Espectroscopia de Flutuação de Fluorescência para Estudar a Interação de Proteínas em Contatos Celulares

As interações célula-célula - mediadas por proteínas em superfícies celulares vizinhas - podem ser estudadas em células vivas usando um ensaio de espectroscopia de flutuação de fluorescência.

Primeiro, pegue culturas de células separadas que expressam um receptor de adesão - uma proteína transmembrana. O receptor nas células das duas populações é marcado com proteínas fluorescentes separadas espectralmente. Esses marcadores fluorescentes estão presentes na região citoplasmática do receptor, evitando interferência na interação célula-célula.

Descarte o meio e adicione tripsina, facilitando o descolamento celular. Misture as duas populações de células e incuba, permitindo que os receptores das células vizinhas formem transinterações homotípicas.

Coloque as células sob um microscópio confocal. Iluminar a amostra utilizando fontes laser de comprimentos de onda adequados, provocando a emissão de ambas as etiquetas fluorescentes. Localize duas células vizinhas com sinais de fluorescência de cores diferentes em contato.

Adquira uma varredura de linha - perpendicular à região das membranas celulares em contato - usando o canal espectral de ambos os rótulos fluorescentes. O laser se concentra em um pequeno volume da amostra - o volume de detecção. À medida que os receptores marcados com fluorescência se difundem para dentro e para fora do volume de detecção, a intensidade da fluorescência flutua.

Se os receptores das células vizinhas não interagem, eles se movem individualmente, levando a flutuações independentes em sua intensidade de fluorescência com baixa correlação cruzada.

Se as células vizinhas em contato interagem por meio de seus receptores, as proteínas que interagem se difundem juntas, causando uma flutuação correlacionada em sua intensidade de fluorescência.

Transfira a solução celular de um poço para o poço correspondente. Misture delicadamente pipetando algumas vezes para cima e para baixo e, em seguida, semeie as células misturadas em um prato com fundo de vidro de 35 mililitros e cultive as células semeadas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por um dia.

No software do microscópio confocal de varredura a laser, configure o caminho óptico. Para evitar diafonia espectral, selecione duas faixas separadas para excitar e detectar mEGFP ou mEYFP e mCherry ou mCardinal sequencialmente e selecione "Alternar faixas a cada linha". Para a detecção, use filtros apropriados para ambos os canais.

Colocar o prato que contém as células misturadas no porta-amostras. Depois de esperar 10 minutos para garantir o equilíbrio da temperatura e reduzir o desvio de foco, concentre-se nas células usando a luz de transmissão no menu "Localizar". Procure um par de células 'vermelhas' e 'verdes' em contato uma com a outra.

Em seguida, selecione um caminho de varredura perpendicular ao contato célula-célula usando o botão "Cortar". "Zoom" para obter um tamanho de pixel de 50 a 200 nanômetros e selecione "Linha" no "Modo de digitalização". Defina "Tamanho do quadro" como 128 por 1 pixels. Defina "Velocidade de digitalização" para o valor máximo permitido e, em seguida, defina os ciclos para 100.000 a 500.000.

Em seguida, escolha as potências de laser apropriadas. Defina os detectores para o modo "Contagem de fótons". Pressione "Iniciar experimento" para iniciar a aquisição.