressão positiva. Obtenha uma vedação de giga-ohm com sucção suave. Para obter a configuração de registro de células inteiras, penetre na membrana celular do neurônio por meio de uma sucção curta, mas forte.

Como alternativa, use a função zap no amplificador enquanto a sucção é aplicada. Uma vez que um modo de célula inteira é estabelecido, compense a capacitância de toda a célula e a resistência em série girando os botões de compensação de capacitância e resistência no amplificador. Em seguida, feche a janela de teste de membrana.

Escolha o I-Clamp Modo Normal girando o botão de modo no amplificador. Depois, clique em Abrir protocolo no software. Selecione e carregue o protocolo para medir a reobase e clique em gravar para iniciar a gravação.

Para examinar a excitabilidade neuronal, meça a resistência de entrada e a reobase injetando uma série graduada de correntes despolarizantes em etapas de 100 picoamperes. Em seguida, clique em Abrir protocolo novamente e selecione o protocolo para medir o limite da membrana. Posteriormente, injete uma corrente de rampa despolarizante de 500 milissegundos no neurônio.

Para registrar as correntes induzidas pelo ligante, encha uma pipeta com agonistas específicos. Verifique a pipeta para se certificar de que não há bolhas de ar dentro. Em seguida, coloque a pipeta no porta-pipetas que está conectado a um sistema de distribuição de medicamentos.

Use o manipulador para mover a pipeta até 15 micrômetros do neurônio. Defina a pressão do sistema de distribuição de medicamentos para um PSI e a duração para um segundo. Em seguida, mude o modo de gravação para voltage clamp em 70 milivolts.

Aplique pressão brevemente através do sistema de distribuição de medicamentos para registrar uma corrente induzida por medicamentos. Nesta figura, a reobase foi medida injetando uma série de correntes no neurônio DRG. A menor intensidade de corrente que pode induzir um potencial de ação é definida como reobase, conforme indicado pela seta.

A reobase para este neurônio é de 300 picoamperes. O limiar da membrana foi medido por injeção de uma corrente de rampa. O potencial é definido como o limiar da membrana quando um potencial de ação é evocado.

O limiar de membrana para este neurônio é de 11,9 milivolts. Nesta figura, as correntes foram induzidas pela aplicação de glutamato ou AITC por um segundo. Ambos os agonistas induziram correntes internas, sugerindo a presença de receptores de glutamato e receptores TRPA-1 em pequenos neurônios DRG.

Uma vez dominada, essa técnica pode ser concluída em uma hora se for executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de remover o epineuro e manter a alta pressão para a pipeta de registro. Seguindo este procedimento, o registro de patch clamp em células gliais satélites pode ser realizado para responder a perguntas adicionais, como receptores e canais em células gliais satélites.

Essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da dor estudarem a contribuição dos gânglios da raiz dorsal para a nocicepção. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter um bom entendimento sobre como preparar um gânglio de raiz dorsal inteiro e, em seguida, como remendar o grampo de células individuais nesses gânglios de raiz dorsal inteiros.