High Throughput, em tempo real, Teste Dual-leitura dos intracelular Actividade Antimicrobiana e citotoxicidade celular eucariótica

O objetivo geral deste protocolo é usar um único ensaio combinado em tempo real para identificar inibidores específicos de pequenas moléculas do crescimento bacteriano intracelular que não são tóxicos para as células hospedeiras. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da descoberta de antimicrobianos. Especificamente, que tipos de compostos podem penetrar nos compartimentos intracelulares e matar patógenos sem prejudicar a célula hospedeira?

As principais vantagens desta técnica são o crescimento bacteriano da toxicidade de células de mamíferos são detectadas simultaneamente usando ensaios não destrutivos em tempo real. Geralmente, os indivíduos novos nesse método terão dificuldades com a escalabilidade que ele oferece. Testar mais de dez mil compostos em uma sessão requer um novo conjunto de técnicas e equipamentos.

Além de Lucius, demonstrando um compromisso comunitário com a descoberta acadêmica de antimicrobianos e microbiologia diagnóstica translacional estão os bolsistas de pós-doutorado, KP Smith, Yoon-Suk Kang, Jennifer Tsang, Thea Brennan-Krohn e a estudante Kat Truelson. Para preparar as células hospedeiras, cultive J774A. 1 macrófago está em suspensão em RPMI 1640, com nove por cento de soro de bezerro suplementado com ferro.

Inicialmente, células de passagem em frascos de cultura de tecidos. Depois que as células se tornarem confluentes em um frasco de cultura de tecidos de 75 centímetros quadrados em 15 mililitros de meio, divida as células raspando-as e diluindo-as em 65 mililitros com o mesmo tipo de meio. Retorne 15 mililitros para o frasco de cultura de tecidos e transfira 50 mililitros para um frasco agitador bacteriano de 250 mililitros.

Arejar regulando a velocidade de rotação em cerca de 120 rotações por minuto. Para um crescimento consistente, incube a exatamente cinco por cento de dióxido de carbono e 37 graus Celsius. Colha as células quando atingirem uma densidade na faixa de dois vírgula cinco milhões de células por mililitro a cinco milhões de células por mililitro.

Certifique-se de que a porcentagem de células mortas não exceda 25%, pois as células mortas aumentarão o ruído de fundo nos ensaios de citotoxicidade. É fundamental evitar que as células se instalem em reservatórios quando você está dispensando grandes volumes de macrófagos e bactérias com manipuladores de líquidos. Agite os reservatórios a cada poucos minutos durante a distribuição para evitar a não uniformidade e os poços da placa de ensaio.

Plaquear as células em cultura de tecidos brancos tratadas, microplacas de 384 poços a 50.000 células em 30 microlitros de meio de cultura de tecidos por poço. Incube as microplacas durante a noite para atingir noventa por cento de confluência no dia do experimento. Prepare manchas de bactérias para experimentos, espalhando organismos densamente em uma nova placa BCYE e incubando um dia para obter crescimento confluente.

Ressuspenda os organismos no mesmo meio de cultura de tecidos usado para as células J774A. 1. Para realizar a infecção por macrófagos, adicione compostos de teste de interesse, incluindo compostos de triagem e controles positivos e negativos para inibição do crescimento bacteriano na lise de células eucarióticas.

As soluções-mãe devem ser dissolvidas a mais ou igual a 500x em DMSO ou em solução aquosa, para permitir uma diluição suficiente do veículo. Diluir as bactérias luminescentes até atingir dois vírgula cinco milhões de UFC por mililitro em meio de cultura de tecidos. Em seguida, adicione o corante de detecção de ácido nucleico impermeável de membrana não tóxico apropriado em dois pontos cinco x a concentração final do ensaio.

Adicione 20 microlitros desta mistura a cada poço de cultura. O volume final do ensaio é de 50 microlitros e a concentração bacteriana final deve ser de um milhão de UFC por mililitro para o repórter lux epron ou quatro milhões de UFC por mililitro para o repórter de proteína fluorescente. Incube a 37 graus Celsius, por um a três dias em cinco por cento de dióxido de carbono a 100 por cento de umidade relativa para evitar efeitos de borda evaporativa.

Para evitar efeitos de borda associados à temperatura ao ler os resultados do ensaio, equilibre termicamente as microplacas antes da leitura de luminescência, colocando-as em uma única camada em uma bancada de laboratório com as tampas entreabertas por aproximadamente 20 minutos. Leia o crescimento bacteriano e a toxicidade das células eucarióticas em um luminômetro de microplaca e fluorômetro, conforme apropriado para os repórteres que estão sendo usados. Retorne as microplacas para a incubadora se desejar a leitura em tempo real em momentos posteriores.

Analise os dados conforme descrito no protocolo de texto. Para experimentos de resposta à dose e teste de sinergia, prepare macrófagos em bactérias como antes. Pouco antes da infecção por macrófagos ou incubação axênica, use um sistema automatizado de manuseio de líquidos para facilitar a resposta de dose única em testes de sinergia combinatória configurados por meio da adição automatizada direta de diluições antimicrobianas de acordo com o protocolo do fabricante.

Adicionar antimicrobianos de interesse experimental numa série de diluições de duplicação em série. O objetivo é abranger, na extremidade superior, uma concentração que elimine completamente o crescimento e, na extremidade inferior, uma concentração que não mostre atividade óbvia. Aqui são mostrados resultados representativos ao longo do tempo para luminescência bacteriana e fluorescência associada à citotoxicidade.

Observe os efeitos contrastantes do tratamento antimicrobiano e do detergente citotóxico de células eucarióticas. A determinação da resposta à dose dupla de IC50 e CC50 nos mesmos poços de triagem foi usada para determinar a seletividade do antibiótico doxiciclina. A replicação bacteriana foi inibida por concentrações intermediárias de antibiótico.

No entanto, a citotoxicidade foi observada em altas concentrações consistentes com a seletividade de aproximadamente 100. O mesmo formato de ensaio foi usado para testar a resposta à dose bidimensional para combinações de minociclina e azitromicina. Os isocontornos conectam pontos de igual inibição do crescimento intracelular.

Aqui, isocontornos côncavos sugeriram fortes efeitos sinérgicos para as duas drogas. A robótica de distribuição digital para configuração do ensaio, leitura em tempo real e formato de alto rendimento permitiu testes combinatórios de sinergia tripla. Aqui, a observação de uma superfície distintamente côncava sugere um alto grau de efeito sinérgico para combinações de minociclina, azitromicina e rifampicina contra o crescimento intracelular de legionella pheumophila.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como combinar a leitura de ensaios fluorescentes ou luminescentes com testes de citotoxicidade em tempo real em formato de ensaio de alto rendimento. Após este procedimento, outros métodos como o microscópio confocal podem ser aplicados para responder a perguntas sobre eventos biológicos em toda a célula, que também estão localizados com sua atividade antimicrobiana ou citotoxicidade de células inteiras. Embora tenhamos estudado os efeitos na replicação da legionella, as mesmas técnicas também podem ser aplicadas a outros patógenos intracelulares, como Brucella e microbactérias.

Concebemos este protocolo pela primeira vez ao tentar descobrir um ensaio simples e confiável o suficiente para usar em um formato de triagem de alto rendimento. Não se esqueça de que trabalhar com patógenos bacterianos, linhagens celulares e equipamentos robóticos tem alguns riscos inerentes e as devidas precauções devem ser tomadas, como o uso de equipamentos de proteção individual adequados durante a execução deste procedimento.