Metodologias para o estudo B. subtilis Os biofilmes como um modelo para a caracterização de pequena molécula biofilme Inibidores

Este estudo apresenta o desenvolvimento de metodologias reprodutíveis para estudar inibidores de biofilme e seus efeitos sobre a multicelularidade de Bacillus subtilis.

Os biofilmes bacterianos são importantes para a saúde humana, protegendo seus residentes bacterianos de agressões ambientais e agentes antimicrobianos. O objetivo deste procedimento foi desenvolver um sistema modelo para avaliar os efeitos de inibidores de pequenas moléculas na formação de biofilme. Esses métodos podem ajudar a estabelecer um conjunto de ferramentas essenciais para o campo do biofilme para selecionar inibidores de pequenas moléculas que visam especificamente a formação de biofilme.

A principal vantagem dessas metodologias é que elas partem de uma estrutura experimental consistente e robusta e fornecem informações quantitativas e qualitativas sobre o mecanismo de ação dos inibidores específicos do biofilme. Embora esses métodos possam fornecer informações sobre os biofilmes de Bacillus subtilis, eles também podem ser aplicados a outras bactérias formadoras de biofilme, como Pseudomonas aeruginosa ou o patógeno vegetal Xanthomonas citri. A microscopia eletrônica de varredura pode ser essencial para analisar o efeito de pequenas moléculas na formação de biofilme, pois permite a observação da matriz extracelular e fornece resolução de célula única.

Para começar, primeiro selecione uma única colônia apropriada e transfira-a para três mililitros de caldo LB. Coloque esta cultura inicial em uma incubadora agitada por quatro horas a 37 graus Celsius. Após a incubação, pegue 1,5 mililitros da cultura inicial e centrifugue por quatro minutos.

Remova cuidadosamente o sobrenadante e, em seguida, suspenda novamente o pellet em 1,5 mililitros de meio MSgg. Para cultivar películas, prepare uma placa de cultura de células de 12 poços adicionando três mililitros de MSgg a cada poço. A alguns desses poços, adicione MSgg com um inibidor de molécula pequena em uma faixa de concentração, distribuindo a localização de diferentes concentrações ao redor do prato, para evitar efeitos de borda.

Meça a densidade óptica a 600 nanômetros da cultura inicial ressuspensa. A cultura deve estar entre 0,6 e um. Isso é fundamental para a robustez do sistema.

Inocular cada poço da placa de cultura com 3 microlitros da cultura inicial ressuspensa. Em seguida, incube a placa a 23 graus Celsius por três dias em condições estáticas. Em seguida, retire a placa da incubadora e observe as películas.

Para cultivar biofilmes, use um modelo e coloque simetricamente quatro gotas separadas de 1,5 microlitros de cultura inicial não lavada em uma placa MSgg de 1,5% de ágar seca de 8,5 centímetros. Deixe as gotas serem absorvidas pelo meio antes de mover a placa. Incube as placas a 30 graus Celsius por três dias.

Usando um binóculo com exposição homogênea da iluminação, verifique se as colônias de biofilme se desenvolveram e formaram uma estrutura tridimensional enrugada. Primeiro, pegue uma lâmina de barbear limpa e corte as colônias de biofilme em duas partes iguais com a ajuda do modelo. Levante cuidadosamente metade da colônia com uma espátula limpa e transfira-a para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro, contendo 500 microlitros de PBS.

Pegue a segunda metade da colônia e transfira-a para um tubo de microcentrífuga contendo 500 microlitros de etanol a 50%. Estes serão usados para avaliar a resistência aos agentes esterilizantes. Depois, da mesma forma, pegue a primeira metade da colônia tratada com D-lisina e coloque-a em PBS.

Em seguida, pegue a segunda metade dessa colônia e transfira-a para o etanol. Incube todos os tubos que contêm as metades do biofilme por 10 minutos em temperatura ambiente. E então, centrifugue-os por cinco minutos a 18.000 vezes g.

Usando uma pipeta, remova cuidadosamente o sobrenadante. Adicione 300 microlitros de PBS e, em seguida, sonice as células em uma configuração baixa, com um sonicador de microponta. Adicione mais 700 microlitros de PBS para um volume final de um mililitro.

Em seguida, execute uma diluição serial de 10 elevado a menos sete em PBS. Pegue 100 microlitros de uma das diluições e inocule uma placa de 1,5% de ágar LB. Repita esta etapa para duas outras diluições por amostra.

Espalhe o inóculo usando contas de vidro e, em seguida, incube as placas durante a noite a 30 graus Celsius. Examine as placas e conte as unidades formadoras de colônias, ou UFC. Depois de calcular o valor da UFC por mililitro, calcule a porcentagem de sobreviventes nos tratamentos PBS versus etanol.

Para iniciar a fixação da amostra, primeiro prepare uma solução fixadora fresca suficiente para o número desejado de colônias de biofilme. Adicione cuidadosamente cinco mililitros de fixador a cada placa de Petri e evite pipetar diretamente nas colônias. As colônias começarão a se desprender do ágar e flutuar.

Sele cuidadosamente as placas com parafilme e incube em um agitador rotativo por duas horas em temperatura ambiente. Transfira as placas para armazenamento de quatro graus Celsius durante a noite. Remova suavemente o líquido fixador com uma pipeta Pasteur, conectada a um vácuo.

Adicione 10 mililitros de cacodilato de sódio 100 nanomolar, tampão de cloreto de cálcio de cinco milimolares para lavar o biofilme e incube por cinco minutos. Separe cuidadosamente o centro da colônia de biofilme da placa de ágar com uma pipeta Pasteur. Para secar as colônias ao ar, corte o papel de filtro de celulose em quartos e, em seguida, mergulhe uma seção em 100% de etanol.

Transfira cuidadosamente uma colônia de biofilme flutuante para o papel. Coloque o papel em uma placa de Petri forrada com papel de filtro seco. Em seguida, cubra o prato e deixe-o em um capuz químico para secar durante a noite.

Para preservar a morfologia da colônia de biofilme, é importante revestir completamente o biofilme flutuante com o papel de celulose. Uma vez no papel, o biofilme não pode ser reajustado. Cubra um toco de microscopia eletrônica com fita de carbono e, em seguida, use uma pinça para transferir cuidadosamente as colônias de biofilme para o toco.

Depois de conectar cada colônia ao toco, adicionando uma ponte fina de fita de carbono, armazene os tocos em um dessecador por 24 horas ou até que seja necessário. Esta etapa requer uma mão firme e precisa, pois nesta fase os biofilmes são muito frágeis e facilmente fraturados. O desafio é montar uma parte substancial do biofilme sem rachaduras.

No dia do exame, coloque as colônias em um revestidor de pulverização catódica de paládio de ouro. Cubra as amostras por dois minutos em um ângulo de 60 graus. Repita esta etapa duas vezes, girando as amostras 120 graus entre elas.

Por fim, cubra as amostras uma vez por três minutos a partir do topo. As amostras agora estão prontas para aquisição de imagens no SEM. Essas imagens mostram a formação pelicular de B. subtilis cultivada em meio MSgg indutor de biofilme.

Com a adição do inibidor de pequenas moléculas D-lisina, o desenvolvimento da película é reduzido. E à medida que a concentração do inibidor aumenta, a formação da película mostra uma diminuição correlacionada. Este gráfico mostra o efeito da exposição ao etanol na sobrevivência de células dentro de colônias de biofilme, tratadas com um inibidor de D-lisina ou não tratadas.

As colônias tratadas com D-lisina e expostas a 50% de etanol por 10 minutos mostraram uma redução dramática na sobrevida em comparação com a fração não tratada. Imagens binoculares de cima para baixo mostram que as colônias cultivadas na presença de D-lisina eram menores em geral e formavam rugas menos pronunciadas do que aquelas não tratadas. Imagens de microscópio eletrônico de varredura de colônias de biofilme secas de ponto crítico revelam ainda mais o desenvolvimento alterado do biofilme.

A matriz de substâncias poliméricas extracelulares, ou EPS, parecia mais uma teia de aranha em amostras não tratadas, com amostras tratadas mostrando menos organização. Finalmente, o exame na resolução de células bacterianas individuais mostra que as células tratadas são alongadas na aparência, menos cobertas com EPS e não tão fortemente conectadas às suas vizinhas quanto as células não tratadas. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que definir uma estrutura consistente para estudar inibidores de biofilme é essencial para resultados reprodutíveis.

Uma vez dominado, uma triagem de pequenas moléculas para inibição de biofilme pode ser feita em menos de uma semana se for realizada corretamente. Após este procedimento, outros métodos, como a investigação da expressão gênica em células de biofilme único, podem ser realizados para obter informações adicionais sobre o alvo do inibidor de molécula pequena. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como analisar o efeito geral de inibidores de biofilme específicos no desenvolvimento do biofilme e na resistência a antibióticos.