Sistema de Eficácia e citotoxicidade Rastreio de inibidores Segmentação intracelular Mycobacterium tuberculosis

O objetivo geral deste protocolo é fornecer uma avaliação multidimensional de como os compostos afetam a sobrevivência do M. tuberculosis dentro de macrófagos humanos. Este método é centrado em um ensaio de eficácia baseado em luciferase. Quando combinado com citotoxicidade, um ensaio de CIM pode fornecer informações úteis sobre a modificação de compostos de TIH no desenvolvimento de medicamentos para TB.

A principal vantagem do nosso método é que ele economiza tempo e trabalho. Ele está substituindo um ensaio de unidade formadora de colônia CFU por um ensaio baseado em luciferase. Geralmente, os indivíduos novos nessa técnica terão dificuldade com a consistência com a pipetagem manual em vez da automação.

Uma técnica de pipetagem consistente é crucial. Cultive células THP1 em RPMI em meio completo. Mantendo uma densidade celular de 0,2 a um milhão de células por mililitro de meio entre as passagens.

Use um espectrofotômetro para medir o OD600 de uma suspensão bacteriana em crescimento ativo. Em seguida, calcule a densidade bacteriana usando o fator de conversão de 0,1 OD600 é igual a três vezes 10 elevado à sétima bactéria por mililitro. Pipete bactérias suficientes para um MOI de 10 para um em um novo tubo de centrífuga.

Em seguida, esfole as bactérias a 3.000 vezes G por 10 minutos. Para opsonizar as bactérias, adicione 50 microlitros de soro humano a 450 microlitros de RPMI 1640 e use-o para ressuspender o pellet bacteriano a uma densidade de uma vezes 10 elevado à oitava bactéria por 500 microlitros de meio. Deixe a mistura incubar a 37 graus Celsius por 30 minutos.

Em seguida, usando um hemocitômetro e um microscópio invertido, determine a densidade da cultura de células THP1. Em seguida, em tubos de centrífuga estéreis, pulverize as células a 100 vezes G em 37 graus Celsius por 10 minutos. Aspirar o sobrenadante e ressuspender as células em RPMI em meio completo a uma densidade de um milhão de células por mililitro.

Adicionar PMA a uma concentração final de 40 nanogramas por mililitro. Esta é uma mistura de diferenciação. M.tuberculosis opsonizado combinado com mistura de diferenciação THP1 em um MOI de 10 para um.

E alíquota da mistura final a 100 microlitros por poço em uma placa de fundo plano branco de 96 poços. Em seguida, permita que a diferenciação e a infecção incubem a 37 graus Celsius em uma incubadora umidificada contendo 5% de dióxido de carbono durante a noite. No dia seguinte, use 100 microlitros de RPMI para lavar os poços duas vezes.

Em seguida, adicione compostos diluídos nas concentrações desejadas e RPMI em meio completo. Incube as placas por três dias. Ao usar pipetas multicanal, lembre-se de praticar a ação lenta e constante do êmbolo e sempre colocar as pontas da pipeta no mesmo local dentro de cada poço para minimizar a perturbação das células THP1.

Após a incubação, aspire o meio dos poços e adicione 50 microlitros de reagente de ensaio de luciferase a cada poço. Em seguida, use selantes de placas adesivas transparentes para selar as placas. Incube as placas a 22 graus Celsius por cinco minutos e, em seguida, use um luminômetro para obter uma leitura de um segundo por poço.

Para diferenciar as células THP1, depois de preparar a mistura de diferenciação, conforme demonstrado anteriormente neste vídeo, dispense 100 microlitros da mistura de diferenciação em cada poço de uma placa transparente de células de 96 poços. Incube as células a 37 graus Celsius em uma incubadora umidificada com 5% de dióxido de carbono durante a noite. No dia seguinte, aspire o meio dos poços e use RPMI 1640 para lavá-los duas vezes.

Adicione 100 microlitros de compostos diluídos em RPMI incompletos aos poços. Em seguida, incube as células por três dias. Dissolva 0,5 gramas de MTT em 100 mililitros de PBS para fazer uma solução estoque de cinco miligramas por mililitro.

Em seguida, filtre e esterilize a solução. Duas horas e meia antes do final do período de incubação de três dias, adicione 25 microlitros de solução de MTT a cada poço de células e complete o período de incubação. Prepare 50% NN dimetilformamida ou DMF misturando 250 mililitros de DMF com 250 mililitros de água deionizada.

Prepare o tampão de extração MTT da seguinte maneira. Coloque 100 gramas de SDS em uma garrafa de 500 mililitros e adicione 300 mililitros de 50% de DMF. Aplique fogo baixo para permitir que o SDS se dissolva.

Adicione 10 mililitros de ácido acético puro e 12,5 mililitros de ácido clorídrico de um molar. Em seguida, use 50% DMF para encher a garrafa até a marca de 500 mililitros. No final do período de tratamento, adicione 100 microlitros de tampão de extração a cada poço.

Incube a mistura a 37 graus Celsius em uma incubadora umidificada contendo 5% de dióxido de carbono durante a noite. No dia seguinte, leia a absorbância em 570 nanômetros. Para realizar um ensaio de resazurina, cultive M.tuberculosis em 7H9 ADST até a fase de bloqueio médio.

Diluir a cultura com 7H9 ADST até um OD600 de 0,01. Use 7H9 ADST para diluir os compostos para duas vezes as concentrações de teste. E alíquota de 100 microlitros de cada composto diluído em cada poço de uma placa clara de 96 poços.

Transfira 100 microlitros da suspensão bacteriana diluída para cada poço. Incube as placas a 37 graus Celsius em uma incubadora umidificada por cinco dias. Dissolva 10 miligramas de resazurina em 100 mililitros de água deionizada.

E esterilize o filtro da solução. Adicione 30 microlitros de solução de resazurina aos poços. Em seguida, incube as células por 48 horas.

O crescimento bacteriano é indicado por uma conversão de cor de azul para rosa. Realize análises quantitativas de acordo com o protocolo de texto. Este gráfico de dispersão mostra os dados brutos de luminescência medidos em unidades de luminescência relativa para o tratamento de várias concentrações de rifampicina em células M. tuberculosis e THP1.

Neste gráfico, é mostrada a porcentagem de redução e luminescência em poços tratados em comparação com poços não tratados. A rifampicina é capaz de reduzir 99,9% das unidades de luz relativa, ou RLUs, de M.tuberculosis intracelular a uma concentração de 0,1 microgramas por mililitro. Semelhante aos resultados publicados anteriormente determinados a partir de UFC.

Nesta figura, a citotoxicidade causada pelo aumento das concentrações de G1-1H usadas no ensaio MTT é ilustrada. Concentrações de 10 e três micromolares estão claramente abaixo do ponto de corte IC 50. Esta figura mostra os efeitos de várias concentrações do antibiótico apramicina na conversão da resazurina por M. tuberculosis.

O MIC90 no caldo estava entre 2,5 e cinco microgramas por mililitro. Isso é um pouco maior do que o valor publicado anteriormente de 1,5 microgramas por mililitro. Mas ainda está bem dentro da faixa aceitável.

Como demonstrado aqui, a evaporação torna-se significativa para todos os experimentos com tempos de incubação prolongados. Portanto, deve-se tomar cuidado para manter as incubadoras bem umidificadas para evitar inconsistências. Uma vez dominada, essa técnica pode fornecer dados intracelulares confiáveis em menos de quatro dias.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de ser gentil com as células THP1 e ser consistente com a pipetagem se tentar sem automação. Após este procedimento, outros métodos, como triagem de alto conteúdo, podem ser usados para determinar se os compostos de hit são bacteriostáticos ou bactericidas. Após seu desenvolvimento, este protocolo abriu caminho para pesquisadores no campo da descoberta de medicamentos para tuberculose avaliarem rapidamente a eficácia do composto contra MTB dentro de macrófagos humanos.

Não se esqueça de que trabalhar com microbactéria tuberculose é perigoso. Use precauções e equipamentos adequados ao manusear este microrganismo.