Name: Metodologias para o estudo B. subtilis Os biofilmes como um modelo para a caracterização de pequena molécula biofilme Inibidores (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 17 s
Description: Aprenda metodologias reprodutíveis para estudar inibidores de biofilmes em Bacillus subtilis. Este protocolo fornece insights quantitativos e qualitativos sobre mecanismos de ação de inibidores específicos.

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A imagem do microscópio eletrônico foi conduzida na Unidade de Microscopia Eletrônica do Instituto Weizmann de Ciência, apoiada em parte pelo Centro Irving e Cherna Moskowitz para Nano e Bio-Nano Imaging. Esta pesquisa também foi apoiada pela bolsa ISF I-CORE 152/1, Sr. e Sra. Dan Kane, Sra. Lois Rosen, por uma bolsa de pesquisa Yeda-Sela, pela Larson Charitable Foundation, pelo Ruth and Herman Albert Scholars Program for New Scientists, pelo Instituto Ilse Katz de Ciências dos Materiais e bolsa de Pesquisa em Ressonância Magnética, pela bolsa do Ministério da Saúde para métodos alternativos de pesquisa, e pelo Programa de Pesquisa de Cooperação França-Israel - Maimônide-Israel. A IKG recebeu a Cadeira de Desenvolvimento de Carreira Rowland e Sylvia.

1. Avaliar o efeito de pequenas moléculas inibidores de Película e formação de biofilme Colony <ol><li> Prepara-se uma solução de meio de indução de biofilme MSgg definido 2x 25 sem o cloreto de cálcio e ferro (III), cloreto de hexa-hidrato. Após a esterilização do filtro, adicionar o cloreto de cálcio. O meio é pronto para usar directamente ou pode ser armazenado a 4 ° C no escuro. </li><li> Preparar uma diluição 1x MSgg no dia da experiência. <ol><li> Dilui-se o meio 2x MSgg para 1x com água destilada estéril (películas) ou ágar estéril de 3% quente (80 ° C) (biofilmes) e adicionar ferro (III) hexa-hidratado cloreto a uma concentração final de 50 uM (películas) ou 250 uM ( biofilmes). Adicionar antibióticos ou inibidores de moléculas pequenas para a concentração desejada e misturar bem. Por exemplo, para se obter uma concentração final de mM de D-leucina em 30 ml de 0,5 para estabelecer películas ou biofilmes, adicionar 196,6 ul de uma 76,3 mM (10 mg / ml) solução de D-leucina. NÃOTE:. A composição final 1x MSgg é descrito na Tabela 1, em comparação com a receita original 25, o meio continha 50 ug / ml de treonina e a concentração de ferro para crescer colónias de biofilme em meio MSgg sólido foi aumentada de 2,5 vezes para optimizar a morfologia de colónia rugosa . </li></ol></li><li> Após a solidificação do agar, secar as placas MSgg sólidos em uma capa biológica durante 30-45 minutos antes da inoculação. </li><li> Para seleccionar inibidores específicos que interferem com os mecanismos de formação de película (Figura 1), exclui que as concentrações utilizadas e afectar planctônicas crescimento estática. <ol><li> Determinar crescimento planctônicas (aumento na densidade óptica com o tempo em cultura líquida) de uma curva de crescimento simples através da medição da densidade óptica a 600 nm a cada hora até que a fase estacionária de crescimento. </li><li> Para confirmar que a turbidez da cultura medida representa as contagens de células vivas, determinar o número de unidades formadoras de colónias (CFU)de células em fase de crescimento planctônicas de uma cultura sob agitação após vários pontos no tempo. </li><li> Para avaliar o efeito de inibidores de molécula pequena sobre o crescimento da película estática, células de colheita, no final de uma incubação de 3 dias a 23 ° C a partir de uma cultura de células de 24 poços bem, inoculadas nas mesmas condições tal como descrito nas secções 1,7-1,9 e determinar a CFU. Por este controle, usar uma estirpe deficiente em película que não possua os operões que codificam para os componentes da matriz extracelular (por exemplo, B. subtilis Δ EPSH, Δ tasa). NOTA: Esta estirpe é capaz de crescer sob condições estáticas, mas em contraste com um tipo selvagem de formação de película, que é deficiente na capacidade de flutuar para a interface ar-líquido, em que o crescimento é favorecido devido ao aumento dos níveis de oxigénio 26. Assim, esta matriz-extracelular e tensão película com deficiência é uma estirpe de referência recomendado para avaliar o crescimento em condições estáticas. NOTA: Para o ex específicaampla do D-amino ácido D-leucina não-canônico descrito abaixo, um efeito sobre planctônicas e crescimento estática em concentrações que interferiram com a formação de película foi descartada 12,17. Os métodos para determinar o crescimento planctônicas e estática são descritos em pormenor 17. </li></ol></li></ol><img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/54612/54612fig1.jpg" /> Figura 1. Visão Conceitual para a identificação de uma configuração experimental robusto para avaliar a inibição específica da formação de biofilme. Os critérios de seleção para os inibidores de pequenas moléculas que indicam a interferência específica à formação de biofilme sem efeito pronunciado sobre o crescimento planctônicas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54612/54612fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <ol start="5"><li> Streak fora B. subtilis de um estoque de -80 ° C (cultu LBre de 10 9 células / mL congelados em glicerol a 20%) para isolar colónias únicas em uma placa% agar-LB 1.5 com uma ponta estéril ou aplicador. </li><li> Crescer durante a noite a 30 ° C. </li><li> Passo crítico: Para uma inibição de película sólida por os ácidos não-canónica D-aminoácidos tais como D-leucina, crescer uma única colónia colhidos a partir da% placa de ágar-1,5 LB em 3 ml de caldo LB a 37 ° C durante 4 horas numa agitando incubadora (balançando velocidade de 200 rpm). Substituir o caldo de LB médio com MSgg indutor de biofilme antes da inoculação por centrifugação de 1,5 ml de cultura de arranque durante 4 min a 6000 xg, removendo cuidadosamente o sobrenadante e re-suspensão do sedimento em 1,5 ml de meio MSgg. O resto da cultura pode ser descartado. Importante: Para assegurar a robustez do sistema, a densidade óptica a 600 nm (DO600) da cultura de arranque deve ser lavada entre 0,6 e 1. </li><li> Durante o crescimento da cultura de arranque, preparar uma placa de cultura de células multidish contend de 12 poçosg 3 ml de meio MSgg sem ou com uma gama de concentrações do inibidor de molécula pequena (por exemplo, 0,3, 0,5, 1 mM de D-leucina 17). Para excluir os efeitos de borda, distribuir a localização das diferentes concentrações do outro lado da placa multidish. Em alternativa, usar de 24 poços de cultura celular multidish placas contendo 1,5 ml de meio MSgg. </li><li> Inocular os poços da cultura de células-placa de 12 poços multidish com 3 ul da cultura de arranque lavada (diluição 1: 1000). NOTA: A razão de diluição inferior, isto é, 1: 500 pode ser utilizado. Isto diminui o tempo de desenvolvimento das películas. </li><li> Crescer as películas a 23 ° C, em condições estáticas, durante três dias. Não se mova as películas durante este tempo, uma vez que pode afectar a morfologia da superfície final da película. </li><li> Adquirir imagens com uma exposição binocular e homogénea de um raio. Alternativamente, tirar uma foto das películas com uma câmera de alta resolução. Para evitar artefactos causados ​​por inconsisângulos de luz tenda e sombras, dê top-down fotos com a câmera fixa num tripé e utilizar uma fonte de luz suave e grande em 45 ° de ambos os lados. NOTA: Um método alternativo para estudar B. subtilis multicelularidade é o ensaio colônia biofilme em meio sólido, induzindo-biofilme MSgg. Tal como películas, este ensaio permite o estudo de processos de espaço-temporais. Uma vez que o intervalo activo de inibidores de moléculas pequenas é determinada, o seu efeito sobre a formação de colónias de biofilme pode ser estudada. </li><li> Para crescer colónias de biofilme, simetricamente detectar 1.5 ul de pré-cultura não lavado (Passo 1.7) sobre a 1,5% MSgg placa de agar seca com a ajuda de um modelo - 4 gotas por placa de Petri de diâmetro de 8,5 centímetros. Deixe as gotas adsorver à placa antes de movê-los. NOTA: O modelo ajuda a obter uma distribuição igual das colônias biofilme dentro da área onde as células são cultivadas. Para preparar o modelo, desenhar a área total de crescimento em escalas originais, dividi-lo à igualdade de seitaRUP e marcar o centro. Para um prato redondo Petri de 8,5 cm de diâmetro, este atribui 14 cm2 a uma colónia de biofilme. </li><li> Incubar as placas a 30 ° C durante três dias. Durante este tempo, as colónias de biofilme se desenvolvem para formar uma estrutura tridimensional, enrugado. </li><li> Tire fotos como no passo 1.11. </li></ol> 2. Etanol Resistência Assay <ol><li> Crescer biofilmes conforme descrito nas etapas 1,1-1,7 e 1.12-1.14. </li><li> Após 68 horas de crescimento a 30 ° C, as colónias de biofilme cortar em duas partes iguais com a ajuda de uma lâmina de barbear e o molde. </li></ol><img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54612/54612fig2.jpg" /> Figura 2. Exemplo desenho experimental para avaliar a resistência das células do biofilme de colónias de agentes esterilizantes. (A) Molde utilizado para a distribuição igual de colónias de biofilme através de uma placa de Petri e para o corte. (B)imagens de cima para baixo não tratada do tipo selvagem biofilme cresceu por 68 horas em meio sólido, definido indutoras de biofilme MSgg a 30 ° C. O alargamento mostra como uma colônia de biofilme pode ser cortado em duas metades iguais. (C) As duas metades iguais de biofilme são tratados da mesma forma (o controlo, PBS) ou com PBS ou agente de esterilização e processados como descrito. Barra de escala:. 1 cm <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54612/54612fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <ol start="3"><li> Cuidadosamente levantar cada metade da colónia biofilme da placa de agar com uma pequena espátula e movê-lo para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml contendo 500 ul de solução salina tamponada com fosfato (PBS). Se necessário, raspar as restantes células a partir da placa e transferi-los para o tubo de microcentrífuga bem. NOTA: A segunda metade da colónia biofilme é tratada diferencialmente, dependendo se é o controlo ou para testar a resistência à Steriagentes Lizing. </li><li> Para o controlo, incubar a segunda metade da colónia de biofilme em 500 ul de PBS como no passo 2.3. Para avaliar a resistência aos agentes esterilizantes, transferir a segunda metade da colónia biofilme a 500 ul 50% (v / v) de etanol. NOTA: esterilização Alternativa agentes, tais como o hipoclorito de sódio pode ser utilizado. Para todos os agentes de esterilização utilizados, determinar o tempo de concentração e de incubação ativa de uma experiência preliminar. </li><li> Incubam-se as colónias de biofilme durante 10 min sobre a bancada à temperatura ambiente. </li><li> Centrifugar as colônias biofilme durante 5 minutos a 18.000 xg e remova cuidadosamente o sobrenadante com uma pipeta. Adicionar 300 ul de PBS. </li><li> Sonicar as células suavemente (amplitude de 10%, de pulso 5 s) com a microponta de um sonicador. NOTA: A energia de ultra-sons deve ser suficiente para agregados biofilme separadas. No entanto, ultra-sons muito dura pode lisar as células. Confirme antecipadamente por microscopia de luz que a energia sonicaçãoutilizadas não lisar as células e que todos os agregados sejam dissolvidos. </li><li> Adicionar 700 ul de PBS a um volume final de 1 ml. Efectuar uma diluição em série (a 10 -7) em PBS e espalhar 100 ul de 3 diluições numa placa de agar LB a 1,5%, utilizando esferas de vidro estéreis. NOTA: As diluições óptimas a ser revestida deve ser determinado numa experiência preliminar, uma vez que depende da quantidade de células do biofilme colónia de interesse e a taxa de sobrevivência das células em resposta ao agente de esterilização. </li><li> Incubar as placas durante a noite a 30 ° C, a contagem de CFU e determinar CFU / ml. A partir do final de UFC / ml de cada colônias meio de biofilme, calcular a percentagem de sobreviventes. NOTA: Quando realizada e analisada tal como descrito, as duas metades da colónia de controlo do biofilme e o tratamento contra metade tratada com etanol da colónia de biofilme não tratada deve dar origem a diferenças inferiores a 10% na contagem de células viáveis, verificando a simetria ou a resistência da colónia , respectively. Alternativamente, os resultados podem ser representados no total de CFU. As contagens de células de controlo e da colónia não tratada biofilme deve permanecer na mesma ordem de grandeza. Em contraste, espera-se que as contagens de células da metade tratada com etanol de uma pequena colónia tratada biofilme molécula-a cair por um mínimo de duas ordens de grandeza a reivindicação para um aumento da sensibilidade para o agente de esterilização. </li></ol> 3. biofilme Colony Preparação de Amostras para Microscopia Eletrônica de Varredura <ol><li> Crescer colônias biofilme conforme descrito nas etapas 1,1-1,7 e 1.12-1.14. </li><li> Prepara-se uma nova porção de 2% (v / v) de glutaraldeído, 3% (v / v) em solução de paraformaldeído a cacodilato de sódio 100 mM, tampão de cloreto de cálcio 5 mM, pH 7,3. Prepare 5 ml de fixador para cada placa de Petri de diâmetro de 8,5 centímetros. CUIDADO: glutaraldeído e paraformaldeído são perigosos. Lidar com eles com equipamento de segurança dentro de um capuz químico. Descartar as soluções e os materiais contaminados para o hazresíduos ardous. </li><li> Adicionar cuidadosamente o fixador para as colônias biofilme, sem dispensar diretamente em cima dos biofilmes. NOTA: Devido ao carácter hidrofóbico da colónia de biofilmes, as colónias lentamente destacar do agar e começar a flutuar. </li><li> Cuidadosamente selar as placas com uma tira de Parafilm. Incubar num agitador rotativo durante 2 horas à temperatura ambiente e subsequentemente transferir as placas a 4 ° C durante a noite. </li><li> No dia seguinte, remover o líquido cuidadosamente com uma pipeta de Pasteur de vidro ligada a uma bomba de vácuo. </li><li> Adiciona-se cuidadosamente 10 ml de 100 mM de cacodilato de sódio, tampão de cloreto de cálcio 5 mM, para lavar o biofilme e incubar durante 5 min. Remova cuidadosamente o líquido com a pipeta de vidro Pasteur a partir do canto da placa para evitar danificar o biofilme e adicionar solução de lavagem fresco por pipetagem suave. Repita este passo uma vez. </li><li> Para a desidratação das colônias biofilme, prossiga com as seguintes etapas: 2x 5 min em DDH 2 O; 2 x 20 min em três0% de etanol; 2 x 20 min em etanol a 50%; 2 x 20 min em etanol a 70%; 2 x 20 min em etanol a 96%; 2x 30 min em 100% de etanol. <ol><li> Adicionar 15 ml de líquido por cada placa de Petri de diâmetro de 8,5 cm de cada passo e remover o líquido cuidadosamente após cada incubação. </li></ol></li><li> Utilizar um dos dois métodos diferentes para a secagem das amostras a partir de etanol. <ol><li> Por secagem ao ar a partir de etanol: <ol><li> Corte um papel de filtro de celulose (diâmetro de 9 cm) em trimestres. Resumidamente submergir quarto em 100% de etanol, e, em seguida, transferir cuidadosamente uma colónia flutuante biofilme sobre ele. Colocar o papel de filtro molhado numa placa de Petri forradas com papel de filtro. Cubra o prato Petri e deixar as colônias biofilme secar durante a noite em uma capa química. </li></ol></li><li> Para o ponto crítico (CP) -drying usando dióxido de carbono (CO2) como o fluido de transição: <ol><li> Encher 75% da câmara de máquina de ponto crítico de secagem com 100% de etanol. Transferir as amostras em um suporte, cada amostra em seu próprio cHamber. Se necessário, cortar o biofilme com uma tesoura em pedaços menores. Deixar as amostras submersas em etanol durante todas as manipulações. Em seguida, transferir o suporte para dentro da câmara e fecha hermeticamente a câmara. </li><li> Arrefece-se a câmara até 7 ° C e começar a agitar. Encha a câmara completamente com o CO 2 líquido. Durante um período de incubação de 7 min, deixar a mistura de etanol com o CO 2. Em seguida, de descarga 25% da solução. NOTA: Não esvazie a câmara abaixo do nível da amostra. </li><li> Repita o passo 3.8.2.2 quatro vezes. </li><li> Repita o passo 3.8.2.2 cinco vezes com um tempo de incubação de apenas 5 min. Finalmente, o etanol deve ser completamente substituída por CO 2. </li><li> Durante a última rodada, vazio apenas 5% da câmara. Desligue a agitação e o arrefecimento. Iniciar o aquecimento da câmara até 42 ° C. A uma temperatura de 31,1 ° C e uma pressão de 73,9 bar, o CO2 líquido atinge o seu ponto crítico, o estado em que o pH gasosoase tem a mesma densidade que a fase líquida do solvente 27. Uma vez que a temperatura atinge 42 ° C, incubar durante 10 min. A 42 ° C, o CO 2 na câmara existe como gás supercrítico. NOTA: Verifique constantemente a pressão da câmara. A pressão não deve ser superior a 120 bar, a 42 ° C. </li><li> Começar a liberar lentamente o gás com aquecimento contínuo. Isto mantém as amostras na fase CO2 -gas e impede a deformação da morfologia da amostra através da tensão superficial do líquido. Defina o medidor de vazão para 5 L / hr por ajuste fino da válvula de medição de controle do medidor de vazão. Aguardar até que a toda a pressão na câmara é libertado. Agora abra a câmara e retire as amostras cuidadosamente do suporte. </li></ol></li></ol></li><li> Brasão de microscopia eletrônica de stub com fita de carbono. Com a ajuda de uma pinça, transferir cuidadosamente as colônias biofilme para o topo. Ligue cada colônia para o stub adicionando uma ponte fina de carrofita bon, que é crucial para a eliminação de carga sob o feixe de elétrons. Nesta fase, lidar com as colônias biofilme com cuidado, pois eles são muito frágeis. Armazenar as amostras num exsicador durante pelo menos 24 h ou até à sua análise. </li><li> No dia do exame com o microscópio eletrônico de varredura, por pulverização catódica-coat as colônias biofilme para 2 min em um ângulo de 60 ° em um ouro-paládio sputter-coater. Repita esta etapa duas vezes e girar as amostras em 120 ° no meio. No final, sputter-revestir as amostras uma vez durante 3 minutos a partir do topo. A fina camada de 20 nm de ouro-paládio melhora a condutividade e melhora o contraste da amostra para a imagem no SEM. </li><li> Armazenar as amostras em um dessecador para evitar a re-hidratação da amostra de 28 até imagiologia com um microscópio eletrônico de varredura 29,30. </li></ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Bacillus subtilis formas robustas e altamente estruturados biofilmes ambos no estado líquido (películas) e em meio sólido (colônias). Por isso, serve como um organismo modelo ideal para a caracterização do modo de acção dos inibidores específicos de biofilme. Em meio sólido, as células formam estruturas multicelulares com características distintas que não são evidentes em películas, como rugas que irradiam do centro para a borda. Assim, películas e colônias são sistemas complementares para estudar B. m...

comunidades bacterianas multi-celulares desempenham papéis importantes em ambientes naturais e antropogênicas, e pode ser benéfica ou altamente prejudicial. Estas colónias multi-celulares são conhecidos como biofilmes, em que as células individuais são embutidos em um (EPS) de matriz extracelular substâncias poliméricas auto-produzido. Os EPS aderir fortemente as células à superfície, eles colonizam. Eles servem como um escudo contra as forças mecânicas e químicas e criar contacto próximo entre as células vizinhas, facilitando a comunicação celular 1. Um biofilme pode ser visto como uma comunidade diferenciada, em que as células usam altamente regulado, orquestrada processos para coordenar as suas actividades no seio da comunidade, bem como entre espécies 2-5. A transição de uma planctônicas, o modo de vida livre do crescimento a um estado de biofilme é frequentemente associada com os processos de desenvolvimento. Um bom exemplo é o Bacillus subtilis bactéria do solo Gram-positivas, e, portanto, uma undomeestirpe sticated serve como um organismo modelo robusto para estudar os estágios de desenvolvimento que conduzem a formação de biofilme. Nesta bactéria, células móveis se organizam em estruturas multicelulares conspícuos que realizam tarefas especializadas 4. Um grupo de células, a matriz-produtores secretam exopolissacáridos 6, a proteína amilóide tasa 7,8, e a proteína de hidrofobicidade da superfície BslA 9,10; todos os que participam da montagem dos EPS 11-13. Dada a abundância de biofilmes em nichos naturais e antrópicos e os danos fatais putativo eles podem causar, há uma necessidade premente de encontrar formas de prevenir a sua formação. inibidores de moléculas pequenas podem auxiliar na descoberta de novas vias reguladoras, enzimas e proteínas estruturais envolvidas na formação de biofilme, e, assim, promover insights os complexos processos de montagem comunidade multicelular. Como B. subtilis é um modelo bem estudado para bioformação de película 14,15, ele pode ser usado para avaliar os efeitos de vários inibidores de biofilme. Este estudo aborda quatro métodos fundamentais que são a chave para avaliar a resposta de biofilmes a inibidores de pequenas moléculas. Em primeiro lugar, para assegurar que estes inibidores têm um alvo específico do biofilme, a separação do efeito sobre o crescimento planctônicas de o efeito sobre a formação de biofilme é crítica. A maioria dos agentes antibacterianos como alvo as células em sua fase de crescimento planctônicas, mas as moléculas que têm como alvo o estilo de vida biofilme são raros. Além disso, como as moléculas que não afectam o crescimento planctônicas não são tóxicos, podem reduzir a pressão selectiva favorecendo mutantes resistentes a antibióticos 16. Por exemplo, quando biofilmes são tratados com D-aminoácidos ou determinadas outras moléculas interferentes da parede celular, eles são ou perturbada ou desmontado, mas estes inibidores apenas afectam moderadamente 12,17 crescimento planctônicas. Em contraste, muitos antibióticos prejudicar drasticamente o crescimento planctônicas, com little ou nenhum efeito sobre a formação de biofilme 17. Em segundo lugar, que estabelece um quadro experimental consistente e robusta para estudar o efeito de as moléculas pequenas é crucial. Observou-se que o intervalo de concentração activa de inibidores de moléculas pequenas era sensível às condições de pré-cultura e para a instalação experimental utilizada para estudar o efeito destes inibidores de moléculas pequenas. Vários relatórios, particularmente aqueles que estudam B. subtilis, revelou variações no intervalo de concentrações em que D-aminoácidos inibem a formação de películas - as flutuantes biofilmes bacterianas 12,17-19. Os resultados aqui apresentados sugerem que os seguintes fatores em conta as diferenças na faixa de concentração ativa: as condições pré-cultura (logarítmica 12,17 ante fase de 20 crescimento tardio-estacionária), o meio de crescimento utilizada na condição de pré-cultura (rico, indefinido [Caldo de Luria, LB] versus definido [glutamato monossódico-glicerol, MSgg]), a proporção da inoculação e, especialmente, a remoção do meio de pré-cultura antes da inoculação. A temperatura de crescimento da película estática mostrou um papel menos importante na gama do inibidor de molécula pequena de D-leucina, uma D-aminoácido representativa utilizada neste estudo a actividade. Finalmente, uma vez que os biofilmes são tratados com inibidores específicos de biofilme, métodos robustos e informativas são necessários para caracterizar os efeitos destes inibidores sobre a aptidão do biofilme. Aqui, dois métodos para caracterizar de forma independente do efeito de inibidores de moléculas pequenas são descritos em detalhe: (1) O efeito sobre as células individuais dentro de uma colónia de biofilme e a sua resistência a agentes antimicrobianos. As células em biofilmes são tipicamente mais resistentes a antibióticos quando comparado com as bactérias de vida livre 21-23. Embora este fenómeno é multifactorial, a capacidade do EPS para reduzir a penetração de antibiótico foi muitas vezes considerado como uma explicação atraente 24 </sup&gt;. Este método avalia a sobrevivência de células do biofilme pré-estabelecido após a exposição a substâncias antibacterianas. (2) O efeito sobre a arquitectura do biofilme colónia, a partir da grande para a pequena escala. colónias de biofilme são caracterizados pela sua estrutura tridimensional e a presença do EPS. Utilizando microscopia eletrônica de varredura, as alterações na morfologia celular, estrutura da colônia de biofilme e a arquitetura e abundância das EPS pode ser visualizado a partir do grande (mm) para a pequena escala (mm).

<table><tbody><tr><td>Caldo Luria, Lennox</td><td>Difco</td><td>240230</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>Difco</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>fosfato de potássio monobásico&nbsp;</td><td>Sigma, 136,09 g/mol</td><td>P0662-500G</td><td></td></tr><tr><td>fosfato de potássio dibásico&nbsp;</td><td>Fisher Scientific, 174,18 g/mol</td><td>BP363-1</td><td></td></tr><tr><td>3-(N-morfolino)ácido propanossulfônico</td><td>Fisher Scientific, 209,27 g/mol</td><td>BP308-500</td><td></td></tr><tr><td>cloreto de magnésio hexahidratado&nbsp;</td><td>Merck, 203,30 g/mol&nbsp;</td><td>1,05833,0250</td><td></td></tr><tr><td>cloreto de cálcio anidro</td><td>J.T. Baker, 110,98 g/mol</td><td>1311-01</td><td></td></tr><tr><td>cloreto de manganês (II) tetrahidratado</td><td>Sigma, 197,91 g/mol</td><td>31422-250G-R</td><td></td></tr><tr><td>cloreto de ferro (III) hexahidratado&nbsp;</td><td>Sigma, 270.30 g/mês)</td><td>F2877-500G</td><td></td></tr><tr><td>cloreto de zinco anidro&nbsp;</td><td>Acros Organics, 136,29 g/mol</td><td>424592500</td><td></td></tr><tr><td>cloridrato de tiamina</td><td>Sigma, 337,27 g/mol</td><td>T1270-100G</td><td></td></tr><tr><td>L-triptofano</td><td>Fisher Scientific, 204,1 g/mol</td><td>BP395-100</td><td></td></tr><tr><td>L-fenilalanina</td><td>Sigma, 165,19 g/mol</td><td>P5482-100G</td><td></td></tr><tr><td>L-treonina</td><td>Sigma, 119,12 g/mol</td><td>T8625-100G</td><td></td></tr><tr><td>glicerol anidro</td><td>Bio-Lab Itd</td><td>712022300</td><td></td></tr><tr><td>Sais monossódicos de ácido L-glutâmico hidratam&nbsp;</td><td>Sigma, 169,11 g/mol</td><td>G1626-1KG</td><td></td></tr><tr><td>D-leucina</td><td>Sigma, 169,11 g/mol</td><td>855448-10G</td><td></td></tr><tr><td>etanol anidro</td><td>Gadot</td><td>830000054</td><td></td></tr><tr><td>lâmina de barbear</td><td></td> Papéis de filtro de celulose <td>circular Eddison</td> NA <td></td></tr><tr><td></td><td>Whatman, 90 mm</td><td>1001-090</td><td></td></tr><tr><td>glutaraldeído</td><td>EMS (Electron Micoscopy Science), 25% em água</td><td>16220</td><td></td></tr><tr><td>paraformaldeído&nbsp;</td><td>EMS, 16% em água</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>cacodilato de sódio</td><td>Merck, 214,05 g/mol&nbsp;</td><td>8.2067</td><td></td></tr><tr><td>cloreto de cálcio 2-hidrato</td><td>Merck, 147.02 g/mol&nbsp;</td><td></td><td></td>1172113</tr><tr><td>montagem em alumínio</td><td>EMS, cabeça ranhurada</td><td>75230</td><td></td></tr><tr><td>fita adesiva de carbono</td><td>EMS</td><td>77825-12</td><td></td></tr><tr><td>Shaker 37 &deg; C</td><td>New Brunswick Scientific Innowa42</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>de mesa Eppendorf 5424</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Sonifier digital, Modelo 250, usada com Incubadora Microtip</td><td></td><td>Branson NA</td><td></td>Double Step</tr><tr><td>30 &deg; C</td><td>Binder</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora 23 &deg; Sistema</td> de Filtro C <td>Binder</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>, 500 ml, poliestireno</td><td>Cornig Incorporated</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Agitador Rotativo - Orbitron Rotatory II</td><td>Boekel</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>S150 Revestidor de Sputter&nbsp;</td><td>Edwards</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>CPD 030 Secador de Ponto Crítico</td><td>BAL-TEC</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio Eletrônico de Varredura Ambiental</td><td>XL30 ESEM FEG Philips (FEI)</td><td>NA</td><td></td></tr></tbody></table>

metodologias para o estudo<em&gt; b. subtilis</em&gt; os biofilmes como um modelo para a caracterização de pequena molécula biofilme inibidores

Methodologies for Studying B. subtilis Biofilms as a Model for Characterizing Small Molecule Biofilm Inhibitors

Este trabalho avalia diferentes metodologias para estudar o impacto de inibidores de biofilme de pequenas moléculas, como os D-aminoácidos, no desenvolvimento e resiliência de biofilmes de Bacillus subtilis. Primeiro, são apresentados métodos que selecionam inibidores de pequenas moléculas com alvos específicos de biofilme, a fim de separar o efeito dos inibidores de pequenas moléculas no crescimento planctônico de seu efeito na formação de biofilme. Em seguida, nos concentramos em como as condições de inoculação afetam a sensibilidade de culturas multicelulares flutuantes de B. subtilis a inibidores de pequenas moléculas. Os resultados sugerem que as discrepâncias nos efeitos relatados de tais inibidores, como os D-aminoácidos, são devidas a condições inconsistentes de pré-cultivo. Além disso, um protocolo recentemente desenvolvido é descrito para avaliar a contribuição de tratamentos com pequenas moléculas para a resistência do biofilme a substâncias antibacterianas. Por fim, técnicas de microscopia eletrônica de varredura (MEV) são apresentadas para analisar o arranjo espacial tridimensional das células e sua matriz extracelular circundante em um biofilme de B. subtilis. O SEM facilita a percepção da arquitetura tridimensional do biofilme e da textura da matriz. Uma combinação dos métodos descritos aqui pode auxiliar muito no estudo do desenvolvimento do biofilme na presença e ausência de inibidores de biofilme e lançar luz sobre o mecanismo de ação desses inibidores.

O ensaio de película é um método para estudar os processos altamente regulados e dinâmicas de B. multicelularidade subtilis. Além disso, o ensaio de película é adequado para testar uma gama de condições, quer pré-inicial ou concentrações de moléculas pequenas em uma placa de cultura de células multidish único numa experiência. No entanto, B. subtilis formação de película é sensível às condições de pré-cultura (por exemplo, o meio de crescimento de pré-cultura e da sua fase de crescime...

Este estudo apresenta o desenvolvimento de metodologias reprodutíveis para estudar inibidores de biofilme e seus efeitos sobre a multicelularidade de Bacillus subtilis.

Metodologias para o estudo<em&gt; B. subtilis</em&gt; Os biofilmes como um modelo para a caracterização de pequena molécula biofilme Inibidores

This work assesses different methodologies to study the impact of small molecule biofilm inhibitors, such as D-amino acids, on the development and ...

Os biofilmes bacterianos são importantes para a saúde humana, protegendo as bactérias residentes contra agressões ambientais e agentes antimicrobianos. O objetivo deste procedimento foi desenvolver um sistema modelo para avaliar os efeitos de inibidores de moléculas pequenas na formação de biofilmes. Esses métodos podem ajudar a estabelecer um conjunto de ferramentas essencial para a área de biofilmes, a fim de selecionar inibidores de moléculas pequenas que tenham como alvo específico a formação de biofilmes.A principal vantagem dessas metodologias é que elas partem de uma estrutura experimental consistente e robusta, e fornecem informações quantitativas e qualitativas sobre o mecanismo de ação de inibidores específicos de biofilmes. Embora esses métodos possam oferecer insights sobre biofilmes de Bacillus subtilis, eles também podem ser aplicados a outras bactérias formadoras de biofilmes, como Pseudomonas aeruginosa ou a fitopatógena Xanthomonas citri. A microscopia eletrônica de varredura pode ser essencial para analisar o efeito de moléculas pequenas na formação de biofilmes, pois permite a observação da matriz extracelular e fornece resolução em nível de célula individual.Para começar, selecione primeiramente uma colônia simples apropriada e transfira-a para três mililitros de caldo LB. Coloque esta cultura inicial em um incubador com agitação durante quatro horas a 37 graus Celsius. Após a incubação, retire 1,5 mililitro da cultura inicial e centrifugue por quatro minutos.Remova cuidadosamente o sobrenadante e, em seguida, re-suspenda o pellet em 1,5 mililitros de meio MSgg. Para cultivar películas, prepare uma placa de cultura celular de 12 poços adicionando três mililitros de MSgg a cada poço. Em alguns desses poços, adicione MSgg com um inibidor de molécula pequena em uma faixa de concentração, distribuindo as localizações das diferentes concentrações ao redor da placa, para evitar efeitos de borda.Meça a densidade óptica a 600 nanômetros da cultura inicial re-suspensa. A cultura deve estar entre 0,6 e 1,0. Isso é crítico para a robustez do sistema.Inocule cada poço da placa de cultura com 3 microlitros da cultura inicial re-suspensa. Em seguida, incube a placa a 23 graus Celsius por três dias em condições estáticas. Depois, remova a placa do incubador e observe as películas.Para cultivar biofilmes, utilize um molde e distribua simetricamente quatro gotas separadas de 1,5 microlitros de cultura inicial não lavada sobre uma placa de 8,5 centímetros com ágar MSgg seco a 1,5%. Deixe as gotas serem absorvidas pelo meio antes de mover a placa. Incube as placas a 30 graus Celsius por três dias.Usando um binóculo com exposição homogênea de iluminação, verifique se as colônias de biofilme se desenvolveram e formaram uma estrutura tridimensional enrugada. Primeiro, pegue uma lâmina de barbear limpa e corte as colônias de biofilme em duas partes iguais com a ajuda do molde. Levante cuidadosamente uma metade da colônia com uma espátula limpa e transfira-a para um tubo microcentrífugo de 1,5 mililitro, contendo 500 microlitros de PBS.Retire a segunda metade da colônia e transfira-a para um tubo de microcentrífuga contendo 500 microlitros de etanol a 50%. Estes serão utilizados para avaliar a resistência a agentes esterilizantes. Posteriormente, retire da mesma forma a primeira metade da colônia tratada com D-lisina e coloque-a em PBS.Em seguida, pegue a segunda metade dessa colônia e transfira-a para etanol. Incube todos os tubos contendo as metades do biofilme por 10 minutos à temperatura ambiente. Em seguida, centrifugue-os por cinco minutos a 18.000 × g.Usando uma pipeta, remova cuidadosamente o sobrenadante. Adicione 300 microlitros de PBS e, em seguida, sonique as células em uma configuração baixa, com um sonicador de microponta. Adicione mais 700 microlitros de PBS para obter um volume final de um mililitro.Em seguida, realize uma diluição seriada de 10 elevado a menos sete em PBS. Transfira 100 microlitros de uma das diluições e inocule uma placa de ágar LB a 1,5%. Repita este passo para mais duas diluições por amostra.Espalhe o inóculo utilizando esferas de vidro e, em seguida, incube as placas durante a noite a 30 graus Celsius. Examine as placas e conte as unidades formadoras de colônia, ou UFC. Após calcular o valor de UFC por mililitro, determine a porcentagem de sobreviventes nos tratamentos com PBS e etanol.Para iniciar a fixação da amostra, prepare primeiro uma quantidade suficiente de solução fixadora fresca para o número desejado de colônias de biofilme. Adicione cuidadosamente cinco mililitros de fixador a cada placa de Petri, evitando pipetar diretamente sobre as colônias. As colônias começarão a se desprender do ágar e a flutuar.Selar cuidadosamente as placas com parafilm e incubar em agitador rotatório durante duas horas à temperatura ambiente. Transferir as placas para armazenamento a quatro graus Celsius durante a noite. Remover suavemente o líquido fixador com uma pipeta de Pasteur conectada a um vácuo.Adicione 10 mililitros de cacodilato de sódio 100 nanomolar, tampão de cloreto de cálcio 5 milimolar para lavar o biofilme e incube por cinco minutos. Remova cuidadosamente o centro da colônia de biofilme da placa de ágar com uma pipeta de Pasteur. Para secar as colônias ao ar, corte o papel filtro de celulose em quatro partes iguais e, em seguida, mergulhe uma seção em etanol 100%.Transfira cuidadosamente uma colônia de biofilme flutuante para o papel. Coloque o papel em uma placa de Petri forrada com papel de filtro seco. Em seguida, tampe a placa e deixe-a em um capuz químico para secar durante a noite.Para preservar a morfologia da colônia de biofilme, é importante cobrir completamente o biofilme flutuante com o papel de celulose. Uma vez no papel, o biofilme não pode ser reajustado. Revesta um suporte para microscopia eletrônica com fita de carbono e, em seguida, use pinças para transferir cuidadosamente as colônias de biofilme para o suporte.Após conectar cada colônia ao suporte, adicionando uma fina ponte de fita de carbono, armazene os suportes em um dessecador por 24 horas ou até o momento de uso. Esta etapa exige uma mão firme e precisa, pois, nesta fase, os biofilmes são muito frágeis e se rompem facilmente. O desafio consiste em montar uma parte substancial do biofilme sem rachaduras.No dia do exame, coloque as colônias em um revestidor por pulverização catódica de ouro-paládio. Revesta as amostras por dois minutos em um ângulo de 60 graus. Repita este passo duas vezes, rotacionando as amostras em 120 graus entre cada etapa.Por fim, cubra as amostras uma vez por três minutos a partir da parte superior. As amostras estão agora prontas para serem analisadas no MEV. Essas imagens mostram a formação de película de B. subtilis cultivado em meio MSgg indutor de biofilme.Com a adição do inibidor de molécula pequena D-lisina, o desenvolvimento da película é reduzido. E à medida que a concentração do inibidor aumenta, a formação da película apresenta uma diminuição correspondente. Este gráfico mostra o efeito da exposição ao etanol na sobrevivência de células dentro de colônias de biofilme, tratadas com um inibidor de D-lisina ou deixadas sem tratamento.Colônias tratadas com D-lisina e expostas ao etanol a 50% por 10 minutos apresentaram uma redução acentuada na sobrevivência em comparação com a fração não tratada. Imagens binoculares de cima para baixo mostram que as colônias cultivadas na presença de D-lisina foram menores no geral e formaram rugas menos acentuadas do que aquelas deixadas sem tratamento. Imagens de microscopia eletrônica de varredura de colônias de biofilme secas por ponto crítico revelam ainda mais os alterações no desenvolvimento do biofilme.A matriz de substâncias poliméricas extracelulares, ou EPS, parecia mais com uma teia de aranha em amostras não tratadas, enquanto as amostras tratadas apresentavam menor organização. Por fim, o exame com resolução em nível de células bacterianas individuais mostra que as células tratadas apresentam aparência alongada, são menos recobertas por EPS e não estão tão firmemente conectadas aos seus vizinhos quanto as células não tratadas. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar que estabelecer um arcabouço consistente para o estudo de inibidores de biofilme é essencial para obter resultados reprodutíveis.Uma vez dominado, um ensaio de triagem de moléculas de pequeno porte para inibição de biofilme pode ser realizado em menos de uma semana, se for executado corretamente. Após este procedimento, outros métodos, como a investigação da expressão gênica em células individuais de biofilme, podem ser realizados para obter informações adicionais sobre o alvo do inibidor de molécula pequena. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como analisar o efeito geral de inibidores específicos de biofilme sobre o desenvolvimento do biofilme e a resistência a antibióticos.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Fonte: Tay, S. B., et al. Perturbação Antivirulenta de Biofilmes Patogênicos usando lactonases modificadas para apagamento do quórum.  J. Vis. Exp. (2016)O vídeo demonstra um método para quantificar a biomassa de biofilme em uma bactéria patogênica, comparando controles não tratados com amostras tratadas com uma enzima que apaga quórum. A enzima interrompe a sinalização bacteriana durante a incubação inicial, reduzindo a adesão celular. Após lavagem e incubação adicional, poços de controle...

Quantificação da Supressão de Biofilme Induzida por Enzimas em Bactérias Patógenas

Fonte: Tay, S. B., et.al. Perturbação Antivirulenta de Biofilmes Patogênicos usando lactonases modificadas para apagamento do quórum.  J. Vis. Exp. (2016)Este vídeo demonstra o processo de inibição da formação de biofilmes ao introduzir uma enzima que interrompe a sinalização celular bacteriana. A enzima impede que as bactérias produzam substâncias poliméricas extracelulares, reduzindo assim o desenvolvimento de biofilmes em um microprato com fundo de vidro. Por fim, a estrutura do biofilme é...

Avaliação Microscópica da Inibição Mediada por Enzimas na Formação de Biofilmes

Fonte: Bucher, T., et al. Metodologias para Estudo de Biofilmes de B. subtilis como modelo para caracterização de inibidores de biofilmes de pequenas moléculas. J. Vis. Exp. (2016)Este vídeo demonstra um ensaio de formação de película usando Bacillus subtilis para avaliar inibidores de pequenas moléculas que interrompem a síntese de matriz e o desenvolvimento de biofilmes, fornecendo um modelo para triagem de compostos que inibem seletivamente o crescimento associado à superfície sem afetar...

Avaliação dos Efeitos Inibidores na Formação de Películas em Bacillus subtilis

Fonte: Bucher, T., et al. Metodologias para Estudo de Biofilmes de B. subtilis como modelo para caracterização de inibidores de biofilmes de pequenas moléculas. J. Vis. Exp. (2016).Este vídeo demonstra como a integridade da matriz de biofilmes influencia a resistência bacteriana ao etanol, comparando unidades formadoras de colônias em biofilmes não tratados e com inibidores interrompidos. A redução das UFCs em amostras tratadas com inibidores demonstra que a matriz extracelular é essencial para...

Ensaio de Resistência ao Etanol para Avaliar a Integridade da Matriz de Biofilme

Fonte: Bucher, T., et. al., Metodologias para Estudo de Biofilmes de B. subtilis como Modelo para Caracterização de Inibidores de Biofilmes de Pequenas Moléculas. J. Vis. Exp.(2016)Este vídeo demonstra a preparação de colônias maduras de biofilme bacteriano para imagens de alta resolução. Ele cobre etapas de fixação, desidratação, montagem e revestimento metálico para preservar e visualizar a morfologia do biofilme.

Preparação de Colônias de Biofilmes Bacterianos para Análise Morfológica

As enzimas de extinção de quórum são opções antivirulentas e antibacterianas que podem mitigar a patogênese sem risco de incorrer em resistência, impedindo a expressão de fatores de virulência e genes associados à resistência a antibióticos e à formação de biofilme. Neste estudo, relatamos um método que demonstra a eficácia das enzimas de extinção de quorum na ruptura do biofilme bacteriano.

Perturbação Anti-virulenta de patogênicos biofilmes usando Engineered Quorum para saciar a Lactonases

A maioria das infecções bacterianas produz um biofilme. Em virtude de seu ambiente, as bactérias associadas ao biofilme são frequentemente fenotipicamente resistentes a medicamentos. Novas moléculas antibacterianas que matam bactérias em biofilmes são, portanto, uma alta prioridade. Estabelecemos um ensaio para rastrear rapidamente compostos antimicrobianos que são eficazes na erradicação de biofilmes.

Segmentação de biofilme Associated<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; Usando resazurina Baseado Ensaio Drogas susceptibilidade

As infecções por biofilme mostram alta tolerância à quimioterapia. Nenhum ensaio captura a complexidade dos biofilmes. Em vez disso, são necessários ensaios complementares. Apresentamos uma plataforma de triagem (desenvolvida para S. aureus) que combina ensaios de viabilidade, biomassa e matriz de biofilme. Permite a descoberta de medicamentos anti-biofilme, incluindo a avaliação dos efeitos quimioterápicos a longo prazo.

A Plataforma de Ensaios Anti-biofilme adequado para a Exploração de bibliotecas de compostos naturais

Os produtos naturais representam pontos de partida promissores para o desenvolvimento de novas drogas e agentes terapêuticos. No entanto, devido à alta diversidade química, encontrar novos compostos terapêuticos das plantas é uma tarefa desafiadora e demorada. Descrevemos uma abordagem simplificada para identificar moléculas antimicrobianas e antibiofilmes a partir de extratos e frações vegetais.

Abordagem Sistemática para Identificar Novas Moléculas antimicrobianas e antibiofilmes de extratos e frações de plantas para prevenir cárie dentária

Este protocolo apresenta metodologia para realizar o crescimento de biofilmes e medições de biomassa utilizando dispositivos de placa PCR de poço profundo auto-montados para triagem de biofilme de tampa estática de alta produtividade de 96 bem-equipados.

Geração de maior biomassa de biofilme bacteriano usando dispositivos microplacas de poço profundo pcr-placa

Este protocolo descreve uma abordagem que combina métodos estáticos e dinâmicos para avaliar a eficácia de peroxiácidos orgânicos para erradicar biofilmes na indústria de laticínios. Esta abordagem também pode ser usada para testar a eficácia de novas formulações biológicas ou químicas para o controle de biofilmes.

Avaliação da Eficácia dos Perácidos Orgânicos na Erradicação de Biofilmes Laticínios Usando uma Abordagem Combinando Métodos Estáticos e Dinâmicos

Aprenda metodologias reprodutíveis para estudar inibidores de biofilmes em Bacillus subtilis. Este protocolo fornece insights quantitativos e qualitativos sobre mecanismos de ação de inibidores específicos.

Metodologias para o estudo B. subtilis Os biofilmes como um modelo para a caracterização de pequena molécula biofilme Inibidores (Vídeo) | JoVE Journal

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