Difusão molecular em membranas plasmáticas de linfócitos primários medida por fluorescência Correlation Spectroscopy

O objetivo geral deste protocolo é medir a taxa de difusão de uma proteína marcada nas membranas das células imunes primárias usando espectroscopia de correlação de fluorescência. Este método pode ajudar a identificar questões-chave nos campos da imunologia e da biologia celular, como a identificação de células natural killer com uma dinâmica de receptor de membrana mais ativa. A principal vantagem dessa técnica é que ela é usada com células vivas, por isso reflete com precisão o estado natural de como as moléculas se movem.

As implicações desta técnica se estendem à imunoterapia do câncer se diferentes características das células assassinas naturais, como a difusão molecular, estiverem ligadas à sua função de que a eficiência pode ser melhor prevista. Embora esse método possa fornecer informações sobre o movimento molecular em células imunológicas, ele também pode ser aplicado a outras células primárias e linhagens celulares em qualquer disciplina. Abra o software no modo especialista, com a opção Digitalizar novas imagens selecionada.

Selecione a lente objetiva de água 40X no microscópio confocal de varredura a laser. Na guia Adquirir, pressione os botões Config e Scan para abrir o Controle de Configuração e o Controle de Verificação. Na guia ConfoCor, pressione Medir para abrir a janela Medição.

Em seguida, crie uma pasta para salvar as medidas FCS. Inicie um novo banco de dados de imagens clicando em Novo na guia Arquivo. Ligue a lâmpada halógena.

Usando o botão Laser, ligue os lasers relevantes para excitar os fluoróforos. Em seguida, especifique as configurações para captura de imagem na janela Controle de configuração. Isso inclui o laser de excitação, filtros de excitação e emissão, caminho de luz e detectores em uso.

Da mesma forma, vá para a janela Medição e ajuste as configurações do FCS na guia Configuração do sistema. Ative os canais de detecção para as gravações do FCS alternando o canal verde e o canal 2 para o canal vermelho. Enquanto o laser se estabiliza, o que pode levar até 30 minutos, ajuste o orifício.

Primeiro, coloque uma gota de 50 microlitros de corante centralmente em um poço de uma lâmina de lamínula com câmara de oito poços revestida com poli-L-lisina. Os poços adjacentes são usados para fazer medições de células, pois a calibração depende do slide. Coloque uma gota de água destilada na lente objetiva de água 40X e posicione a lâmina.

Em seguida, pressione Vis para selecionar a fonte de luz visível e focar na posição central da gota de fluoróforo. Na janela Medição do software, selecione a guia Aquisição e, em Posições, alterne a posição atual. Em seguida, retorne à guia Configuração do sistema na mesma janela e defina uma potência alta ou de saturação para o laser verde.

Para testar a estabilidade do sinal, pressione Iniciar para abrir uma nova janela exibindo o Traço de tempo e a curva de correlação automática. Verifique se o sinal fluorescente está alto, estável e se o eixo y mostra flutuação na faixa de kilohertz. Valores mais baixos podem ser devidos a foco impreciso ou degradação do corante.

Em seguida, na janela Medição, selecione o botão O Ajustar. Em seguida, selecione o canal de detecção correto e pressione Ajuste automático X.Se o limite superior da curva resultante estiver ausente ou não centralizado, marque a opção Grosso e pressione Ajuste automático X novamente. Depois de ajustar a direção X, faça o mesmo para a direção Y pressionando Ajuste automático Y.Desmarque Grosso e alterne entre ajustar X e Y pressionando Ajuste automático até que ambos tenham valores máximos e estáveis claros.

Se as células forem marcadas por dois fluoróforos diferentes, adicione uma gota de solução de fluoróforo vermelho a uma câmara adjacente. Em seguida, calibre o segundo canal. Defina o laser vermelho para uma potência alta e repita o procedimento de calibração de estabilidade.

Em seguida, medimos o tempo de trânsito de fluoróforos de difusão livre através do foco. E usamos o estágio para calcular a área da membrana celular que está dentro do foco. Para começar, concentre-se em uma gota de solução executando cuidadosamente o procedimento de ajuste.

Em seguida, vá para a guia Aquisição na janela Medição e defina o tempo de aquisição para 30 segundos com três repetições. Defina a potência do laser para quase saturação e pressione Iniciar para fazer uma medição. Registre as contagens por molécula ou CPM após a conclusão da medição.

Em seguida, faça novas medições fazendo reduções iterativas na potência do laser. Dentro dessa faixa de potência, inclua a potência esperada das próximas medições de células. Em seguida, verifique se os valores de CPM são dimensionados linearmente com a potência do laser.

Desde que o resto da escala seja linear, a saturação na potência mais alta é aceitável. Na primeira vez que um anticorpo fluorescente recém-conjugado for usado, realize uma medição FCS de anticorpos de difusão livre para quantificar o CPM esperado. E é importante usar poços revestidos com PEG Poli-L-Lisina para anticorpos livres.

Para este procedimento, revestir uma lâmina com câmara com 200 microlitros de Poli-L-Lisina enxertada em polietilenoglicol. Deixe a solução aderir por uma hora em temperatura ambiente. A solução de estoque pode ser refrigerada por até duas semanas.

E o caldo de pó deve ser armazenado no freezer. Mais tarde, remova o líquido e deixe a câmara secar ao ar. Ao microscópio, diluir o anticorpo em PBS entre um e 10 microgramas por mililitro.

Prossiga para medir o tempo de trânsito de anticorpos livres conforme descrito na seção anterior para fluoróforos livres. Para fazer a medição em uma célula, adicione 125 microlitros de células em PBS mais 1% FCS da suspensão celular marcada com anticorpos. E 150 microlitros de Roswell Park Memorial Institute Medium 1640 transparente em um poço vazio na lâmina de vidro revestida com PLL.

Deixe as células incubarem no escuro à temperatura de medição por pelo menos 20 minutos antes de prosseguir, para que as células possam se fixar e se equilibrar. Inicie a imagem com varreduras XY rápidas para encontrar a menor potência de laser possível necessária para visualizar as células. Em seguida, centralize a imagem em uma célula redonda de brilho médio, onde a membrana está claramente definida.

É crucial que não haja sinal fluorescente no citoplasma. Aumente o zoom até que a célula cubra a maior parte da imagem. Em seguida, concentre-se na parte superior da membrana celular.

Comece no centro da célula e suba até que o centro da imagem mostre uma pequena área redonda com fluorescência uniforme. A colocação cuidadosa do foco é crucial. Se o foco não estiver na membrana, a fluorescência detectada não virá dos receptores de membrana marcados com fluorescência.

E, portanto, os resultados não refletirão seu comportamento. Agora, na guia Aquisição da janela Medição, selecione uma posição para medição FCS ativando a mira. Em seguida, defina o número de repetições entre seis e 10 e defina o Tempo de medição para 10 segundos por repetição.

Agora retorne à guia Configuração do sistema da janela Medição e diminua a potência do laser para medições FCS para entre um e 10 microwatts. Em seguida, pressione Iniciar. Se o traço de intensidade cair mais de 30% durante os primeiros 10 segundos, a célula foi branqueada demais e outra célula deve ser medida com uma potência menor.

Se o sinal for perdido, ajuste o foco na direção Z e reinicie a medição. Após a conclusão da medição, verifique se a célula ainda está centralizada na janela de controle de varredura para ter certeza de que sua membrana foi medida. Se a célula se moveu, descarte os dados.

Agora vá para a janela Correlação automática e exclua manualmente as repetições individuais que contêm manobras de zoom, branqueamento, grandes clusters ou outros artefatos. Clique com o botão direito do mouse e selecione Excluir para remover os artefatos. Selecionar os artefatos reais requer prática.

A remoção de repetições é um processo simples, mas as repetições precisam ser avaliadas corretamente para saber o que deve ser removido e o que não deve. Em seguida, salve o arquivo final no formato FCS. Mantenha apenas as células que tenham pelo menos quatro repetições restantes após a remoção dos artefatos para análise posterior.

Uma curva de correlação automática típica do receptor de membrana é suave e tem um tempo de trânsito na faixa de 10 a 400 milissegundos. Defina os domínios de ajuste para que o início e o fim da parte inclinada mais íngreme, representando a difusão, sejam representados. Usando um modelo de difusão livre em duas dimensões para ajustar os dados, preste atenção à parte mais inclinada da curva.

Pequenas flutuações em ou em torno de um segundo na escala tau, vistas no residual, são aceitáveis. Se a curva se ajustar mal, mas a célula não tiver problemas aparentes, como movimento, branqueamento ou aglomerados, os valores iniciais ou os limites superior e inferior do modelo provavelmente precisarão ser alterados. Quando o modelo se ajustar bem à curva de correlação automática, extraia os valores dos parâmetros variáveis.

O número de moléculas pode variar entre 0,5 a cerca de 200 por mícron quadrado para proteínas expressas endogenamente. Verifique se o valor CPM da medição da célula é pelo menos 33% do registrado de anticorpos que se difundem livremente. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como medir a taxa de difusão de proteínas usando espectroscopia de correlação fluorescente.

Uma vez dominada, essa técnica pode ser executada em cinco a seis horas, se executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante manter as células no gelo até cerca de 20 minutos antes do início da medição. Não meça nenhuma amostra por mais de duas horas.

Após este procedimento, outros métodos, como imagens, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como a forma como a taxa de difusão se correlaciona com o nível de expressão de uma determinada proteína. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores nas áreas de biologia molecular e imunologia explorarem a dinâmica de proteínas em células vivas.