Agregada Optimization Tamanho em micropoços para sistemas baseados em Suspensão Cardiac diferenciação de células estaminais pluripotentes humanas

Primeiro, centrifugue uma célula-tronco pluripotente humana de célula única, ou suspensão HPSC, a 200 vezes g por cinco minutos. Após a centrifugação, aspirar o meio de lavagem e ressuspender as células em meio de agregação, a uma densidade de 1,2 vezes 10 elevado à sexta célula por mililitro. Em seguida, semeie um mililitro da suspensão celular em cada poço na placa de micropoços preparada e distribua uniformemente as células.

Para semear um grande número de poços, periodicamente vórtice a suspensão celular para evitar o assentamento. Após a semeadura, centrifugue a placa a 200 vezes g por cinco minutos. Após a rotação, observe a placa sob o microscópio para confirmar se as células giraram para o fundo de cada micropoço.

Em seguida, incube a placa por 24 horas a 37 graus Celsius em uma incubadora hipóxica de 5% de CO, 5% de O dois. Um dia após a agregação, inspecionar os agregados ao microscópio. Em comparação com a agregação pós-centrífuga imediata, eles devem parecer intactos com bordas lisas.

Remova o sobrenadante segurando a placa de micropoço horizontalmente e colocando a ponta de um micropipetador P-1000 na superfície do meio de cultura e contra a borda do poço. Em seguida, remova lentamente o meio, tomando cuidado para não perturbar os agregados no fundo dos micropoços. Depois de reduzir o nível do meio para cerca de um a dois milímetros da superfície texturizada do micropoço, incline lentamente a placa e aspire lentamente o meio restante do poço.

Adicione um mililitro de meio de indução pré-aquecido recém-preparado em estágio um, segurando a ponta da pipeta contra a borda interna do poço e dispensando muito lentamente o meio contra a parede interna do poço. Retorne a placa à incubadora em condições hipóxicas por três dias. No quarto dia, use uma pipeta sorológica de cinco mililitros para colher os agregados de cada poço da placa de micropoço.

Colete até 10 poços de suspensão agregada em um tubo cônico de 15 mililitros. Deixe os agregados assentarem por 15 minutos em uma incubadora hipóxica. Depois que os agregados se assentarem, aspire cuidadosamente o sobrenadante e ressuspenda os agregados em dez mililitros de meio de lavagem pré-aquecido, para remover as citocinas indutivas residuais.

Centrifugar os agregados a 50 vezes g durante dois minutos. Após a centrifugação, aspirar o sobrenadante e ressuspender os agregados peletizados em meio de indução pré-aquecido na fase dois. Transfira a suspensão agregada para uma placa de fixação ultrabaixa de 24 poços a um mililitro por poço.

Observe os agregados ao microscópio como aglomerados de células compactas uniformes. Incubar em condições hipóxicas até o sexto dia. No sexto dia, acumule até 10 mililitros de agregados por tubo cônico de 15 mililitros como antes.

Depois que os agregados se assentarem, aspire o sobrenadante e ressuspenda os agregados no meio de indução pré-aquecido do estágio três. Usando uma pipeta sorológica de cinco mililitros, redistribua os agregados em uma placa de fixação ultrabaixa de 24 poços, a um mililitro por poço. Realize uma mudança média completa no dia 10 da cultura.

No dia 12, transferir as células para condições de cultura normóxicas de 20% de oxigénio e 5% de dióxido de carbono durante o resto do período de cultura. Após 12 dias de diferenciação, o que corresponde a seis dias no estágio de indução cardíaca, foram observadas três contrações médias e vigorosas em todo o agregado. No dia 17, 74,8% das células são positivas para troponina T cardíaca, por citometria de fluxo, conforme indicado pela porção preenchida do histograma.

Também são mostradas células coradas apenas com o anticorpo secundário, mostrado pela seção não preenchida do histograma. Ao tentar este procedimento, é importante lavar bem os agregados no quarto dia, para remover vestígios de citocinas, especificamente ativina-A, que promove a diferenciação da endoderme, em detrimento da indução cardíaca. Após esse procedimento, outros métodos, como a cultura fria de tipos de células indutivas dentro do agregado, podem ser realizados para responder a outras perguntas, como como a sinalização parácrina de tecidos embrionários vizinhos influencia a diferenciação de células-tronco pluripotentes humanas na linhagem cardíaca.