Name: Manipulação de epileptiforme Electrocorticograms (ECoGs) e do sono em ratos e camundongos por Acupuntura (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 6 s
Description: Aprenda a avaliar epilepsia e sono em modelos de roedores usando acupuntura e eletrocorticograma. Este método demonstra como implantar eletrodos e analisar padrões de atividade cerebral.

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Este trabalho foi apoiado pelas concessões do Ministério da Ciência e Tecnologia (MOST) MOST104-2410-H-002-053 & NSC99-2320-B-002-026-MY3. Este manuscrito foi editado e revisado pelo Sr. Brian Chang, que tem experiência na revisão de documentos profissionais.

Todos os protocolos experimentais são aprovados pelo Comitê Institucional de Animal Care and Use (IACUC) da Universidade Nacional de Taiwan. 1. Cirurgia estereotáxica para implantação ECoG Eletrodos, Eletrodos EMG, Brain Termistor e Guia Injection cânula <ol><li> Para os ratos (250-350 g, ratos Sprague-Dawley machos com 6 a 8 semanas de idade) <ol><li> Anestesiar os ratos por injecção IP com 50 mg / kg de Zoletil. Confirmar a profundidade adequada da anestesia, observando a falta de resposta após beliscar a pata traseira. Aplicar pomada, raspar a pele, e esterilizar a pele com solução de iodo-povidona e 75% de etanol. Injectar um antibiótico (penicilina G) para prevenir a infecção. </li><li> Prepare bisturis, tesouras, hemostats, gazes e máquina de cautério para a cirurgia. Esterilizar engrenagem cirúrgica e gazes por uma autoclave ea cauterização por 75% de etanol. </li><li> Coloque uma barra de ouvido no canal do ouvido e montar o rato ao estereotaxia. </li><li> utilizaçãoum bisturi, fazer uma incisão na linha média de 2 cm aproximadamente no crânio ao longo de uma linha entre dois ouvidos, movendo-se caudalmente. Clipe os retalhos de pele com hemostats para expor o crânio e remover o tecido sobre o crânio com um bisturi. </li><li> Broca oito furos (F1, F2, P1, P2, O1, O2, R1, e R2), cada um aproximadamente 0,7 mm de diâmetro, sobre o crânio com uma ferramenta rotativa. Parafuso oito eletrodos ECoG sobre os lobos frontal, parietal e occipital e do cerebelo em ambos os hemisférios esquerdo e direito. Estes eléctrodos são utilizados para a detecção de epilepsia focal. <ol><li> Use as seguintes coordenadas para os eletrodos de gravação: frontal (F1 e F2): +2,0 mm anterior ao bregma e 2,5 milímetros da linha média, parietal (P1 e P2): -2,0 mm anterior ao bregma e 3,0 milímetros da linha média , e occipital (O1 e O2): -5,5 mm anterior ao bregma e 3,0 milímetros da linha média. </li><li> Coloque dois eléctrodos de referência (R1 e R2) em relação ao cerebelo (-11,0 mm anterior ao bregma e 4,0 milímetros a partir do midline). </li></ol></li><li> Em grupos separados de ratos, faça três furos e colocar dois eletrodos de EEG parafuso sobre o frontal direita (F2) e lobos parietais (P2) dos córtices com as mesmas coordenadas como descrito no passo 1.1.5.1. Coloque um terceiro eletrodo EEG sobre o cerebelo esquerdo (R1), que serve para aterrar a animais e reduzir os artefatos de sinal. Estes eletrodos são usados ​​para confirmar a epilepsia generalizada e analisar as fases de vigilância. </li><li> Separar a pele do pescoço e músculo e inserir dois eletrodos EMG no músculo do pescoço. </li><li> Broca outro orifício no crânio e colocar uma cânula guia de microinjecção para a esquerda CEA (AP, 2,8 mm a partir da bregma; mL, 4,2 mm; DV, 7,8 milímetros em relação ao bregma) em ratos. As coordenadas são adaptados a partir da Paxinos e Watson atlas rato 10. </li><li> Perfurar um furo maior (com um diâmetro de 1,6 mm) no crânio e inserir um termistor 30 kV calibrada na superfície do córtex parietal, que será mais tarde cimentada, a monitor a temperatura cortical em ratos. </li><li> Use gaze e cautério para parar o sangramento quando ele ocorre. </li><li> Passe os condutores isolados dos eletrodos ECoG e eletrodos EMG a um pedestal e ligue o termistor para a corda. Cimentar o pedestal e guia de uma cânula para o crânio com acrílico dental. </li><li> Tratar a incisão topicamente com polysporin (bacitracina-zinco / sulfato de polimixina B) para prevenir a infecção. Dê os animais tanto ibuprofeno e penicilina G na água durante uma semana após a cirurgia. </li></ol></li><li> Para ratinhos (20 - 30 g ratos, de 6 a 8 semanas de idade C57BL / C) <ol><li> Anestesiar os ratos por injecção IP com 50 mg / kg de Zoletil e confirmar a correcta profundidade da anestesia através da observação de uma falta de resposta após a beliscar a pata traseira. Aplicar pomada. Depois de raspar a pele, esterilizar a pele com solução de iodo-povidona e 75% de etanol. Injectar um antibiótico (penicilina G) para prevenir a infecção. </li><li> Coloque uma barra de ouvido no canal do ouvido emontar o mouse para a estereotaxia. </li><li> Usando um bisturi, fazer uma incisão na linha média de 1,5 cm aproximadamente no crânio ao longo de uma linha entre as duas orelhas, movendo-se caudalmente. Clipe os retalhos de pele com hemostats para expor o crânio e remover o tecido sobre o crânio com um bisturi. </li><li> Picar dois furos no crânio com tesouras cirúrgicas e colocar dois eléctrodos de fio de ECoG no lobo frontal direito (F2: +2,0 mm em relação ao bregma e 1,5 para a linha média) e lobo parietal esquerdo (P1: -3.0 mm em relação ao bregma e -2,5 mm da linha média). </li><li> Separar a pele do pescoço e músculo e inserir dois eletrodos EMG no músculo do pescoço. </li><li> Ligar os condutores isolados a partir dos eléctrodos de arame de ECoG e eléctrodos de EMG para os terminais fêmea e a um conector de 2,54 mm, e, em seguida, cimento ao crânio com acrílico dental. </li><li> Tratar a incisão topicamente com polysporin (bacitracina-zinco / sulfato de polimixina B) para prevenir a infecção. Dê os animais tanto o ibuprofeno e penicilina G na água por um week após a cirurgia. </li></ol></li><li> Permitir que todos os animais recuperassem durante sete dias antes do início das experiências. </li><li> Casa ratos ou ratinhos, separadamente, em gaiolas individuais de gravação, na sala isolada em que a temperatura é mantida a 23 ± 1 ° C e a luz: escuro (L: D) ritmo é controlada de 12: ciclo de 12 h (40 W X 4 tubos de iluminação). Fornecer alimentos e água ad libitum. </li><li> Ligue o ECoG, EMG, e termistor através de um grupo de ancoragem para os amplificadores de uma semana após a cirurgia para iniciar as gravações. </li></ol> 2. Estabelecimento de Focal TLE epilepsia, SE, e espontaneamente Recurrent epilepsia <ol><li> para os ratos <ol><li> Administrar 0,5 uL de pilocarpina (2,4 mg / mL) para o CeA esquerda através da cânula guia de injecção, utilizando uma bomba de micro-injecção. A taxa de injecção deve ser fixado em 0,2 mL / min para induzir TLE focal. </li><li> IP injectar 300 mg / kg de pilocarpina para induzir epi generalizadalepsy com recorrentes SE. </li></ol></li><li> para ratos <ol><li> IP administrar PTZ (0,035 mg / g de peso corporal do rato) num determinado ponto de ZT todos os dias. Cinco injecções consecutivas irá causar o desenvolvimento de epilepsia espontaneamente e recorrentemente generalizada. </li></ol></li><li> Para ambos os ratos e murganhos <ol><li> Amplificar os sinais de ECoG por 5.000 e filtrar os de banda analógica entre 0,1 e 40 Hz. </li><li> Use um A placa A / D conversão para converter os sinais ECoGs analógicos em sinais digitais com uma taxa de amostragem de 128 Hz. </li><li> Usar um software para a pontuação visual e analisar o aparecimento e a duração da epilepsia. Medir o intervalo de tempo, a fim de representar o tempo. </li><li> Definir ECoG epilepsia pelo aparecimento de picos epilépticos com amplitudes superiores a 2 mV e com durações de mais do que 30 s 13. </li></ol></li></ol> 3. Classificação de Vigilância Unidos <ol><li> para os ratos<ol><li> Determinar os estados de vigilância usando os parâmetros adquiridos de ECoGs, EMG, as temperaturas do cérebro, e locomoção dentro de um 12-s episódio de gravação. Ligue o ECoG, EMG, e termistor através de um grupo de ancoragem para os amplificadores de uma semana após a cirurgia para começar a gravação. Marcar os estados com um software feito sob medida de acordo com etapas 3.1.5 - 3.1.7. </li><li> Medir as atividades de locomoção, utilizando um detector de movimento infravermelho, integrar os sinais cada 1 s, e armazenar os sinais. </li><li> Medir a temperatura cortical e armazenar os sinais. </li><li> Classificar os estados de vigilância de acordo com os nossos critérios previamente definidos 14. </li><li> Pontuação vigília usando as seguintes características: ECoGs de pequena amplitude com espectros de alta-frequência, maior poder de delta (0,5-4,0 Hz) e de potência inferior theta (6,0-9,0 Hz); atividade locomotora dominante; alta atividade EMG; e aumentando gradualmente a temperatura cortical. </li><li> Pontuação sono NREM usando o followincaracterísticas de g: de ondas delta ECoGs dominantes com grandes amplitudes, diminuiu a atividade EMG, reduziu a temperatura cortical, e nenhuma atividade locomotora. </li><li> Pontuação sono REM usando as seguintes características: diminuição da amplitude de ECoGs com a frequência dominante teta, de repente aumento da temperatura cortical, a atividade EMG mínimo, e baixa atividade locomotora com contrações musculares do corpo. </li></ol></li><li> para ratos <ol><li> Repita a classificação dos estados de vigilância nos ratos como conduzidos nos ratos, exceto que não há temperatura cortical gravado a partir do termistor. </li></ol></li></ol> 4. Realização de acupuntura manual e EA em Ratos <ol><li> O rato é anestesiado para o protocolo EA. </li><li> Localize o ponto de acupuntura pela anatomia e confirme baixa impedância pele no ponto de acupuntura. A luz está piscando quando detectar a baixa impedância pele. Nota: acupontos Fengchí está localizado a 3 mm de distância da linha média posterior sejatre as duas orelhas, no pescoço. </li><li> Inserir agulhas de aço inoxidável para os pontos de acupuntura, a uma profundidade de 2 mm. </li><li> Twitch as agulhas inseridas 10 vezes a cada 5 min. </li><li> Usando um estimulador elétrico funcional, entregar um trem de pulsos bifásicos (duração de 150 uS cada) com uma intensidade de 1 mA aos pontos de acupuntura através da agulha. </li><li> Executar uma acupuntura sham ou simulada EA como um controle. </li></ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

A escolha de um modelo animal de epilepsia viável é essencial para cada finalidade experimental. Um dos nossos objetivos é elucidar os efeitos da EA na supressão de epilepsia. EA é um medicamento alternativo que pode apresentar efeitos terapêuticos na epilepsia e tem sido documentada em literatura antiga chinesa. No entanto, há uma falta de evidência científica para provar isso. Para determinar os efeitos da EA sobre epilepsia, nós nos concentramos principalmente sobre os efeitos da EA sobre a epilepsia focal suave, em ...

A epilepsia é um distúrbio neurológico comum em que crises recorrentes ocorrer durante toda a vida de um paciente. A maioria das recorrências epilépticas pode ser bem controlada pelas drogas anti-epilépticas (DAE). No entanto, cerca de 30% dos pacientes epilépticos desenvolver um refractário epilepsia. causas da epilepsia distúrbios do sono, que podem agravar ainda mais a reincidência. Evidências demonstram que a epilepsia pode tanto interromper o sono durante a noite ou pode causar excessiva 2,3 sonolência diurna. Os nossos estudos anteriores indicam ainda que a epilepsia ocorre em tempo zeitgeber (ZT) 0, ou seja, o início do período de luz, à luz: ciclo escuro, diminui o sono; esta é mediada pela hormona de libertação de corticotropina (CRH), um factor homeostática. Da epilepsia em ZT13 (o início do período de escuro) aumenta a expressão de um outro factor homeostático, interleucina-1 (IL-1), o que aumenta o sono. Sono ritmos circadianos são alteradas quando a epilepsia ocorre em ZT6, o meio daperíodo de luz 4,5. Por outro lado, os problemas do sono exacerbar ainda mais a progressão e recorrência da epilepsia 6. Com base nas evidências acima, tentamos revelar um método terapêutico ideal para controlar simultaneamente epilepsia e evitar interrupções do sono em pacientes com epilepsia. Anteriormente verificou que electroacupuncture (AE) com uma frequência de estimulação de 10 Hz, em que uma certa quantidade de corrente é fornecido para o ponto de acupunctura por meio de uma agulha de aço inoxidável, com sucesso suprime eletrocorticograma (ECoG) actividades de epilepsia e distúrbios do sono induzida por epilepsia 7 . EA com uma frequência de estimulação de 100 Hz se deteriorar ainda mais as atividades epilépticas e distúrbios do sono em ratos 8,9. Esta experiência bem sucedida depende de três fatores: em primeiro lugar, um modelo animal de epilepsia viável; Em segundo lugar, um método para a gravação e a análise do sono em roedores; e em terceiro lugar, o desempenho preciso da acupuntura e a precisão do locati acupointons. A epilepsia tem sido classificados em dois tipos principais: epilepsia focal e epilepsia generalizada. Estamos interessados ​​em epilepsia focal lobo temporal (ELT), epilepsia generalizada, estado de mal epiléptico (SE), e a recorrência de epilepsia generalizada espontânea. Portanto, diferentes manipulações são aplicados para criar modelos de epilepsia adequados para nossos experimentos. Para estabelecer TLE focal, uma dose baixa de pilocarpina é administrado para dentro do núcleo central esquerdo da amígdala (CEA). Para verificar este modelo, seis eléctrodos de ECoG são implantados na frontal (F1 &amp; F2), parietal (P1 e P2), e occipital (O1 &amp; O2) lóbulos em ambos os hemisférios esquerdo e direito, e mais dois eléctrodos de referência (R1 &amp; R2) são colocados sobre o cerebelo, em ambos os hemisférios. Uma cânula guia microinjecção adicional é cirurgicamente implantado no lado esquerdo CEA (AP, 2,8 mm a partir da bregma; mL, 4,2 mm; DV, 7.8 mm em relação ao bregma) relativos. As coordenadas são adaptados a partir da Paxinos e Watlas rato atson 10. Se o TLE focal é induzida com sucesso, somente a gravação do eletrodo no córtex parietal esquerda (P1), que fica perto da CeA esquerda, deve adquirir as ECoGs epileptiformes dominantes, sem ECoGs epileptiformes significativos registados a partir dos outros eletrodos ECoG. Intraperitoneal (ip) de pilocarpina em ratos induzem epilepsia generalizada e SE, mas isto pode ser fatal. Cinco injecções IP de pentilenotetrazol (PTZ) com um intervalo de um dia entre cada injecção induzir com sucesso epilepsia generalizada espontânea em ratos e também garantir a sobrevivência dos ratos. Dois eléctrodos de fio de ECoG são implantados no córtex frontal e parietal em ratinhos a receber sinais de ECoG e para verificar a epilepsia espontaneamente recorrentes. A polissonografia (PSG) é um método abrangente para gravar as mudanças fisiológicas que ocorrem durante o sono, e pode objectivamente classificar sono em diferentes estágios de movimento não rápido dos olhos (NREM) e rAPID movimento dos olhos (REM). PSG registra os parâmetros de funções do corpo, incluindo as ondas cerebrais (eletroencefalograma, EEG), movimentos oculares (eletrooculograma, EOG), tons de músculo esquelético (eletromiografia, EMG), ritmos cardíacos (eletrocardiograma, ECG), e os níveis de oxigênio no sangue e parâmetros respiratórios. Em ratos, registramos ECoGs, EMG, temperatura cortical e atividade locomotora para classificar os estados de vigilância em vigília, o sono NREM e sono REM. análise de sono em ratos é conduzida usando ECoGs, EMGs, e resultados de atividade locomotora. Os ratos são implantados cirurgicamente, com três ECoG parafuso eletrodos no frontal, parietal e córtex cerebelar contralateral por cirurgia estereotáxica. determinação pós-aquisição dos estados de vigilância (vigília, sono NREM e sono REM) é conduzida de acordo com os parâmetros adquiridos a partir dos ECoGs, EMG, a temperatura do cérebro e atividade locomotora. Os critérios detalhados para classificar o comportamento do animal em ambos os ratos e murganhos são descritos em Tele protocolo. Ambos os ratos e ratinhos necessitam de ser anestesiados com uma dose baixa de Zoletil (25 mg / kg), que é a metade da dose de anestésicos normalmente administrados durante a cirurgia estereotáxica, antes de realizar a acupunctura manual ou EA. Esta dosagem permite que os animais acordar 30 a 35 minutos após a injecção. De qualquer acupuntura manual ou EA é executada no início do período de escuro, com um período de tempo constante de 30 min, e cada animal é consecutivamente tratados durante dois a três dias. Estimulantes correntes EA são entregues num ponto de acupunctura particular através de uma agulha de aço inoxidável que é inserida no ponto de acupunctura. A corrente de estímulo é uma série de impulsos quadrados bifásica, em que a duração do impulso é de 150 ms e a intensidade de estimulação é de 1 mA. Se uma agulha for utilizada para a acupunctura manual, a agulha inserida nos acupontos se contraiu 10 vezes cada 5 min. A parte difícil da acupuntura manual ou EA é localizar os pontos de acupuntura em roedores. o locção dos pontos de acupuntura em ratos ou camundongos é semelhante à sua localização anatômica em seres humanos. Por exemplo, os pontos de acupuntura bilaterais Fengchí estão localizados 3 mm de distância da linha média posterior do pescoço, entre as duas orelhas, que é semelhante à sua localização anatómica em seres humanos 11. Além disso, os pontos de acupuntura com baixa impedância sobre a pele pode ser ainda confirmada. Sham acupuntura ou EA sham manipulação é necessária para acupuntura ou experimentos EA. Acupuntura Sham ou EA simulada deve ser realizado em um não-acupoint localizado perto do ponto de acupuntura, como perto da axila 12. Para investigar com êxito os efeitos da acupuntura ou EA sobre a epilepsia e perturbações do sono induzida por epilepsia, os seguintes fatores devem estar no local: um modelo viável epiléptico animal, a análise precisa do ECoGs epileptiformes e a recorrência de epilepsia, um método para classificar os estados de vigilância , eo desempenho precisa da acupuntura ou eA em roedores.

<table><tbody><tr><td><forte>Drogas</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zoletil</td><td>Virbac</td><td></td><td>50 mg/kg i.p.</td></tr><tr><td>pilocarpina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6503</td><td>300 mg/kg i.p.; 1,2 mg microinjeção</td></tr><tr><td>PTZ</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6500</td><td>0,035 mg/camundongo</td></tr><tr><td>polisporina</td><td>Pfizer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Surgery</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ECoG</td><td>Plásticos Um eletrodo de</td> parafuso <td>E363/20</td><td>para ratos</td></tr><tr><td>Pedestal</td><td>Plásticos Um</td><td>MS363</td><td></td></tr><tr><td>Cânula</td><td>Plásticos Um</td><td>C315G / spc</td><td></td></tr><tr><td>Termistor</td><td>Omega Engineering</td><td>44008</td><td></td></tr><tr><td>Dental acrílico</td><td>Tempron</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Instrumento Estereotáxico</td><td>Stoelting</td><td></td><td>Dural braços</td></tr><tr><td>Equipamentos de gravação</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ECoG amplificador</td><td>Colbourn Instruments</td><td>V75-01</td><td></td></tr><tr><td>A/D Board</td><td>National Instruments</td><td>NI PCI-6033E</td><td></td></tr><tr><td>Detectores de movimento baseados em infravermelho</td><td>Biobserve GmbH</td><td>feito sob medida</td><td></td></tr><tr><td>ICELUS</td><td>G-System</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AxoScope 10 Software</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Necessidades de acupuntura</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agulhas de aço inoxidável</td><td>Shanghai Yanglong Medical Articles Co.</td><td>calibre 32 x 1"</td><td></td></tr><tr><td>Funções Estimulador elétrico</td><td>I.T.O., Japão</td><td>Trio 300</td><td></td></tr><tr><td>AcuPen</td><td>Lhasa OMS</td><td>Ponteiro Excel II</td><td></td></tr></tbody></table>

manipulação de epileptiforme electrocorticograms (ecogs) e do sono em ratos e camundongos por acupuntura

Manipulation of Epileptiform Electrocorticograms (ECoGs) and Sleep in Rats and Mice by Acupuncture

A literatura chinesa antiga documentou que a acupuntura possui efeitos terapêuticos eficientes na epilepsia e na insônia. Há, no entanto, pouca pesquisa para revelar os possíveis mecanismos por trás desses efeitos. Para investigar o efeito da acupuntura na epilepsia e no sono, várias questões precisam ser abordadas. A primeira é identificar os pontos de acupuntura, que correspondem entre humanos, ratos e camundongos. Além disso, a profundidade de inserção da agulha de acupuntura, o grau de torção da agulha na acupuntura manual com agulha e os parâmetros de estimulação para eletroacupuntura (EA) precisam ser determinados. Para avaliar os efeitos da acupuntura na epilepsia e no sono, é necessário um modelo viável de epilepsia em roedores. Administramos pilocarpina no núcleo central esquerdo da amígdala (CeA) para simular epilepsia focal do lobo temporal (ELT) em ratos. A injeção intraperitoneal (IP) de pilocarpina induz epilepsia generalizada e estado de mal epiléptico (SE) em ratos. Cinco injeções IP de pentilenotetrazol (PTZ) com um intervalo de um dia entre cada injeção induzem com sucesso epilepsia generalizada espontânea em camundongos. Registros de eletrocorticogramas (ECoGs), eletromiogramas (EMGs), temperatura cerebral e atividade locomotora são usados para análise do sono em ratos, enquanto ECoGs, EMGs e atividade locomotora são empregados para análise do sono em camundongos. Os eletrodos ECoG são implantados nos córtices occipitais frontal, parietal e contralateral, e um termistor é implantado acima do córtex cerebral por cirurgia estereotáxica. Os eletrodos EMG são implantados nos músculos do pescoço e um detector infravermelho determina a atividade locomotora. Os critérios para categorizar os estágios de vigilância, incluindo vigília, sono REM (movimento rápido dos olhos) e sono não REM (NREM) são baseados em informações de ECoGs, EMGs, temperatura cerebral e atividade locomotora. Os critérios de classificação detalhados são indicados no texto.

Existem diferentes modelos de ratos e camundongos para satisfazer as necessidades de diferentes tipos de epilepsia. Para induzir TLE focal, 0,5 ul de pilocarpina (2,4 mg / mL) é administrado para a esquerda CeA. Os ECoGs epileptiforme predominantes são adquiridos a partir do eléctrodo de ECoG no lobo parietal do hemisfério esquerdo (Figura 1A: b), e actividades epilépticos raras são apanhados do resto dos eléctrodos de ECoG (Figura 1A: a,</strong...

Este artigo demonstra o desempenho da acupuntura, modelos de epilepsia e a análise do sono em roedores. O procedimento de acupuntura e a identificação dos pontos de acupuntura são descritos. Pilocarpina ou pentilenotetrazol (PTZ) é usado para induzir epilepsia. Eletrocorticograma (ECoG), eletromiograma (EMG), temperatura cerebral e registros de atividade locomotora são empregados para análise do sono.

Manipulação de epileptiforme Electrocorticograms (ECoGs) e do sono em ratos e camundongos por Acupuntura

Ancient Chinese literature has documented that acupuncture possesses efficient therapeutic effects on epilepsy and insomnia. There is, however, little ...

O objetivo geral deste procedimento é avaliar epilepsia, sono e os efeitos da acupuntura em um modelo animal. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de neurociência sobre como induzir epilepsia, analisar o sono e realizar acupuntura em um modelo animal de pequeno porte. As principais vantagens desta técnica são que os eletrodos corticais laterais e os eletrodos do miograma lateral podem ser implantados rapidamente e com facilidade por meio de cirurgia estereotáxica.Demonstrará este procedimento Yi-Jou Wu, um estudante de pós-graduação de meus laboratórios. Após confirmar a profundidade adequada da sedação pela ausência de resposta a um aperto no dedo do pé, aplique pomada oftálmica em um rato Spregg Dolly de seis a oito semanas de idade e pesando entre 250 e 350 gramas do primeiro grupo. Use uma tesoura elétrica para remover os pelos do topo do crânio.Desinfete a pele com aplicações sequenciais de solução de povídona-iodo e etanol a 75 por cento, seguidas por injeção de antibiótico para prevenir infecção. Em seguida, posicione o animal em um aparelho de estereotaxia e insira uma barra auricular no canal auditivo. Com um bisturi, faça uma incisão mediana caudal de aproximadamente dois centímetros ao longo do crânio entre as orelhas.Em seguida, use hemostatos para prender as abas de pele, expondo o crânio, e utilize um bisturi para remover o tecido. Quando o crânio estiver limpo, use uma ferramenta rotativa para fazer oito furos com diâmetro aproximado de 0,7 milímetro nos lobos frontal, parietal e occipital e no cerebelo, em ambos os hemisférios esquerdo e direito do osso exposto. Em seguida, parafuse oito eletrodos de eletrocorticograma nos furos para detecção focal de epilepsia.Em um grupo separado de ratos, faça três furos e posicione dois eletrodos de eletroencefalograma sobre os lobos frontal e parietal direitos das cortesias, com as mesmas coordenadas do primeiro grupo. Em seguida, posicione um terceiro eletrodo de eletroencefalograma sobre o cerebelo esquerdo para aterrar o animal e reduzir os artefatos do sinal. Separe a pele e o músculo do pescoço e insira dois eletrodos de eletromiograma no músculo do pescoço.Faça outro orifício no crânio e insira uma cânula guia de microinjeção no núcleo central da amígdala esquerda. Em seguida, faça um orifício de 1,6 milímetro no crânio e insira um termômetro calibrado de 30 quilovolts na superfície do córtex parietal para monitorar a temperatura cortical. Conduza os fios isolados dos eletrodos de eletrocorticograma e eletromiograma até um pedestal.Usando acrílico dental para cimentar o pedestal, direcione a cânula até o crânio e, em seguida, conecte o termóstato ao cabo. Em seguida, trate a incisão topicamente com polysporin para prevenir infecção e forneça aos animais água suplementada com ibuprofeno e penicilina G por uma semana após a cirurgia. Para induzir epilepsia focal do lobo temporal, utilize uma bomba de microinjeção para administrar 0,5 microlitros de pilocarpina no núcleo central da amígdala esquerda através da cânula guia de injeção, a uma taxa de 0,2 microlitros por minuto.Para induzir epilepsia generalizada com status epiléptico recorrente, injete 300 miligramas por quilograma de pilocarpina por via IP. Para a acupuntura, localize primeiro manualmente os pontos de acupuntura. Por exemplo, os pontos de acupuntura feng chi estão localizados a três milímetros da linha mediana posterior entre as orelhas, na região do pescoço. Após confirmar uma baixa impedância cutânea nos pontos de acupuntura de interesse, insira agulhas de aço inoxidável nos pontos de acupuntura a uma profundidade de dois milímetros.Em seguida, utilizando um estimulador elétrico funcional, aplique um trem de 150 milissegundos de pulsos bifásicos de 10 hertz com intensidade de um miliampère aos pontos de acupuntura através da agulha. Aqui, é mostrado um eletrocorticograma epiléptico predominantemente epileptiforme adquirido do eletrodo de eletrocorticograma no lobo parietal do hemisfério esquerdo. Após a administração de pilocarpina, atividades epilépticas raras são detectadas no restante dos eletrodos de eletrocorticograma, indicando uma indução bem-sucedida de epilepsia de lobo temporal focal.Dentro de cinco minutos, ocorrem efeitos colinérgicos graves sobre o comportamento, aumentando gradualmente em gravidade até que ocorra uma crise generalizada no eletrocorticograma, seguida por um episódio de estado epiléptico. Nenhum eletrocorticograma epileptiforme é observado durante o período escuro após a primeira injeção de pentilentetrazol, nem durante o segundo período escuro em um dia sem injeção, até a quinta injeção de pentilentetrazol, juntamente com epilepsia generalizada espontânea e recorrente. A vigília exibe um eletromiograma de alta amplitude e uma abundância de atividade locomotora, com aumento gradual da temperatura cortical à medida que o estado de vigília transita do sono não REM ou REM para a vigília.O sono não-REM é caracterizado por eletrocorticogramas sincronizados com alta amplitude e baixa frequência, com declínio gradual da amplitude do eletromiograma e ausência de atividade locomotora, além de uma diminuição na temperatura cortical à medida que o estado de vigília transita do estado de vigília para o sono NREM. Durante o sono REM, a onda do eletrocorticograma é dessincronizada, com amplitude reduzida. A densidade de potência eletroencefalográfica predominante ocorre dentro da frequência teta.A atividade do eletromiograma é a mais baixa, observa-se um tremor corporal tônico e a temperatura cortical aumenta rapidamente. A administração de 100 hertz de eletroacupuntura nos pontos acupunturais bilaterais feng chi agrava os eletrocorticogramas epileptiformes induzidos por pilocarpina, enquanto 10 hertz de eletroacupuntura suprime os eletrocorticogramas epileptiformes. Além disso, a administração de pilocarpina no núcleo central da amígdala esquerda também suprime o sono não REM durante o período claro do ciclo claro/escuro de 12 horas.100 hertz de eletroacupuntura agravam ainda mais a supressão induzida pela pilocarpina no sono não REM. Em contraste, uma eletroacupuntura de 10 hertz nos pontos acupunturais feng chi bilaterais aumenta por si só o sono não REM durante o período escuro e bloqueia a redução do sono não REM induzida pela pilocarpina durante o período claro. Uma vez dominada, essa técnica pode ser concluída em uma hora e meia, se realizada corretamente.Antes de tentar este procedimento, é importante praticar a habilidade de cirurgia estereotáxica até alcançar proficiência. Após seu desenvolvimento, esta técnica abre caminho para que pesquisadores na área de neurociência explorem os efeitos da acupuntura na epilepsia e nos distúrbios do sono. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como implantar cirurgicamente eletrodos de eletroencefalograma e eletromiograma, uma cânula guia e um semestre para avaliar os padrões de sono e outros efeitos da acupuntura na atividade cerebral.

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Research

JoVE Journal

Behavior

Comportamento

Fonte: Kodani, S., et.al. Manipulação optogenética de circuitos neurais durante o monitoramento de estados de sono/vigília em camundongos. J. Vis. Exp. (2019)Este vídeo demonstra a manipulação optogenética de circuitos neurais envolvidos na transição do sono para a vigília em camundongos. O procedimento envolve a implantação cirúrgica de uma fibra óptica e eletrodos no cérebro e nos músculos para permitir a estimulação da luz e o registro eletrofisiológico. Ao fornecer luz para ativar canais...

Manipulação optogenética de circuitos neurais para a transição do sono para a vigília em camundongos

Este vídeo demonstra um protocolo para implantar um eletrodo de eletroencefalograma (EEG) e eletromiograma (EMG) em um camundongo anestesiado. O processo envolve prender o mouse em uma estrutura estereotáxica, fazer uma incisão na linha média do crânio, fazer furos para os eletrodos e fixar a unidade de eletrodo para gravação de sinal. Após a recuperação, o comportamento sono-vigília do mouse é analisado usando os sinais registrados.

Analisando o comportamento do sono em camundongos por meio de eletroencefalograma e gravações de eletromiograma

Este vídeo demonstra um método para gravação de EEG de alta resolução em um modelo de epilepsia focal de rato. Ele descreve as etapas envolvidas na preparação do rato, conectando uma mini-cápsula de EEG multicanal ao couro cabeludo do rato e registrando o EEG para identificar eventos relacionados a convulsões característicos do modelo de epilepsia.

Registro de eletroencefalografia em um modelo de epilepsia focal em ratos

Este vídeo demonstra o registro eletroencefalográfico (EEG) de crises epilépticas em ratos induzidos por epilepsia. Um rato com eletrodos implantados no hipocampo ventral é conectado ao sistema de registro de EEG e colocado em uma câmara de plexiglass. O rato pode se mover livremente enquanto a atividade cerebral é registrada para monitorar a ocorrência de convulsões.

Registro eletroencefalográfico de crises epilépticas em ratos induzidos por epilepsia

O registro de eletroencefalograma (EEG) e eletromiograma (EMG) em camundongos com comportamento livre é um passo crítico para correlacionar o comportamento e a fisiologia com o sono e a vigília. O protocolo experimental aqui descrito fornece um sistema baseado em cabo para aquisição de gravações de EEG e EMG em camundongos.

Procedimento de gravação Polygraphic para medição Sleep in Mice

Apreensão de electroconvulsive (ECS) é um modelo animal experimental de terapia eletroconvulsiva para depressão grave. ECS globalmente estimula a atividade no hipocampo, levando a sinaptogênese e plasticidade sináptica. Aqui, descrevemos os métodos para a indução de ECS em ratos e para fraccionamento subcelular de seu hipocampo para examinar alterações induzidas pelo ataque em proteínas sinápticas.

Eletroconvulsiva convulsões em ratos e fracionamento de seu hipocampo para examinar alterações induzidas pelo ataque em densidade pós-sináptica proteínas

Aqui, nós descrevemos métodos da manipulação optogenética de tipos particulares de neurônios durante a monitoração de Estados do sono/wakefulness nos ratos, apresentando nosso trabalho recente no núcleo da cama do terminalis do stria como um exemplo.

Manipulação optogenetic de circuitos neural durante a monitoração sono/Estados do wakefulness nos ratos

Este artigo descreve um protocolo para a manipulação de alvos moleculares no córtex cerebral usando vírus associados ao adeno e para monitorar os efeitos dessa manipulação durante a vigília e o sono usando gravações eletrocorticográficas.

Registro eletrocorticográfico de áreas do córtex cerebral manipulado usando um vírus associado ao Adeno visando cofilina em camundongos

Aqui, apresentamos um protocolo para eletroacupuntura (EA) eficiente e rápida em camundongos ou ratos jovens usando um suporte impresso tridimensional (3D). Esta técnica permite a operação simultânea em vários animais, economizando tempo e aumentando a eficiência experimental.

Operação de eletroacupuntura em massa para camundongos ou ratos jovens

Este protocolo foi desenvolvido para criar um sistema confiável e de fácil acesso para registrar EEG de roedores em movimento livre.

Um protocolo econômico e minimamente invasivo para gravação crônica de eletroencefalografia em vários locais em camundongos que se movem livremente

Aprenda a avaliar epilepsia e sono em modelos de roedores usando acupuntura e eletrocorticograma. Este método demonstra como implantar eletrodos e analisar padrões de atividade cerebral.

Manipulação de epileptiforme Electrocorticograms (ECoGs) e do sono em ratos e camundongos por Acupuntura

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