Sistema de Eficácia e citotoxicidade Rastreio de inibidores Segmentação intracelular

O objetivo geral deste protocolo é fornecer uma avaliação multidimensional de como compostos afetam a sobrevivência de M. tuberculosis dentro de macrófagos humanos. Este método baseia-se em um ensaio de eficácia baseado em luciferase. Quando combinado com um ensaio de citotoxicidade e MIC, pode fornecer informações úteis sobre a modificação de compostos HIT no desenvolvimento de fármacos para tuberculose.

A principal vantagem do nosso método é que ele economiza tempo e mão de obra. Ele substitui um ensaio de unidade formadora de colônia (UFC) por um ensaio baseado em luciferase. Geralmente, indivíduos novos nesta técnica enfrentam dificuldades com a consistência na pipetagem manual em vez da automação.

Uma técnica consistente de pipetagem é crucial. Cultive as células THP1 em RPMI em meio completo, mantendo uma densidade celular de 0,2 a um milhão de células por mililitro de meio entre os subcultivos.

Utilize um espectrofotômetro para medir a DO600 de uma suspensão bacteriana em crescimento ativo. Em seguida, calcule a densidade bacteriana utilizando o fator de conversão de 0,1 DO600 equivalente a três vezes 10 elevado à sétima bactérias por mililitro. Pipete uma quantidade suficiente de bactérias para uma razão de infecção (MOI) de 10 para 1 em um novo tubo de centrífuga.

Em seguida, pelletize as bactérias a 3.000 × g por 10 minutos. Para opsonizar as bactérias, adicione 50 microlitros de soro humano a 450 microlitros de RPMI 1640 e use a mistura para ressuspender o pellet bacteriano numa densidade de 1 × 10⁸ bactérias por 500 microlitros de meio. Incube a mistura a 37 °C por 30 minutos.

Em seguida, utilizando um hemocitômetro e um microscópio invertido, determine a densidade do cultivo celular de THP1. Então, em tubos de centrífuga estéreis, faça o pellet das células a 100 vezes G a 37 graus Celsius por 10 minutos. Aspire o sobrenatante e resuspenda as células em RPMI em meio completo com uma densidade de um milhão de células por mililitro.

Adicione PMA até uma concentração final de 40 nanogramas por mililitro. Esta é a mistura de diferenciação. Combine M. tuberculosis opsonizado com a mistura de diferenciação THP1 em uma razão MOI de 10 para 1.

E alíquota a mistura final em 100 microlitros por poço em uma placa branca de fundo plano de 96 poços. Em seguida, permita que a diferenciação e a infecção incubem a 37 graus Celsius em uma estufa umidificada contendo 5% de dióxido de carbono durante a noite. No dia seguinte, use 100 microlitros de RPMI para lavar os poços duas vezes.

Em seguida, adicione os compostos diluídos às concentrações desejadas e RPMI em meio completo. Incube as placas por três dias. Ao usar pipetas multicanais, lembre-se de realizar uma ação lenta e constante no êmbolo e sempre posicionar as ponteiras no mesmo local dentro de cada poço para minimizar a perturbação das células THP1.

Após a incubação, aspire o meio dos poços e adicione 50 microlitros de reagente de ensaio de luciferase a cada poço. Em seguida, utilize seladores adesivos transparentes para placas para vedar as placas. Incube as placas a 22 graus Celsius por cinco minutos e, então, use um luminômetro para obter a leitura em um segundo por poço.

Para diferenciar as células THP1, após preparar a mistura de diferenciação conforme demonstrado anteriormente neste vídeo, distribua 100 microlitros da mistura de diferenciação em cada poço de uma placa de 96 poços transparente contendo células. Incube as células a 37 graus Celsius em uma incubadora umidificada com 5% de dióxido de carbono durante a noite. No dia seguinte, aspire o meio dos poços e use RPMI 1640 para lavá-los duas vezes.

Adicione 100 microlitros de compostos diluídos em RPMI incompleto aos poços. Em seguida, incube as células por três dias. Dissolva 0,5 gramas de MTT em 100 mililitros de PBS para preparar uma solução estoque de cinco miligramas por mililitro.

Em seguida, esterilize a solução por filtração. Duas horas e meia antes do final do período de incubação de três dias, adicione 25 microlitros da solução de MTT a cada poço de células e complete o período de incubação. Prepare 50% NN de dimetilformamida ou DMF misturando 250 mililitros de DMF com 250 mililitros de água deionizada.

Prepare o tampão de extração de MTT da seguinte forma. Coloque 100 gramas de SDS em um frasco de 500 mililitros e adicione 300 mililitros de DMF a 50%. Aplique calor baixo para permitir a dissolução do SDS.

Adicione 10 mililitros de ácido acético puro e 12,5 mililitros de ácido clorídrico um molar. Em seguida, use DMF 50% para completar o frasco até a marca de 500 mililitros. Ao final do período de tratamento, adicione 100 microlitros de tampão de extração a cada poço.

Incube a mistura a 37 graus Celsius em uma estufa umidificada contendo 5% de dióxido de carbono durante a noite. No dia seguinte, leia a absorbância em 570 nanômetros. Para realizar um ensaio de resazurina, cultive M.tuberculosis em 7H9 ADST até a fase de crescimento exponencial.

Dilua a cultura com 7H9 ADST até uma DO600 de 0,01. Use 7H9 ADST para diluir os compostos até duas vezes as concentrações de teste. Em seguida, alíquota 100 microlitros de cada composto diluído em cada poço de uma placa clara de 96 poços.

Transfira 100 microlitros da suspensão bacteriana diluída para cada poço. Incube as placas a 37 graus Celsius em uma estufa umidificada por cinco dias. Dissolva 10 miligramas de resazurina em 100 mililitros de água deionizada.

E filtre esterilize a solução. Adicione 30 microlitros de solução de resazurina aos poços. Em seguida, incube as células por 48 horas.

O crescimento bacteriano é indicado por uma mudança de cor de azul para rosa. Realize a análise quantitativa de acordo com o protocolo descrito no texto. Este gráfico de dispersão mostra os dados brutos de luminescência medidos em unidades de luminescência relativa para o tratamento com várias concentrações de rifampicina em células de M. tuberculosis e THP1.

Neste gráfico, é mostrada a porcentagem de redução e luminiscência em poços tratados em comparação com poços não tratados. A rifampicina é capaz de reduzir 99,9% das unidades relativas de luz, ou RLUs, do Mycobacterium tuberculosis intracelular, numa concentração de 0,1 microgramas por mililitro. Semelhante aos resultados previamente publicados determinados a partir de UFC.

Nesta figura, ilustra-se a citotoxicidade causada por concentrações crescentes de G1-1H utilizadas no ensaio de MTT. As concentrações de 10 e três micromolares estão claramente abaixo do limite de IC 50. Esta figura mostra os efeitos de várias concentrações do antibiótico apramicina na conversão de resazurina por M. tuberculosis.

A MIC90 em caldo estava entre 2,5 e cinco microgramas por mililitro. Isso é ligeiramente mais alto do que o valor previamente publicado de 1,5 micrograma por mililitro. Mas ainda está bem dentro do intervalo aceitável.

Como demonstrado aqui, a evaporação torna-se significativa em todos os experimentos com tempos prolongados de incubação. Portanto, é necessário ter cuidado para manter os incubadores bem umidificados, evitando assim inconsistências. Após dominada, esta técnica pode fornecer dados intracelulares confiáveis em apenas quatro dias.

Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de manipular as células THP1 com cuidado e ser consistente na pipetagem, caso o procedimento seja realizado sem automação. Após este procedimento, outros métodos, como triagem de alto conteúdo, podem ser utilizados para determinar se os compostos ativos são bacteriostáticos ou bactericidas. Após seu desenvolvimento, este protocolo abriu caminho para que pesquisadores na área da descoberta de fármacos contra a tuberculose pudessem avaliar rapidamente a eficácia de compostos frente ao MTB no interior de macrófagos humanos.

Não se esqueça de que trabalhar com Mycobacterium tuberculosis é perigoso. Utilize precauções e equipamentos adequados ao manipular este microrganismo.