Name: Difusão molecular em membranas plasmáticas de linfócitos primários medida por fluorescência Correlation Spectroscopy (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-01T12:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 6 s
Description: Aprenda a medir a difusão de proteínas em membranas de linfócitos primários usando espectroscopia de correlação de fluorescência. Esta técnica revela a dinâmica de receptores em células vivas para pesquisa em imunologia.

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Agradecemos ao Dr. Vladana Vukojević, Centro de Medicina Molecular, Instituto Karolinska para a manutenção do instrumento Zeiss ConfoCor 3 e para dicas úteis sobre medições celulares. Este estudo foi financiado por subvenções do Vetenskapsrådet (número de concessão 2012- 1629), Magnus Bergvalls Stiftelse e de Stiftelsen Claes Groschinskys minnesfond.

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Os autores não têm nada a divulgar.

Este protocolo para o FCS pode ser usada para a avaliação da dinâmica molecular de moléculas de superfície sobre todos os tipos de células do sistema imunológico (murinos, humana, ou de outras espécies). Medidas FCS dinâmica molecular espaço-temporais para baixo a resolução única molécula em células vivas. A densidade molecular, bem como a taxa de difusão e de agrupamento dinâmica das proteínas de interesse, podem ser extraídos a partir das curvas de autocorrelação. A marcação fluorescente é...

Muitas funções células imunitárias dependem de difusão molecular e interacções dentro de membranas. As membranas biológicas são complexas, e muitos factores que podem ser importantes para a função de células imunes pode influenciar a velocidade de difusão de translação de proteínas dentro das membranas celulares 1. Recentemente, mostrou que as células assassinas naturais (NK), os linfócitos que pertencem ao sistema imune inato, exibem difusão diferencial de duas proteínas estudadas na membrana celular, dependendo do estado de activação da célula NK 2. espectroscopia de correlação de fluorescência (FCS) é uma técnica que é capaz de quantificar as taxas de difusão molecular dentro de membranas biológicas. Ela reporta a taxa média de difusão de moléculas marcado por fluorescência em um volume fixo, tipicamente o foco de um microscópio confocal. Ele baseia-se na medição das flutuações em fluorescência que ocorre quando do movimento molecular emum sistema em estado estacionário. FCS tem sido amplamente utilizada para o estudo da difusão de corantes fluorescentes e de proteínas, tanto em solução como em membranas lipídicas. Outros parâmetros de saída afectam a taxa de difusão também pode ser indirectamente estudada dessa forma (por exemplo, mudanças de conformação das proteínas ou interacções das moléculas em membranas celulares) 3, 4. FCS se destaca em comparação com outras técnicas, devido à sua alta sensibilidade, permitindo a possibilidade de detecção de uma única molécula. Ele funciona bem para concentrações moleculares na gama nanomolar a milimolar, o que é típico para os níveis de expressão endógenos da maioria das proteínas 5. Além disso, FCS pode dar uma aproximação do número absoluto de proteínas dentro do volume estudadas, enquanto a maioria das outras técnicas só dão informação relativa sobre os níveis de expressão da proteína. Outros métodos para medir as taxas de difusão molecular em membranas incluem fluorecuperação rescência após a fotodegradação (FRAP), rastreamento única partícula (SPT), múltiplos pinhole FCS, e correlação imagem métodos. Métodos FRAP e correlação de imagem são técnicas de ensemble, que geralmente não dão informações sobre o número absoluto de moléculas 10. Comparado a SPT, a taxa de transferência de FCS é maior em relação à caracterização da média da população. A análise também é menos exigente desde que a taxa média de difusão das moléculas presentes no foco do laser é medido, em vez da taxa de moléculas individuais. Além disso, a menos que microscópios especializados estão disponíveis 11, SPT não pode dar qualquer informação sobre as concentrações, uma vez que a rotulagem padrão SPT deve ser muito baixa para permitir a identificação de moléculas individuais. Por outro lado, exige que as moléculas de FCS em estudo a ser móvel. Ele simplesmente não vai detectar eventuais frações ou moléculas imóveis putativos se movendo muito lentamente. A taxa de difusão das moléculas queresidir no foco mais do que cerca de um décimo do tempo de aquisição não serão correctamente representada nas medições FCS 3, 12. Portanto, coeficientes de difusão gravadas por FCS tendem a ser mais rápido do que as taxas de difusão relatados a partir de técnicas como FRAP e SPT, onde as frações próxima do imóvel e muito lentas são levados em conta também. SPT também dará uma descrição mais pormenorizada da variação das taxas de difusão dentro da população molecular de FCS. FCS quantifica a flutuação da intensidade de fluorescência ao longo do tempo dentro do volume animado. No caso das medições de membrana, isto traduz-se na área iluminada da membrana. Neste trabalho, nós utilizamos o fato de que essas flutuações são induzidas por moléculas que exibem difusão browniano e são, assim, mover dentro e fora do volume de excitação. Há também várias outras fontes possíveis para o fluctuações no sinal de fluorescência, tais como a piscar ou a presença de um estado tripleto nas fluoróforos, os efeitos ambientais, de ligação-unbinding do ligando, ou movimento da membrana da célula inteira. Estas fontes de erro putativos precisam ser levados em consideração ao projetar um experimento FCS, a fim de interpretar com precisão os resultados 12, 13. Normalmente, as taxas de difusão lateral em membranas biológicas são baixos devido à aglomeração e interações, tanto entre as proteínas da membrana e entre proteínas e citoesqueleto. Historicamente, a utilização de FCS em membranas tem sido, assim, dificultada pela falta de fluoróforos foto-estáveis, que são necessárias para evitar o branqueamento durante os tempos de trânsito estendido através do foco de excitação 14. No entanto, hoje em dia, há uma abundância de opções para corantes foto-estável adequados. melhorias significativas em detectores e outros equipamentos também permitem a detecção de prote fluorescenteins e corantes de brilho mais baixo. Aqui, um protocolo de base para a aplicação de FCS utilizando linfócitos primários de murino, em que a proteína de interesse é marcado com um anticorpo fluorescentemente marcado, é descrito. Uma abordagem para ajustar as curvas de autocorrelação, a fim de extrair o coeficiente de difusão e a densidade molecular também é mostrada. O protocolo visa ser facilmente seguido por imunologistas sem experiência prévia de técnicas para estudar a difusão de moléculas. No entanto, é esperado um entendimento básico de microscopia confocal (para ganhar esse entendimento básico, ver referência 15). Este protocolo pode ser facilmente adaptado relativamente a outras células em suspensão, ambas linhas celulares e células primárias. Para os utilizadores mais experientes FCS, existem métodos de análise mais refinados, alguns dos quais são descritos na discussão.

<table><tbody><tr><td>Kit de Isolamento de Células NK MACS mouse II</td><td>Miltenyi Biotec NordenAB</td><td>130-096-892</td><td>Seleção negativa de células NK</td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino</td><td>Sigma-Adlrich</td><td>F7524</td><td>Solução</td></tr><tr><td>salina tamponada com fosfato</td> inativado por calor<td>-</td><td>-</td><td>Feito em casa&nbsp;</td></tr><tr><td>Roswell Park Memorial Institute medium 1640</td><td>PAA The Cell Culture Company&nbsp;</td><td>E15-848</td><td>Meio transparente</td></tr><tr><td>Clone de anticorpo 2.4G2</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>553140</td><td>para bloquear os receptores Fc.</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-Ly49A&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Anticorpo monoclonal feito internamente e conjugado internamente ao anticorpo Alexa fluor 647</td></tr><tr><td>Clone JR9.318</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-H-2Dd&nbsp;</td><td>BD Pharmingen</td><td>558915</td><td>Conjugado internamente com MFP488</td></tr><tr><td>Clone 34.5.8S</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MFP488</td><td>Mobiotech</td><td>MFP-A2181</td><td>Corante fluorescente para conjugação de anticorpos.</td></tr><tr><td>Poli-L-lisina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8920</td><td>Diluído em água destilada (1,10)</td></tr><tr><td>Poli-L-lisina (20 kDa) enxertado com polietilenoglicol (2 kDa)</td><td>SuSoS AG</td><td>PLL(20)-g[3,5]-PEG(2)</td><td>Diluído em PBS (pH 7,4) a 0,5 mg/ml.</td></tr><tr><td>Cloreto de rodamina 110</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>432202</td><td>Coeficiente de difusão conhecido: 3,3 &vezes; 10&menos; 10 m2/seg 19</td></tr><tr><td>Alexa fluor 647</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>A20006</td><td>Coeficiente de difusão conhecido: 4,4 &vezes; 10&menos; 10 m2/seg 20</td></tr><tr><td>Microscópio confocal&nbsp;</td>Software <td>Zeiss</td><td>LSM510</td><td></td></tr><tr><td>: Confocor 3</td> Software <td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>: Matlab com caixa de ferramentas de ajuste de curva</td><td>Versão Matlab</td><td>R2013b</td><td></td></tr><tr><td>Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass</td><td>Thermo-scientific&nbsp;</td><td>155411</td><td>8 poços, fundo de borossilicato 1,0</td></tr></tbody></table>

difusão molecular em membranas plasmáticas de linfócitos primários medida por fluorescência correlation spectroscopy

Molecular Diffusion in Plasma Membranes of Primary Lymphocytes Measured by Fluorescence Correlation Spectroscopy

espectroscopia de correlação de fluorescência (FCS) é uma técnica poderosa para o estudo da difusão de moléculas dentro de membranas biológicas com elevada resolução espacial e temporal. FCS pode quantificar a concentração e coeficiente de difusão molecular de moléculas marcadas fluorescentemente na membrana da célula. Esta técnica tem a capacidade de explorar as características de difusão molecular de moléculas na membrana plasmática de células do sistema imunológico em estado estacionário (isto é, sem processos que afectam o resultado durante o tempo de medição real). FCS é adequado para o estudo da difusão de proteínas que são expressas em níveis típicos para mais proteínas endógenas. Aqui, um método simples e robusto para determinar a taxa de difusão de proteínas da membrana celular em linfócitos primários é demonstrada. Uma forma eficaz de realizar medições em células vivas marcadas com o anticorpo e observações que ocorrem comumente após a aquisição são descritos. Os avanços recentesno desenvolvimento de corantes fluorescentes foto-estável pode ser utilizada através da conjugação dos anticorpos de interesse de se apropriar corantes que não lixívia extensivamente durante as medições. Além disso, esta permite a detecção de entidades difundem-se lentamente, o que é uma característica comum de proteínas expressas em membranas celulares. O procedimento de análise para extrair parâmetros de concentração e difusão molecular a partir das curvas de autocorrelação gerados é realçado. Em resumo, um protocolo de base para medições de FCS é fornecida; ele pode ser seguido por imunologistas com uma compreensão de microscopia confocal, mas com nenhuma outra experiência anterior de técnicas para a medição de parâmetros dinâmicos, tais como taxas de difusão molecular.

Um resultado típico irá gerar uma curva de autocorrelação com um tempo de trânsito no intervalo de 10 ms para 400 ms para proteínas de membrana. O número de moléculas pode variar entre 0,5 a cerca de 200 ^ M por 2 para proteínas expressas endogenamente. Verifique cuidadosamente que o CPM não é menor do que o esperado. Isto pode significar que existe uma influência do sinal de fundo. Como regra geral, o sinal de CPM de células que é aceite para a análise não deve ser inferior a...

Um método para medir a difusão de proteínas em membranas de células imunes primárias usando espectroscopia de correlação de fluorescência (FCS) é descrito. Neste artigo, o uso de anticorpos para marcação fluorescente é ilustrado.

Difusão molecular em membranas plasmáticas de linfócitos primários medida por fluorescência Correlation Spectroscopy

Fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is a powerful technique for studying the diffusion of molecules within biological membranes with high spatial ...

O objetivo geral deste protocolo é medir a taxa de difusão de uma proteína marcada nas membranas das células imunes primárias usando espectroscopia de correlação de fluorescência. Este método pode ajudar a identificar questões-chave nos campos da imunologia e da biologia celular, como a identificação de células natural killer com uma dinâmica de receptor de membrana mais ativa. A principal vantagem dessa técnica é que ela é usada com células vivas, por isso reflete com precisão o estado natural de como as moléculas se movem.As implicações desta técnica se estendem à imunoterapia do câncer se diferentes características das células assassinas naturais, como a difusão molecular, estiverem ligadas à sua função de que a eficiência pode ser melhor prevista. Embora esse método possa fornecer informações sobre o movimento molecular em células imunológicas, ele também pode ser aplicado a outras células primárias e linhagens celulares em qualquer disciplina. Abra o software no modo especialista, com a opção Digitalizar novas imagens selecionada.Selecione a lente objetiva de água 40X no microscópio confocal de varredura a laser. Na guia Adquirir, pressione os botões Config e Scan para abrir o Controle de Configuração e o Controle de Verificação. Na guia ConfoCor, pressione Medir para abrir a janela Medição.Em seguida, crie uma pasta para salvar as medidas FCS. Inicie um novo banco de dados de imagens clicando em Novo na guia Arquivo. Ligue a lâmpada halógena.Usando o botão Laser, ligue os lasers relevantes para excitar os fluoróforos. Em seguida, especifique as configurações para captura de imagem na janela Controle de configuração. Isso inclui o laser de excitação, filtros de excitação e emissão, caminho de luz e detectores em uso.Da mesma forma, vá para a janela Medição e ajuste as configurações do FCS na guia Configuração do sistema. Ative os canais de detecção para as gravações do FCS alternando o canal verde e o canal 2 para o canal vermelho. Enquanto o laser se estabiliza, o que pode levar até 30 minutos, ajuste o orifício.Primeiro, coloque uma gota de 50 microlitros de corante centralmente em um poço de uma lâmina de lamínula com câmara de oito poços revestida com poli-L-lisina. Os poços adjacentes são usados para fazer medições de células, pois a calibração depende do slide. Coloque uma gota de água destilada na lente objetiva de água 40X e posicione a lâmina.Em seguida, pressione Vis para selecionar a fonte de luz visível e focar na posição central da gota de fluoróforo. Na janela Medição do software, selecione a guia Aquisição e, em Posições, alterne a posição atual. Em seguida, retorne à guia Configuração do sistema na mesma janela e defina uma potência alta ou de saturação para o laser verde.Para testar a estabilidade do sinal, pressione Iniciar para abrir uma nova janela exibindo o Traço de tempo e a curva de correlação automática. Verifique se o sinal fluorescente está alto, estável e se o eixo y mostra flutuação na faixa de kilohertz. Valores mais baixos podem ser devidos a foco impreciso ou degradação do corante.Em seguida, na janela Medição, selecione o botão O Ajustar. Em seguida, selecione o canal de detecção correto e pressione Ajuste automático X.Se o limite superior da curva resultante estiver ausente ou não centralizado, marque a opção Grosso e pressione Ajuste automático X novamente. Depois de ajustar a direção X, faça o mesmo para a direção Y pressionando Ajuste automático Y.Desmarque Grosso e alterne entre ajustar X e Y pressionando Ajuste automático até que ambos tenham valores máximos e estáveis claros.Se as células forem marcadas por dois fluoróforos diferentes, adicione uma gota de solução de fluoróforo vermelho a uma câmara adjacente. Em seguida, calibre o segundo canal. Defina o laser vermelho para uma potência alta e repita o procedimento de calibração de estabilidade.Em seguida, medimos o tempo de trânsito de fluoróforos de difusão livre através do foco. E usamos o estágio para calcular a área da membrana celular que está dentro do foco. Para começar, concentre-se em uma gota de solução executando cuidadosamente o procedimento de ajuste.Em seguida, vá para a guia Aquisição na janela Medição e defina o tempo de aquisição para 30 segundos com três repetições. Defina a potência do laser para quase saturação e pressione Iniciar para fazer uma medição. Registre as contagens por molécula ou CPM após a conclusão da medição.Em seguida, faça novas medições fazendo reduções iterativas na potência do laser. Dentro dessa faixa de potência, inclua a potência esperada das próximas medições de células. Em seguida, verifique se os valores de CPM são dimensionados linearmente com a potência do laser.Desde que o resto da escala seja linear, a saturação na potência mais alta é aceitável. Na primeira vez que um anticorpo fluorescente recém-conjugado for usado, realize uma medição FCS de anticorpos de difusão livre para quantificar o CPM esperado. E é importante usar poços revestidos com PEG Poli-L-Lisina para anticorpos livres.Para este procedimento, revestir uma lâmina com câmara com 200 microlitros de Poli-L-Lisina enxertada em polietilenoglicol. Deixe a solução aderir por uma hora em temperatura ambiente. A solução de estoque pode ser refrigerada por até duas semanas.E o caldo de pó deve ser armazenado no freezer. Mais tarde, remova o líquido e deixe a câmara secar ao ar. Ao microscópio, diluir o anticorpo em PBS entre um e 10 microgramas por mililitro.Prossiga para medir o tempo de trânsito de anticorpos livres conforme descrito na seção anterior para fluoróforos livres. Para fazer a medição em uma célula, adicione 125 microlitros de células em PBS mais 1% FCS da suspensão celular marcada com anticorpos. E 150 microlitros de Roswell Park Memorial Institute Medium 1640 transparente em um poço vazio na lâmina de vidro revestida com PLL.Deixe as células incubarem no escuro à temperatura de medição por pelo menos 20 minutos antes de prosseguir, para que as células possam se fixar e se equilibrar. Inicie a imagem com varreduras XY rápidas para encontrar a menor potência de laser possível necessária para visualizar as células. Em seguida, centralize a imagem em uma célula redonda de brilho médio, onde a membrana está claramente definida.É crucial que não haja sinal fluorescente no citoplasma. Aumente o zoom até que a célula cubra a maior parte da imagem. Em seguida, concentre-se na parte superior da membrana celular.Comece no centro da célula e suba até que o centro da imagem mostre uma pequena área redonda com fluorescência uniforme. A colocação cuidadosa do foco é crucial. Se o foco não estiver na membrana, a fluorescência detectada não virá dos receptores de membrana marcados com fluorescência.E, portanto, os resultados não refletirão seu comportamento. Agora, na guia Aquisição da janela Medição, selecione uma posição para medição FCS ativando a mira. Em seguida, defina o número de repetições entre seis e 10 e defina o Tempo de medição para 10 segundos por repetição.Agora retorne à guia Configuração do sistema da janela Medição e diminua a potência do laser para medições FCS para entre um e 10 microwatts. Em seguida, pressione Iniciar. Se o traço de intensidade cair mais de 30% durante os primeiros 10 segundos, a célula foi branqueada demais e outra célula deve ser medida com uma potência menor.Se o sinal for perdido, ajuste o foco na direção Z e reinicie a medição. Após a conclusão da medição, verifique se a célula ainda está centralizada na janela de controle de varredura para ter certeza de que sua membrana foi medida. Se a célula se moveu, descarte os dados.Agora vá para a janela Correlação automática e exclua manualmente as repetições individuais que contêm manobras de zoom, branqueamento, grandes clusters ou outros artefatos. Clique com o botão direito do mouse e selecione Excluir para remover os artefatos. Selecionar os artefatos reais requer prática.A remoção de repetições é um processo simples, mas as repetições precisam ser avaliadas corretamente para saber o que deve ser removido e o que não deve. Em seguida, salve o arquivo final no formato FCS. Mantenha apenas as células que tenham pelo menos quatro repetições restantes após a remoção dos artefatos para análise posterior.Uma curva de correlação automática típica do receptor de membrana é suave e tem um tempo de trânsito na faixa de 10 a 400 milissegundos. Defina os domínios de ajuste para que o início e o fim da parte inclinada mais íngreme, representando a difusão, sejam representados. Usando um modelo de difusão livre em duas dimensões para ajustar os dados, preste atenção à parte mais inclinada da curva.Pequenas flutuações em ou em torno de um segundo na escala tau, vistas no residual, são aceitáveis. Se a curva se ajustar mal, mas a célula não tiver problemas aparentes, como movimento, branqueamento ou aglomerados, os valores iniciais ou os limites superior e inferior do modelo provavelmente precisarão ser alterados. Quando o modelo se ajustar bem à curva de correlação automática, extraia os valores dos parâmetros variáveis.O número de moléculas pode variar entre 0,5 a cerca de 200 por mícron quadrado para proteínas expressas endogenamente. Verifique se o valor CPM da medição da célula é pelo menos 33% do registrado de anticorpos que se difundem livremente. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como medir a taxa de difusão de proteínas usando espectroscopia de correlação fluorescente.Uma vez dominada, essa técnica pode ser executada em cinco a seis horas, se executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante manter as células no gelo até cerca de 20 minutos antes do início da medição. Não meça nenhuma amostra por mais de duas horas.Após este procedimento, outros métodos, como imagens, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como a forma como a taxa de difusão se correlaciona com o nível de expressão de uma determinada proteína. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores nas áreas de biologia molecular e imunologia explorarem a dinâmica de proteínas em células vivas.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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