Name: High Throughput, em tempo real, Teste Dual-leitura dos intracelular Actividade Antimicrobiana e citotoxicidade celular eucariótica (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 9 s
Description: Aprenda a realizar ensaios de alta vazão em tempo real para identificar antimicrobianos intracelulares não tóxicos para células hospedeiras. Este método permite detectar simultaneamente o crescimento bacteriano e a citotoxicidade celular usando técnicas não destrutivas.

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A pesquisa relatada neste manuscrito foi apoiada pelo Instituto Nacional de Alergia e Doenças Infecciosas dos Institutos Nacionais de Saúde sob o número de concessão R01AI099122 a J.E.K. O conteúdo é de responsabilidade exclusiva dos autores e não representa necessariamente as opiniões oficiais dos Institutos Nacionais de Saúde. Gostaríamos de agradecer a Jennifer Smith, David Wrobel, Su Chiang, Doug Flood, Sean Johnston, Jennifer Nale, Stewart Rudnicki, Paul Yan, Richard Siu e Rachel Warden do ICCB-Longwood Screening Facility e/ou ao National Screening Laboratory para os Centros Regionais de Excelência em Biodefesa e Doenças Infecciosas Emergentes da Nova Inglaterra (apoiados pelo U54AI057159) por sua assistência no desenvolvimento e desempenho de ensaios de triagem de alto rendimento. Também gostaríamos de agradecer a Kenneth P. Smith pelos comentários úteis sobre o manuscrito.

1. Ensaio em Tempo Real de Crescimento Intracelular e Citotoxicidade em Células Eucarióticas
<ol>
	<li>Preparação das Células Hospedeiras (Células J774A.1)
	<ol>
		<li>Cultura J774A.1 Mus musculus células semelhantes a macrófagos em suspensão em RPMI 1640 com 9% de soro de bezerro suplementado com ferro. Passagem inicial em frascos de cultura de tecidos. Após as células atingirem confluência em um frasco de 75 cm2 frasco de cultura de tecidos com 15 ml de meio, dividido por raspagem e diluição para 65 ml com o mesmo tipo de meio, dos quais 15 ml são retornados ao frasco de cultura de tecidos e 50 ml são transferidos para um frasco agitador bacteriano de 250 ml.</li>
		<li>Para ampliação, cultive em suspensão em frascos bacteriológicos de 250 ml e/ou 1.000 ml, preenchidos com meio de cultura de tecidos até um quinto do volume. Areje ajustando a velocidade de rotação para aproximadamente 120 rotações por minuto. Para crescimento consistente, incube exatamente a 5% de CO2 e 37 °C.</li>
		<li>Colete as células quando atingirem densidade na faixa de 2,5 x 106 células/ml para 5 x 106 células/ml. Certifique-se de que a porcentagem de células mortas (mais facilmente avaliada por coloração com azul de tripano) não exceda 25%, pois células mortas aumentarão o ruído de fundo nos ensaios de citotoxicidade.</li>
		<li>Plaque com microplacas brancas, tratadas para cultura de tecidos, de 384 poços, a 5 x 104 células J774A.1 em 30 µl meio de cultura de tecidos por poço. Incubar as microplacas durante a noite para atingir 90% de confluência no dia do experimento.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Preparando Luminescência ou Fluorescência Legionella pneumophila
	<ol>
		<li>Passagem L. pneumophila (Lp02::flaA::lux8) bactérias em meio apropriado, ou seja, meio buffered charcoal yeast extract (BCYE). Se estiver utilizando uma linhagem timidina-auxotrófica, suplemente o meio com 100 µg/ml tiridina. Prepare patches de bactérias para experimentos espalhando os organismos abundantemente em uma nova placa de BCYE e incubando por um dia (se provenientes de uma passagem anterior em placa) ou dois a três dias (se provenientes de estoque congelado) para obter crescimento confluente.
		<ol>
			<li>Prepare placas BCYE dissolvendo 10 g de extrato de levedura, 10 g de N-(2-acetamido)-2-aminoetanosulfônico, 0,35 g K2HPO4e 1 g de α-cetoglutarato monobásico de potássio em 950 ml de água desionizada. Ajuste o pH para 6,9 com hidróxido de potássio (≥2,5 ml de solução 11,9 molar).</li>
			<li>Adicione 15 g de ágar e 2 g de carvão ativado; complete o volume para 1 L. Adicione uma barra de agitação magnética e autoclave. Resfrie o meio até 55 °C e adicione soluções filtradas e esterilizadas contendo 0,4 g de L-cisteína e 0,42 g de citrato férrico de amônio dissolvidos em água desionizada. Utilize uma placa de agitação magnética para misturar antes de verter as placas de Petri.</li>
			<li>Para testes de L. pneumophila crescimento em meio de cultura axênico, prepare o caldo AYE (ACES-extrato de levedura) combinando todos os reagentes químicos utilizados para o BCYE, exceto carvão e ágar. Estérilize por filtração e use imediatamente ou congele para experimentos posteriores.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Resuspenda os organismos no mesmo meio de cultura de tecidos utilizado para as células J774A.1 com 100 µg/ml suplementação com timidina conforme apropriado.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Infecção por Macrófagos
	<ol>
		<li>Adicione os compostos-teste de interesse (compostos de triagem, e controles positivo e negativo para inibição do crescimento bacteriano e lise de células eucarióticas). Preferencialmente, dissolva as soluções estoque em concentração ≥500x em DMSO (dimetilsulfóxido) ou em solução aquosa para permitir diluição suficiente do veículo.
		<ol>
			<li>Embora as soluções estoque possam ser armazenadas congeladas, evite ciclos de congelamento-descongelamento para compostos lábeis e antimicrobianos.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Dilua as bactérias luminescentes até a concentração-alvo de 2,5 x 106 UFU (unidade formadora de colônia)/m e bactérias marcadas com repórter fluorescente para 1,0 x 107 UFC/ml em meio de cultura de tecidos e adicione corante não tóxico, impermeável à membrana e ligante ao ácido nucleico na concentração final de 2,5x para o ensaio.</li>
		<li>Adicione 20 µl da mistura para cada poço de cultura de J774A.1, volume final do ensaio 50 µl, concentração bacteriana final 1 x 106 UFC/ml (repetidor do operão lux) ou 4 x 10¹⁰6 UFC/ml (repórter de proteína fluorescente).</li>
		<li>Incubar a 37 °C por 1 a 3 dias em 5% CO2 a 100% de umidade relativa para prevenir efeitos de borda por evaporação.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Leitura do ensaio
	<ol>
		<li>Leia o crescimento bacteriano e a toxicidade em células eucarióticas em um luminômetro e fluorímetro de microplacas, conforme apropriado para os repórteres utilizados.
		<ol>
			<li>Para evitar efeitos de borda associados à temperatura, equilibre termicamente as microplacas antes da leitura de luminiscência, colocando-as em uma única camada sobre uma bancada de laboratório com as tampas entreabertas por aproximadamente 20 min (ou em uma câmara de segurança biológica sem as tampas por aproximadamente 10 min).</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Retorne as microplacas ao incubador se for desejado um registro em tempo real em pontos temporais posteriores.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Análise de Dados
<ol>
	<li>Normalize os dados em relação aos controles positivo e negativo para calcular a porcentagem ou a inibição em relação ao crescimento bacteriano intracelular e a citotoxicidade percentual para células eucarióticas.</li>
	<li>Para avaliar a robustez do ensaio, calcule a separação estatística entre os controles positivo e negativo tanto para inibição do crescimento bacteriano quanto para citotoxicidade, utilizando a análise do fator Z (Z'), em que Z' = 1 - 3(σp + σn)/|µp + µn|. Nesta equação, σp e σn são os desvios-padrão das poças dos controles positivo e negativo, respectivamente; µp e µn são os valores médios das poças dos controles positivo e negativo, respectivamente.
	<ol>
		<li>Para ensaios de triagem em alta vazão, calcule os escores z padrão (ou outras medidas estatísticas quantitativas alternativas) para avaliar os efeitos dos compostos-teste de interesse. Alternativamente, calcule uma redução em relação ao controle ou uma redução logarítmica em relação ao controle como uma medida potencialmente mais fisiologicamente relevante da magnitude do efeito em bactérias que se replicam geometricamente.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Testes de resposta à dose unidimensionais e multidimensionais (ou seja, sinergia) e interpretação dos dados
<ol>
	<li>Prepare macrófagos e bactérias conforme descrito na seção 1 do protocolo.</li>
	<li>Imediatamente antes da infecção ou incubação axênica, adicione antimicrobianos de interesse experimental em série de diluições sucessivas e dobradas, com o objetivo de abranger, na extremidade superior, uma concentração que elimine completamente o crescimento (ou seja, a concentração inibitória mínima ou MIC) e, na extremidade inferior, uma concentração que não apresenta atividade aparente.</li>
	<li>Utilize um sistema automatizado de manipulação líquida para facilitar a configuração de testes de resposta a dose única e de sinergia combinatória mediante a adição direta e automatizada de diluições de antimicrobianos de acordo com o protocolo do fabricante.</li>
	<li>Considere o uso de diluições submúltiplas, por exemplo, <img alt="Símbolo de raiz quadrada, diagrama de equação matemática, uso educacional, visualização de fórmula, análise de pesquisa." src="/files/ftp_upload/54841/54841eq1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Equação 1">série de diluições em fator fixo e réplicas de ensaio para aumentar a precisão e reprodutibilidade dos dados.</li>
	<li>Para infecção de macrófagos, dilua as bactérias luminiscentes até a concentração-alvo de 2,5 x 106 UF (unidade formadora de colônia)/ml em meio de cultura de tecidos. Adicione 20 µl da mistura para cada poço de cultura de J774A.1, volume final do ensaio 50 µl, concentração bacteriana final 1 x 106 UFC/ml; e incubar a 37 °C em 5% CO2 a 100% de umidade relativa.
	<ol>
		<li>Para o teste de crescimento axênico, dilua as bactérias luminescentes até uma concentração final de 1 x 106 UFC/ml em meio AYE, adicione 50 µl a cada poço de uma placa de 384 poços e incubar a 37 °C em 5% CO2 a 100% de umidade relativa.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Calcule o índice de concentração inibitória fracionada para combinações antimicrobianas que inibem o crescimento bacteriano. Para cada fármaco na combinação (a, b, . . n) que resulta em inibição completa ou &gt;99% de inibição do crescimento bacteriano, calcule a concentração inibitória fracionada individual (FIC)a, b, . . n.) da seguinte forma: FICa = a concentração do composto "a" dividida pela concentração inibitória mínima de "a" por si só.. Usando a mesma fórmula, calcule o FICb, etc. Em seguida, calcule o índice FIC combinatório ou <img alt="Equilíbrio estático, equação ΣFx=0, ilustrando o conceito de equilíbrio com símbolo de física." src="/files/ftp_upload/54841/54841eq2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Equação 2"> FIC = FICa + CFIb + . . .FICn para cada combinação inibitória.
	<ol>
		<li>Utilize o índice combinatório que mais se desvia de 1,0 para avaliar a sinergia. Considere um valor de corte de ≤0,5 como uma indicação conservadora de um efeito sinérgico e de ≥4, de um efeito antagônico.12</li>
		<li>Trace isobologramas, isobologramas de contorno isolinhas e/ou isobologramas de superfície isossuperfície6 como representações gráficas alternativas de efeitos combinatórios.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Garzoni, C., Kelley, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staphylococcus+aureus%3A+new+evidence+for+intracellular+persistence%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Staphylococcus aureus: new evidence for intracellular persistence.</a> Trends Microbiol. 17 (2), 59-65 (2009).</li>
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<li>Vogel, J. P., Andrews, H. L., Wong, S. K., Isberg, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conjugative+transfer+by+the+virulence+system+of+Legionella+pneumophila%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Conjugative transfer by the virulence system of Legionella pneumophila.</a> Science. 279 (5352), 873-876 (1998).</li>
<li>Song, H., Fares, M., Maguire, K. R., Sidén, A., Potácová, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytotoxic+Effects+of+Tetracycline+Analogues+%28Doxycycline%2C+Minocycline+and+COL-3%29+in+Acute+Myeloid+Leukemia+HL-60+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Cytotoxic Effects of Tetracycline Analogues (Doxycycline, Minocycline and COL-3) in Acute Myeloid Leukemia HL-60 Cells.</a> PLoS ONE. 9 (12), e114457(2014).</li>
<li>Isberg, R. R., Falkow, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+genetic+locus+encoded+by+Yersinia+pseudotuberculosis+permits+invasion+of+cultured+animal+cells+by+Escherichia+coli+K-12%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A single genetic locus encoded by Yersinia pseudotuberculosis permits invasion of cultured animal cells by Escherichia coli K-12.</a> Nature. 317 (6034), 262-264 (1985).</li>
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<li>Niles, A. L., Moravec, R. A., Riss, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+viability+and+cytotoxicity+testing+and+same-well+multi-parametric+combinations+for+high+throughput+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Chem+Genomics%22%5BJournal%5D)">In vitro viability and cytotoxicity testing and same-well multi-parametric combinations for high throughput screening.</a> Curr Chem Genomics. 3, 33-41 (2009).</li>
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<li>Dunlap, P. Biochemistry and genetics of bacterial bioluminescence. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDunlap%2C+P+%22Bioluminescence%3A+Fundamentals+and+Applications+in+Biotechnology+-+Volume+1%22">Bioluminescence: Fundamentals and Applications in Biotechnology - Volume 1</a>. Thouand, G., Marks, R. 1, Springer. 37-64 (2014).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Descrevemos ensaios em tempo real para detecção simultânea de crescimento bacteriano intracelular e citotoxicidade da célula hospedeira. Existem várias etapas críticas no protocolo. Primeiro, para um desempenho robusto do ensaio, deve haver separação espectral suficiente entre as leituras bacterianas e de citotoxicidade. Essa separação é intrínseca para combinações de repórteres de operon de luciferase e corantes fluorescentes de ligação ao DNA. No entanto, com base em nossa experiência (Tabela 1-3, <str...

Os patógenos que crescem ou residem temporariamente em compartimentos intracelulares são difíceis de erradicar terapeuticamente. Patógenos intracelulares obrigatórios ou relativamente obrigatórios, como Legionella pneumophila, Coxiella burnetii, Brucella spp., Francisella tularensis e Mycobacterium spp. muitas vezes requerem cursos prolongados de terapia antimicrobiana para cura que podem variar de meses a até anos. Além disso, os patógenos extracelulares podem ocupar transitoriamente nichos intracelulares e, dessa forma, escapar da depuração por cursos normais de terapia antimicrobiana e, posteriormente, emergir para iniciar novas rodadas de infecção virulenta. As infecções por Staphylococcus aureus1 e Enterobacteriaceae2,3 uropatogênicas são dois exemplos cada vez mais reconhecidos. Portanto, um objetivo fundamental da descoberta de medicamentos é identificar novos antimicrobianos que penetram nos compartimentos intracelulares. A terapia ideal para erradicar rapidamente os organismos intracelulares e prevenir o desenvolvimento de resistência por meio da exposição antimicrobiana subinibitória é especialmente desejável.
Para esse fim, desenvolvemos uma tecnologia de triagem de alto rendimento para identificar antimicrobianos penetrantes intracelulares direcionados ao crescimento intracelular do patógeno modelo, Legionella pneumophila. 4 Observações clínicas anteriores indicam que o teste padrão de suscetibilidade antimicrobiana não previu com precisão a eficácia terapêutica in vivo contra esse organismo. 5 Especificamente, isso ocorreu porque as principais classes de antimicrobianos, como β-lactâmicos e aminoglicosídeos, embora altamente eficazes contra a Legionella cultivada axenicamente, não penetram suficientemente nos compartimentos intracelulares onde a Legionella reside. 5,6 Evidências posteriores sugeriram que ensaios de crescimento intracelular tecnicamente mais complexos previram efetivamente a eficácia clínica. 7 Infelizmente, esses ensaios foram ensaios de desfechos extremamente trabalhosos, exigindo macrófagos infectados, tratados com antimicrobianos, para serem lisados em diferentes momentos para enumeração de unidades formadoras de colônias. Esses ensaios são impraticáveis de fazer em larga escala e são inadequados para a descoberta de medicamentos de alto rendimento.
Portanto, desenvolvemos tecnologia para determinação em tempo real do crescimento bacteriano intracelular. 6 Isso foi realizado por meio do uso de uma cepa bacteriana modificada pela integração de umoperon 8 de luciferase bacteriana (ensaio de primeira geração, descrito anteriormente)4 ou repórteres de proteína fluorescente9 (ensaio ortogonal de segunda geração, descrito aqui) no cromossomo bacteriano. Desta forma, o sinal luminescente ou fluorescente fornece uma leitura substituta em tempo real do número bacteriano.
No entanto, esses atributos não abordam um grande fator de confusão nos ensaios de infecção intracelular, efeitos fora do alvo nas células hospedeiras. Em particular, a morte da célula hospedeira limita inerentemente o crescimento intracelular e leva à identificação falsa positiva do efeito antimicrobiano. Como muitos compostos em bibliotecas de triagem são tóxicos para células eucarióticas, esses falsos positivos sobrecarregariam os verdadeiros antimicrobianos, necessitando de um grande número de ensaios de citotoxicidade de ponto final de acompanhamento para resolução.
Assim, foi de grande interesse poder avaliar a viabilidade celular eucariótica e o crescimento intracelular simultaneamente. Notavelmente, uma característica das células eucarióticas não viáveis é a perda da integridade da membrana celular. Sondas que testam a permeabilidade da membrana celular podem, portanto, ser usadas para avaliar a viabilidade celular. Anteriormente, caracterizamos a capacidade de uma série de corantes de ligação ao DNA, fluorescentes, supostamente impermeáveis à membrana celular, de acessar e corar o DNA nuclear de células mortas. 4 Ao ligar o DNA nuclear, esses corantes exibem um grande aumento no rendimento fluorescente quântico, resultando em aumento do sinal sobre a fluorescência da solução de fundo. Como tal, esses corantes forneceram uma leitura quantitativa da morte celular eucariótica. 4 Notavelmente, descobrimos que vários não eram tóxicos durante a co-incubação prolongada com macrófagos J774. Quando adicionados durante a infecção inicial, eles forneceram uma leitura fluorescente em tempo real da morte celular eucariótica que pode ser medida por um fluorímetro de microplaca ou observada microscopicamente.
Portanto, combinando o uso de um repórter bacteriano e corantes não tóxicos, impermeantes à membrana e de ligação ao DNA, fomos capazes de desenvolver um ensaio simples, não destrutivo e em tempo real para medir a carga bacteriana e a citotoxicidade das células eucarióticas simultaneamente. Este ensaio nos permitiu rastrear em formato de placa de 384 poços ~ 10.000 bioativos conhecidos, incluindo ~ 250 antimicrobianos e > 240.000 pequenas moléculas com atividade funcionalmente não caracterizada para a capacidade de inibir o crescimento intracelular de Legionella pneumophila, ao mesmo tempo em que gera dados de citotoxicidade de células eucarióticas para cada composto. 6 Nossa análise de antimicrobianos conhecidos contra o crescimento intracelular de Legionella foi a exploração mais abrangente desse tipo até o momento. 6
Com base na eficiência do nosso formato de ensaio, também exploramos posteriormente os efeitos potencialmente sinérgicos de antimicrobianos conhecidos quando usados em combinação. Um dos testes de sinergia mais comuns, o chamado ensaio quadriculado, é realizado de forma padrão avaliando os efeitos combinatórios de diluições seriais duplas de dois ou mais antimicrobianos. 10 Nesses ensaios, a sinergia é definida pela observação de maior efeito quando dois ou mais antimicrobianos são aplicados juntos do que a soma dos efeitos de cada um aplicado separadamente. É importante notar que, até agora, apenas testes de sinergia focados e seletivos foram realizados contra Legionella pneumophila intracelular devido ao grande esforço envolvido nos ensaios de endpoint tradicionais multiplicados pelas permutações combinatórias necessárias.
Para facilitar o teste de sinergia, usamos nosso ensaio de crescimento intracelular/citotoxicidade eucariótica em tempo real em combinação com a tecnologia de dispensação digital automatizada6. Essa automação nos permitiu dispensar diluições em série de compostos dissolvidos em DMSO ou solução aquosa isoladamente ou em combinação no formato de 384 poços. 11 Além disso, essa tecnologia robusta de manuseio de líquidos nos permitiu realizar facilmente combinações de diluição de raiz quadrada de dois (em vez da padrão, resolução mais baixa, duplicação) para alcançar níveis mais altos de especificidade em nossa análise de sinergia quadridimensional e quadriculada. Esta resolução foi especialmente valiosa para abordar as preocupações no campo da sinergia sobre a reprodutibilidade ao usar a série de diluição dupla12. Por fim, nosso ensaio foi quantitativo e, portanto, também mediu gradações de inibição. Como resultado, o ensaio capturou a totalidade das informações inibitórias, expressas em isobologramas de isocontorno nos quais os isocontornos conectam concentrações combinatórias com níveis semelhantes de inibição do crescimento. 6 Essa estratégia de plotagem permitiu a visualização de curvas combinatórias de dose-resposta. Para ilustrar nossa metodologia, descrevemos nosso protocolo para a realização desses ensaios e mostramos resultados representativos.

<table><tbody><tr><td>Células J774A.1</td><td>American Type Culture Collection</td><td>TIB-67</td><td>Célula hospedeira</td></tr><tr><td>ACES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9758&nbsp;</td><td>Para fazer ágar extrato de levedura de carvão tamponado e meio de extrato de levedura tamponado</td></tr><tr><td>Extrato de levedura, ultrafiltrado</td><td>Becton-Dickinson / Difco</td><td>210929</td><td>Para fazer ágar extrato de levedura de carvão tamponado e meio de extrato de levedura tamponado; graus mais baixos podem causar crescimento prejudicado e / ou alterar a sensibilidade de Legionella a inibidores de crescimento</td></tr><tr><td>Ácido alfa-cetoglutárico, sal monopotássico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K2000</td><td>Para fazer ágar extrato de levedura de carvão tamponado e meio de extrato de levedura tamponado</td></tr><tr><td>Piruvato de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5280</td><td>Para fazer ágar extrato de levedura de carvão tamponado e meio de extrato de levedura tamponado</td></tr><tr><td>Fosfato de potássio, dibásico</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P288-500</td><td>Para fazer ágar extrato de levedura de carvão tamponado e meio de extrato de levedura tamponado</td></tr><tr><td>L-cisteína</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-7755</td><td>Para fazer ágar extrato de levedura de carvão tamponado e meio</td></tr> <tr><td>de extrato de levedura tamponadoCitrato de ferro amônio (III)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F5879</td><td>Para fazer ágar extrato de levedura de carvão tamponado e meio de extrato de levedura tamponado; pirofosfato férrico pode ser usado, mas é mais difícil pesar com precisão</td></tr><tr><td>Solução de hidróxido de potássio, concentrada</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SP236-500</td><td>Para fazer ágar extrato de levedura de carvão tamponado e meio de extrato de levedura tamponado</td></tr> Água <tr><td>deonizada</td><td>N / A</td><td>N / A</td><td>Para fazer ágar extrato de levedura de carvão tamponado e meio de extrato de levedura tamponado</td></tr><tr><td>Timidina (grau de cultura de tecidos)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>T1895</td><td>Para suplementar tanto o RPMI 1640 quanto o extrato de levedura tamponado ágar / meio - a timidina de grau inferior pode ser usada para o último, mas pode causar crescimento celular prejudicado e/ou morte celular em RPMI 1640</td></tr><tr><td>RPMI 1640, formulação padrão</td><td>Corning via Thermo Fisher Scientific</td><td>10-040-CV</td><td>Para o crescimento de células J774A.1 antes do plaqueamento; inclui 2 mM L-glutamina</td></tr><tr><td>RPMI 1640 sem vermelho de fenol</td><td>Corning via Thermo Fisher Scientific</td><td>17-105-CV</td><td>Para o revestimento de células J774A.1 em placas de 384 poços (não adequado para crescimento antes do revestimento); também falta L-glutamina - suplemento para 2 mM antes</td></tr><tr><td>do uso de L-glutamina, 200 mM em 0,85% de NaCl (grau de cultura de tecidos)</td> <td>HyClone via Thermo Fisher Scientific</td><td>SH30034.02</td><td>Para suplementar RPMI 1640 sem L-glutamina, a 2 mM de concentração final Soro</td></tr><tr><td>de bezerro suplementado com ferro</td><td>Gemini Bioproducts</td><td>100-510</td><td>Para suplementar RPMI 1640, a 9,1% de concentração final</td></tr><tr><td>Solução de Trypan Blue</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154</td><td>Para coloração para determinação da morte celular J774A.1 durante a contagem da densidade celular</td></tr><tr><td>SYTOX Green, solução de 5 mM em DMSO</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S7020</td><td>Para coloração para determinação da morte celular J774A.1 por leitura de fluorescência ou microscopia de epifluorescência (em conjunto com bactérias fluorescentes vermelho-alaranjadas ou vermelhas distantes). Use na concentração final de 125 nM.</td></tr><tr><td>Incubadora de cultura de células</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13-255-26</td><td>Para incubação de células J774A.1 (antes e depois da infecção); também pode ser usado para incubação de bactérias, ou uma incubadora de atmosfera padrão pode ser usada em seu lugar)</td></tr><tr><td>Agitador orbital</td><td>BellCo Glass</td><td>7744-01010</td><td>Para agitar a incubação de células J774A.1 antes da infecção; cabe dentro da incubadora de cultura de células; inclui base agitadora 7744-01000 e bandeja 7740-01010 (estes também estão disponíveis separadamente)</td></tr><tr><td>Frascos agitadores (250 ml)</td><td>ChemGlass Life Sciences</td><td>CLS-2038-04</td><td>Para agitar a incubação de células J774A.1 antes da infecção</td></tr><tr><td>Grampos agitadores para frascos (250 ml)</td><td>BellCo Glass</td><td>7744-16250</td><td>Para agitar a incubação de células J774A.1 antes da infecção</td></tr><tr><td>Frascos agitados (1.000 ml)</td><td>ChemGlass Life Sciences</td><td>CLS-2038-07</td><td>Para agitar a incubação de células J774A.1 antes da infecção</td></tr><tr><td>Grampos agitadores para frascos (1.000 ml)</td><td>BellCo Glass</td><td>7744-16100</td><td>Para agitar a incubação de células J774A.1 antes da infecção</td></tr><tr><td>Tampas de espuma de esponja para frascos (250 ml-1.000 ml)</td><td>ChemGlass Life Sciences</td><td>CLS-1490-038</td><td>Para agitar a incubação de células J774A.1 antes da infecção; reduz o risco de contaminação em relação às tampas metálicas padrão</td></tr><tr><td>Bomba peristáltica multicanal programável MultiDrop Combi</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>5840300</td><td>Para dispensar células J774A.1, meio e suspensão bacteriana contendo fluoróforos para um grande número de pratos de 384 poços</td></tr><tr><td>Coletor de furo padrão Combi</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>24072670</td><td>Volume de pré-distribuição padrão de 20 &#956; l é insuficiente para compensar o assentamento &mdash; aumentar para 80 &#956; l</td></tr><tr><td>Branco 384 pratos de poço tratados para cultura de tecidos</td><td>Corning</td><td>3570</td><td>Para leitura de luminescência e fluorescência; Catálogo Greiner # 781080 também testado com sucesso</td></tr><tr><td>DMSO (grau de cultura de tecidos, em ampolas seladas)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td>Para dissolver o controle positivo e testar compostos</td></tr><tr><td>Azitromicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PHR1088</td> Controle <td>positivo</td></tr><tr><td>de antibióticos Saponina (da casca de Quillaja)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>S-4521</td><td>Pipetador</td></tr> <tr><td></td><td>multicanal de controle positivo de citoxicidadeThermo Fisher Scientific</td><td>Finnpipette</td><td>Para transferência de quantidades fixas de compostos de controle positivo; pipetador deve ter dispensação digital com detentores para permitir a distribuição repetitiva de volume fixo</td></tr><tr><td>Robô de transferência de pinos Epson</td><td>Epson/ICCB-L</td> <td>(equipamento personalizado)</td><td>Para transferência de quantidades fixas de compostos de teste de matrizes de bibliotecas</td></tr><tr><td>Sistema de dosagem digital D300</td><td>Hewlett-Packard via Tecan</td><td>D300</td><td>Para transferência de quantidades variáveis de compostos de teste variando de 11 picolitros a 10 &micro; l</td></tr><tr><td>Cartuchos T8+ para sistema de dosagem digital D300</td><td>Hewlett-Packard via Tecan</td><td>T8+</td><td>Para distribuição de compostos de teste</td></tr><tr><td>Microscópio de epifluorescência com câmera digital conectada ao computador</td><td>Nikon</td><td>Ti</td><td>Para imagens de células vivas; qualquer microscópio fluorescente padrão pode substituir, com contraste de fase ou óptica DIC, capaz de imagens de fluorescência verde (fluoresceína), vermelho-alaranjado a vermelho (Texas Red) e vermelho distante (Cy5), com óleo 100X objetiva para</td></tr><tr><td>placas de cultura de tecidos com fundo de vidro</td> da mais alta resolução <td>MatTek Corporation</td><td>P35G-1.5-20-C</td><td>Para imagens de células vivas. Pratos como o MatTek permitem a visualização microscópica com ampliação de 600X ou 1.000X através do uso de um microscópio epifluorescente ou confocal invertido. Esses pratos específicos têm 3,5 cm de diâmetro nominal, 3,3 cm de diâmetro interno, com lamínulas de 20 mm de diâmetro #1,5 de espessura inseridas no fundo.</td></tr><tr><td>Photoshop CS6</td>, <td>Adobe</td><td></td><td>, Adobe Photoshop ou programas semelhantes podem ser usados para pseudocolorir e mesclar imagens microscópicas e fluorescentes de luz.</td></tr><tr><td>Mathematica 10</td><td>Wolfam</td><td></td><td>Para geração de isobologramas de isocontorno bidimensionais e isobologramas tridimensionais de superfície.</td></tr></tbody></table>

high throughput, em tempo real, teste dual-leitura dos intracelular actividade antimicrobiana e citotoxicidade celular eucariótica

High Throughput, Real-time, Dual-readout Testing of Intracellular Antimicrobial Activity and Eukaryotic Cell Cytotoxicity

as medidas tradicionais de atividade antimicrobiana intracelular e citotoxicidade de célula eucariótica contar com ensaios de ponto de extremidade. Tais ensaios de ponto final requerem vários passos experimentais adicionais antes da leitura, tais como lise celular, a determinação da unidade de formação de colónias, ou adição de reagentes. Ao realizar milhares de ensaios, por exemplo, durante a triagem de alto rendimento, a jusante do esforço necessário para estes tipos de ensaios é considerável. Portanto, para facilitar a descoberta de alto rendimento antimicrobianos, foi desenvolvido um ensaio em tempo real simultaneamente para identificar inibidores de crescimento bacteriano intracelular e avaliar a citotoxicidade de células eucarióticas. Especificamente, a detecção de crescimento bacteriano intracelular em tempo real foi habilitado pela marcação estirpes bacterianas de triagem, quer com um operon bacteriano lux (1 ensaio de geração de st) ou repórteres de proteínas fluorescentes (de 2ª geração, ensaio ortogonal). Um não-tóxico, célula de membrana-impermeabilizante, corante de ligação de ácido nucleicoTambém foi adicionado durante a infecção inicial de macrófagos. Estes corantes são excluídos a partir de células viáveis. No entanto, as células hospedeiras não viáveis ​​perder a integridade da membrana permitindo a entrada e marcação fluorescente de DNA nuclear (ácido desoxirribonucléico). Notavelmente, ADN de ligação está associado a um grande aumento no rendimento quântico fluorescente que fornece uma leitura à base de solução de morte da célula hospedeira. Temos utilizado este ensaio combinado para executar uma tela de alto rendimento em formato de microplacas, e para avaliar o crescimento intracelular e citotoxicidade por microscopia. Notavelmente, os agentes antimicrobianos podem demonstrar sinergia em que o efeito combinado de dois ou mais agentes antimicrobianos, quando aplicados em conjunto seja maior do que quando aplicados separadamente. Teste para sinergia in vitro contra patógenos intracelulares é normalmente uma tarefa prodigiosa como permutações combinatórias de antibióticos em diferentes concentrações, devem ser avaliados. No entanto, descobrimos que nosso ensaio em tempo real combinada com automatizada, dispensando tecnologia digital permitted testes sinergia fácil. Usando estas abordagens, que foram capazes de levantamento sistematicamente acção de um grande número de agentes antimicrobianos sozinho e em combinação contra o patogénio intracelular, Legionella pneumophila.

Ensaio de crescimento intracelular em microplaca
Figura 1 esquematiza as etapas do ensaio. As etapas automatizadas mostradas podem ser realizadas manualmente. No entanto, o rendimento é grandemente facilitado com o uso de sistemas de manipulação de líquidos.
Figura 2 mostra resultados representativos de um ensaio em microplaca de 384 p...

Um ensaio de alto rendimento e em tempo real foi desenvolvido para identificar simultaneamente (1) antimicrobianos penetrantes em células eucarióticas direcionados a um patógeno bacteriano intracelular e (2) avaliar a citotoxicidade de células eucarióticas. Uma variação da mesma tecnologia foi posteriormente combinada com a tecnologia de dispensação digital para permitir estudos fáceis, de alta resolução, dose-resposta e sinergia bidimensional e tridimensional.

High Throughput, em tempo real, Teste Dual-leitura dos intracelular Actividade Antimicrobiana e citotoxicidade celular eucariótica

Traditional measures of intracellular antimicrobial activity and eukaryotic cell cytotoxicity rely on endpoint assays. Such endpoint assays require ...

O objetivo geral deste protocolo é utilizar um ensaio combinado em tempo real único para identificar inibidores específicos de pequenas moléculas que atuem no crescimento bacteriano intracelular e que sejam não tóxicos para as células hospedeiras. Este método pode ajudar a responder perguntas-chave na área de descoberta de agentes antimicrobianos. Especificamente, quais tipos de compostos conseguem penetrar nos compartimentos intracelulares e eliminar patógenos sem danificar a célula hospedeira?As principais vantagens dessa técnica são a detecção simultânea do crescimento bacteriano e da toxicidade em células de mamífero por meio de ensaios não destrutivos e em tempo real. Geralmente, indivíduos novos nesse método enfrentam dificuldades com a escalabilidade que ela oferece. Realizar ensaios com mais de dez mil compostos em uma sessão exige um conjunto totalmente novo de técnicas e equipamentos.Além de Lucius, demonstrando um compromisso coletivo com a descoberta acadêmica de antimicrobianos e a microbiologia diagnóstica translacional, estão os pesquisadores pós-doutorais KP Smith, Yoon-Suk Kang, Jennifer Tsang, Thea Brennan-Krohn e a aluna de graduação Kat Truelson. Para preparar as células hospedeiras, cultive o macrófago J774A.1 em suspensão em RPMI 1640, com soro de bezerro suplementado com nove por cento de ferro.Inicialmente, cultive as células em frascos de cultura de tecidos. Após as células atingirem confluência em um frasco de cultura de tecidos de 75 centímetros quadrados com 15 mililitros de meio, divida as células raspando-as e diluindo-as até 65 mililitros com o mesmo tipo de meio. Retorne 15 mililitros ao frasco de cultura de tecidos e transfira 50 mililitros para um frasco de agitação bacteriana de 250 mililitros.Agite definindo a velocidade de rotação em aproximadamente 120 rotações por minuto. Para um crescimento consistente, incube exatamente a cinco por cento de dióxido de carbono e 37 graus Celsius. Colete as células quando atingirem uma densidade na faixa de dois milhões e meio de células por mililitro a cinco milhões de células por mililitro.Certifique-se de que a porcentagem de células mortas não exceda 25 por cento, pois células mortas aumentarão o ruído de fundo em ensaios de citotoxicidade. É fundamental evitar a sedimentação celular em reservatórios ao dispensar grandes volumes de macrófagos e bactérias com dispensadores líquidos. Agite suavemente os reservatórios a cada poucos minutos durante a dispensação para evitar não uniformidade e variações entre os poços da placa do ensaio.Plaque as células em microplacas de 384 poços tratadas para cultura de tecidos, brancas, com 50.000 células em 30 microlitros de meio de cultura de tecidos por poço. Incube as microplacas durante a noite para atingir noventa por cento de confluência no dia do experimento. Prepare colônias de bactérias para os experimentos, espalhando os organismos abundantemente em uma nova placa BCYE e incubando por um dia para obter crescimento confluente.Re-suspenda os organismos no mesmo meio de cultura de tecidos utilizado para as células J774A.1. Para realizar a infecção de macrófagos, adicione os compostos de interesse em teste, incluindo compostos de triagem, e controles positivo e negativo para inibição do crescimento bacteriano na lise de células eucarióticas.As soluções estoque devem ser dissolvidas em DMSO ou em uma solução aquosa em concentração maior ou igual a 500x, para permitir uma diluição suficiente do veículo. Dilua as bactérias luminescentes até uma concentração-alvo de dois milhões e meio de UFC por mililitro em meio de cultura de tecidos. Em seguida, adicione corante fluorescente impermeável à membrana e não tóxico para ácidos nucleicos na concentração final de 2,5x no ensaio.Adicione 20 microlitros dessa mistura a cada poço de cultura. O volume final do ensaio é de 50 microlitros e a concentração bacteriana final deve ser de um milhão de UFC por mililitro para o repórter lux epron, ou quatro milhões de UFC por mililitro para o repórter de proteína fluorescente. Incube a 37 graus Celsius, por um a três dias, em 5% de dióxido de carbono e umidade relativa de 100% para prevenir efeitos de borda por evaporação.Para evitar efeitos de borda associados à temperatura ao ler os resultados do ensaio, equilibre termicamente as microplacas antes da leitura de luminiscência, colocando-as em uma única camada sobre a bancada do laboratório com as tampas entreabertas por aproximadamente 20 minutos. Leia o crescimento bacteriano e a toxicidade em células eucarióticas em um luminômetro e fluorômetro de microplacas, conforme apropriado para os repórteres utilizados. Devolva as microplacas ao incubador, caso se deseje leitura em tempo real em pontos temporais posteriores.Analise os dados conforme descrito no protocolo do texto. Para experimentos de resposta à dose e testes de sinergia, prepare macrófagos em bactérias como antes. Imediatamente antes da infecção de macrófagos ou incubação axênica, utilize um sistema automatizado de manipulação de líquidos para facilitar a configuração da resposta a dose única em testes de sinergia combinatória, por meio da adição automatizada direta de diluições de antimicrobianos de acordo com o protocolo do fabricante.Adicione antimicrobianos de interesse experimental em uma série de dilui&ccedil;&atilde;o dupla serial. O objetivo &eacute; abranger, na extremidade superior, uma concentra&ccedil;&atilde;o que elimine completamente o crescimento, e na extremidade inferior, uma concentra&ccedil;&atilde;o que n&atilde;o apresente atividade evidente. Aqui s&atilde;o mostrados resultados representativos ao longo do tempo para a luminesc&ecirc;ncia bacteriana e a fluoresc&ecirc;ncia associada &agrave; citotoxicidade.Observe os efeitos contrastantes do tratamento antimicrobiano e do detergente citotóxico para células eucarióticas. A determinação dual da resposta à dose de CI50 e CC50 nos mesmos poços de triagem foi utilizada para avaliar a seletividade da antibioticoterapia com Doxiciclina. A replicação bacteriana foi inibida por concentrações intermediárias do antibiótico.No entanto, observou-se citotoxicidade em altas concentrações, consistente com a seletividade de aproximadamente 100. O mesmo formato de ensaio foi utilizado para testar a resposta bidimensional à dose para combinações de Minociclina e Azitromicina. As isocontornos conectam pontos de inibição igual do crescimento intracelular.Aqui, isocontornos côncavos sugeriram fortes efeitos sinérgicos para os dois medicamentos. A robótica de dispensação digital para configuração do ensaio, leitura em tempo real e formato de alto rendimento permitiu a realização de testes de sinergia tripla. Neste caso, a observação de uma superfície nitidamente côncava sugere um alto grau de efeito sinérgico para combinações de Minociclina, Azitromicina e Rifampicina contra o crescimento intracelular de *Legionella pneumophila*.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como combinar a leitura de ensaios fluorescentes ou luminiscentes com testes de citotoxicidade em tempo real, em formato de ensaio de alto rendimento. Após este procedimento, outros métodos, como microscopia confocal, podem ser aplicados para responder perguntas sobre eventos biológicos na célula inteira, que também estão relacionados à sua atividade antimicrobiana ou citotoxicidade em células inteiras. Embora tenhamos estudado os efeitos sobre a replicação de legionella, as mesmas técnicas também podem ser aplicadas a outros patógenos intracelulares, como Brucella e microbactérias.Nós inicialmente concebemos este protocolo ao tentar desenvolver um ensaio simples e confiável o suficiente para ser utilizado em um formato de triagem de muito alto rendimento. Não se esqueça de que trabalhar com patógenos bacterianos, linhagens celulares e equipamentos robóticos apresenta alguns riscos inerentes e precauções apropriadas devem ser tomadas, como o uso de equipamentos de proteção individual adequados durante a realização deste procedimento.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Descrevemos uma única célula ensaio de elevado débito para medir a citotoxicidade de células T, quando incubado com as células-alvo tumorais. Este método emprega uma matriz elastomérica denso, de sub-nanolitro poços (~ 100000 poços matriz /) para confinar espacialmente as células T e as células alvo em proporções definidas e está acoplado a microscopia de fluorescência para monitorizar alvo efetuador conjugação e apoptose subsequente.

Quantitativo de alta capacidade ensaio de citotoxicidade de célula única para as células T.

As células de mamífero que expressam a cassete de gene de bioluminescência...

Células de mamíferos autonomamente bioluminescentes para monitoramento contínuo e em tempo real de citotoxicidade

Aqui, descrevemos a citotoxicidade celular e ensaios de infecciosidade redondas únicas que permitem a triagem rápida e exacta de compostos para determinar a sua citotoxicidade celular (CC 50) e os valores de IC50 contra a WT e resistentes de HIV-1 da droga.

Triagem rápida de HIV transcriptase reversa e integrase Inibidores

Ensaios aprimorados de neurotoxicidade in vitro ajudariam na identificação de novos compostos neuroprotetores. A utilidade de um analisador celular baseado em impedância em tempo real para determinar a citotoxicidade e citoproteção em linhagens celulares neuronais e delinear o envolvimento das vias do segundo mensageiro, obtendo assim informações sobre o mecanismo de neuroproteção é apresentada.

Analyzer celular baseado em impedância Real-Time como uma ferramenta para delinear vias moleculares envolvidas na neurotoxicidade e neuroproteção em uma linha de células neuronais

O ensaio de citotoxicidade de sangue total (WCA) é um ensaio de citotoxicidade desenvolvido mediante a incorporação de alto rendimento tecnologia de posicionamento de célula com microscopia de fluorescência e de processamento de imagem automatizado. Aqui, nós descrevemos como células de linfoma tratadas com um anticorpo anti-CD20 pode ser analisada em tempo real no sangue humano inteiro para fornecer uma análise quantitativa da citotoxicidade celular.

Em tempo real de Citotoxicidade em Sangue Total Humano

Nós desenvolvemos um sistema de rastreio de alto rendimento modular para descobrir novos compostos contra o Mycobacterium tuberculosis, direccionamento intracelular e em caldo de crescimento de bactérias, bem como a citotoxicidade contra a célula hospedeira de mamífero.

Sistema de Eficácia e citotoxicidade Rastreio de inibidores Segmentação intracelular<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

Novos modelos e ensaios que melhorariam o processo inicial de desenvolvimento de medicamentos para a próxima geração de medicamentos antituberculose são altamente desejáveis. Aqui, descrevemos um ensaio rápido, barato e compatível com BSL-2 para avaliar a eficácia do medicamento contra Mycobacterium tuberculosis que pode ser facilmente adaptado para triagem de alto rendimento.

Um ensaio Compatível de alta capacidade para avaliar droga Eficácia contra macrófagos passadas<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

Muitas vezes é necessário avaliar a citotoxicidade potencial de um conjunto de compostos em células cultivadas. Aqui, nós descrevemos uma estratégia para tela confiável para compostos tóxicos em um formato 96-well.

Uma estratégia para identificar compostos que afetam o crescimento celular e sobrevivência em células de mamíferos cultivadas em baixa a moderada taxa de transferência

O protocolo descreve um ensaio rápido, de alto rendimento, confiável, barato e imparcial para determinar eficientemente a viabilidade celular. Este ensaio é particularmente útil quando as mitocôndrias das células foram danificadas, o que interfere com outros ensaios. O ensaio utiliza a contagem automatizada de células manchadas com dois corantes nucleares – Hoechst 33342 e iodeto de propidium.

Um ensaio automatizado de coloração nuclear diferencial para determinação precisa da citotoxicidade mitocana

Aqui, descrevemos um método para criar gotículas de emulsão dupla encapsulando uma célula T e uma célula-alvo cancerígena para examinar a morte celular no nível de uma única célula. Este método permite a quantificação dupla de moléculas citotóxicas e apoptose de células-alvo em uma grande população de células T.

Ensaio de citotoxicidade baseado em gotículas para avaliar células T receptoras de antígeno quimérico no nível de célula única

Aqui, apresentamos um protocolo para identificar potenciais candidatos a medicamentos antituberculosos por meio de triagem fenotípica, abrangendo a síntese química de um composto de 4-aminoquinolina, a determinação de sua concentração inibitória mínima contra Mycobacterium tuberculosis e a avaliação de sua citotoxicidade em linhagens celulares de mamíferos.

Identificação de Potenciais Candidatos Anti-TB: Um Guia Passo a Passo para Síntese, Determinação de CMI e Avaliação de Citotoxicidade em Células de Mamíferos

Aprenda a realizar ensaios de alta vazão em tempo real para identificar antimicrobianos intracelulares não tóxicos para células hospedeiras. Este método permite detectar simultaneamente o crescimento bacteriano e a citotoxicidade celular usando técnicas não destrutivas.

High Throughput, em tempo real, Teste Dual-leitura dos intracelular Actividade Antimicrobiana e citotoxicidade celular eucariótica (Vídeo) | JoVE Journal

High Throughput, em tempo real, Teste Dual-leitura dos intracelular Actividade Antimicrobiana e citotoxicidade celular eucariótica

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