Agregada Optimization Tamanho em micropoços para sistemas baseados em Suspensão Cardiac diferenciação de células estaminais pluripotentes humanas
25 de setembro de 2016
Os métodos convencionais para iniciar a diferenciação cardíaca baseada suspensão total dos pluripotentes humanas células-tronco (hPSCs) são atormentado com a heterogeneidade da cultura com relação ao tamanho e forma agregada. Aqui, descrevemos um método robusto para a diferenciação cardíaca empregando micropoços para gerar controlado-size HPSC agrega cultivadas em condições de promoção cardíacos.
Primeiro, centrifugue uma célula-tronco pluripotente humana de célula única, ou suspensão HPSC, a 200 vezes g por cinco minutos. Após a centrifugação, aspirar o meio de lavagem e ressuspender as células em meio de agregação, a uma densidade de 1,2 vezes 10 elevado à sexta célula por mililitro. Em seguida, semeie um mililitro da suspensão celular em cada poço na placa de micropoços preparada e distribua uniformemente as células.
Para semear um grande número de poços, periodicamente vórtice a suspensão celular para evitar o assentamento. Após a semeadura, centrifugue a placa a 200 vezes g por cinco minutos. Após a rotação, observe a placa sob o microscópio para confirmar se as células giraram para o fundo de cada micropoço.
Em seguida, incube a placa por 24 horas a 37 graus Celsius em uma incubadora hipóxica de 5% de CO, 5% de O dois. Um dia após a agregação, inspecionar os agregados ao microscópio. Em comparação com a agregação pós-centrífuga imediata, eles devem parecer intactos com bordas lisas.
Remova o sobrenadante segurando a placa de micropoço horizontalmente e colocando a ponta de um micropipetador P-1000 na superfície do meio de cultura e contra a borda do poço. Em seguida, remova lentamente o meio, tomando cuidado para não perturbar os agregados no fundo dos micropoços. Depois de reduzir o nível do meio para cerca de um a dois milímetros da superfície texturizada do micropoço, incline lentamente a placa e aspire lentamente o meio restante do poço.
Adicione um mililitro de meio de indução pré-aquecido recém-preparado em estágio um, segurando a ponta da pipeta contra a borda interna do poço e dispensando muito lentamente o meio contra a parede interna do poço. Retorne a placa à incubadora em condições hipóxicas por três dias. No quarto dia, use uma pipeta sorológica de cinco mililitros para colher os agregados de cada poço da placa de micropoço.
Colete até 10 poços de suspensão agregada em um tubo cônico de 15 mililitros. Deixe os agregados assentarem por 15 minutos em uma incubadora hipóxica. Depois que os agregados se assentarem, aspire cuidadosamente o sobrenadante e ressuspenda os agregados em dez mililitros de meio de lavagem pré-aquecido, para remover as citocinas indutivas residuais.
Centrifugar os agregados a 50 vezes g durante dois minutos. Após a centrifugação, aspirar o sobrenadante e ressuspender os agregados peletizados em meio de indução pré-aquecido na fase dois. Transfira a suspensão agregada para uma placa de fixação ultrabaixa de 24 poços a um mililitro por poço.
Observe os agregados ao microscópio como aglomerados de células compactas uniformes. Incubar em condições hipóxicas até o sexto dia. No sexto dia, acumule até 10 mililitros de agregados por tubo cônico de 15 mililitros como antes.
Depois que os agregados se assentarem, aspire o sobrenadante e ressuspenda os agregados no meio de indução pré-aquecido do estágio três. Usando uma pipeta sorológica de cinco mililitros, redistribua os agregados em uma placa de fixação ultrabaixa de 24 poços, a um mililitro por poço. Realize uma mudança média completa no dia 10 da cultura.
No dia 12, transferir as células para condições de cultura normóxicas de 20% de oxigénio e 5% de dióxido de carbono durante o resto do período de cultura. Após 12 dias de diferenciação, o que corresponde a seis dias no estágio de indução cardíaca, foram observadas três contrações médias e vigorosas em todo o agregado. No dia 17, 74,8% das células são positivas para troponina T cardíaca, por citometria de fluxo, conforme indicado pela porção preenchida do histograma.
Também são mostradas células coradas apenas com o anticorpo secundário, mostrado pela seção não preenchida do histograma. Ao tentar este procedimento, é importante lavar bem os agregados no quarto dia, para remover vestígios de citocinas, especificamente ativina-A, que promove a diferenciação da endoderme, em detrimento da indução cardíaca. Após esse procedimento, outros métodos, como a cultura fria de tipos de células indutivas dentro do agregado, podem ser realizados para responder a outras perguntas, como como a sinalização parácrina de tecidos embrionários vizinhos influencia a diferenciação de células-tronco pluripotentes humanas na linhagem cardíaca.
Visão Geral
Este artigo apresenta um método robusto para diferenciação cardíaca de células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs) utilizando micropoços para gerar agregados com tamanho controlado. O método aborda problemas de heterogeneidade do cultivo associados às técnicas convencionais.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Biologia de Células-Tronco
- Diferenciação Cardíaca
- Engenharia de Tecidos
Antecedentes
- Células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs) podem se diferenciar em vários tipos celulares, incluindo células cardíacas.
- Métodos convencionais frequentemente resultam em agregados de tamanhos e formas variados, afetando os resultados da diferenciação.
- A tecnologia de micropoços oferece uma solução para a geração de agregados uniformes.
- Condições que promovem a diferenciação cardíaca são essenciais para uma diferenciação eficaz.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um método para gerar agregados de hPSC com tamanho controlado.
- Aprimorar a consistência dos resultados da diferenciação cardíaca.
- Facilitar pesquisas futuras em engenharia de tecidos cardíacos.
Métodos Utilizados
- Centrifugação da suspensão de hPSC para formar agregados.
- Uso de placas de microplacas para controlar o tamanho dos agregados.
- Incubação em condições hipóxicas para promover a diferenciação cardíaca.
- Mudanças sequenciais do meio para induzir as fases de diferenciação.
Resultados Principais
- Agregados uniformes foram formados e mantidos durante todo o processo de diferenciação.
- Expressão significativa de troponina T cardíaca foi observada nas células diferenciadas.
- A remoção aprimorada de citocinas indutoras aumentou o comprometimento com a linhagem cardíaca.
- Contrações ao longo de todo o agregado foram observadas após 12 dias de diferenciação.
Conclusões
- O método de micropoços fornece uma abordagem confiável para a diferenciação cardíaca de hPSCs.
- Agregados com tamanho controlado levam a resultados de diferenciação mais consistentes.
- Essa técnica pode ser aplicada para investigar mais a fundo o desenvolvimento cardíaco e a modelagem de doenças.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
O controle do tamanho de agregados na diferenciação cardíaca baseada em suspensão resolve um gargalo fundamental na produção de cardiomiócitos derivados de hPSC: a heterogeneidade do cultivo que leva a rendimentos variáveis. Ao impor a formação uniforme de agregados por meio da tecnologia de micropoços, este método aumenta a confiança preditiva nos resultados da diferenciação, apoiando a geração escalonável e reprodutível de modelos pré-clínicos. Isso posiciona a abordagem como uma ferramenta estratégica para reduzir riscos no comprometimento da linhagem cardíaca em fases iniciais de descoberta e em fluxos de trabalho translacionais.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite investigar vias de sinalização dependentes do tamanho na indução cardíaca, esclarecendo os mecanismos responsáveis pela especificação de linhagem.
- Valor Operacional: Reduz a variabilidade na formação de agregados, melhorando a reprodutibilidade entre experimentos e equipes.
- Valor Preditivo: Apoia a modelagem de resposta à dose de exposição a morfógenos, padronizando a geometria dos agregados como uma variável controlada.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Prontidão para ensaio: Produz microtecidos uniformes adequados para imagem de alto conteúdo e quantificação de cardiomiócitos baseada em citometria de fluxo.
- Escalabilidade: O formato de placa com micropoços permite o processamento paralelo de múltiplas condições ou origens genéticas para triagem comparativa.
- Saída quantitativa: Permite a medição consistente de células positivas para troponina T cardíaca como parâmetro funcional em estudos de perturbação por compostos ou genéticos.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Sistema Relevante para Doenças: Gera agregados cardíacos escalonáveis e homogêneos para modelar cardiomiopatias herdadas ou cardiotoxicidade induzida por fármacos.
- Continuidade Translacional: Conecta a diferenciação em fase de descoberta com a validação pré-clínica, fornecendo material celular consistente entre diferentes lotes.
- Redução de Riscos Mecanísticos: Minimiza variáveis confundidoras decorrentes da heterogeneidade no tamanho dos agregados, aumentando a confiabilidade nas associações entre fenótipo e genótipo.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este método se insere na continuidade entre descoberta e pré-clínico ao permitir a diferenciação padronizada de hPSC, que alimenta aplicações posteriores, como modelagem de doenças, farmacologia de segurança e avaliação de candidatos em medicina regenerativa.
- Biologia da Descoberta: Apoia testes de hipóteses sobre sinais biofísicos na linhagem cardíaca por meio do controle preciso do tamanho e da forma dos agregados.
- Triagem: Oferece matrizes reprodutíveis de microtecidos para triagem de bibliotecas de compostos, com redução de ruído decorrente da variabilidade na agregação.
- Análises: Facilita leituras quantitativas por citometria de fluxo e por imagem (por exemplo, troponina T cardíaca) com melhoria na relação sinal-ruído devido à homogeneidade da população.
- Pesquisa Translacional: Fornece uma fonte escalável de cardiomiócitos para ensaios funcionais pré-clínicos, incluindo contratilidade e eletrofisiologia.
- Reutilização Empresarial: As placas de microplacas podem ser reutilizadas em diferentes projetos e linhagens celulares, apoiando a padronização em nível de plataforma nos fluxos de diferenciação de células-tronco.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva nos resultados de diferenciação ao minimizar o ruído biológico decorrente da variação no tamanho dos agregados.
- Valor Operacional: Melhora a reprodutibilidade e a produtividade por meio da formação padronizada e escalonável de agregados.
- Valor Estratégico: Aumenta a confiança nas decisões de prosseguimento ou interrupção em programas cardíacos precoces, reduzindo falsos negativos decorrentes de diferenciação ineficiente.
- Impacto no Portfólio: Permite a alocação de recursos ajustada ao risco com base em métricas confiáveis de rendimento de cardiomiócitos.
Considerações sobre a Implementação
- Exige experiência em cultura de hPSCs, manipulação de agregados e sistemas de incubação hipóxica.
- Depende do acesso a placas de microplacas com dimensões definidas dos poços e superfícies de baixa adesão.
- Necessita de protocolos padronizados de troca de meio para evitar a desagregação durante as etapas de lavagem.
- Requer validação em diferentes linhagens de hPSCs para garantir que as relações entre tamanho e eficiência de diferenciação sejam consistentes.
- É limitado pela necessidade de equipamentos especializados (incubadoras hipóxicas, placas de baixa adesão) e etapas otimizadas de lavagem com citocinas para prevenir diferenciação fora do alvo.
