Name: Eletroconvulsiva convulsões em ratos e fracionamento de seu hipocampo para examinar alterações induzidas pelo ataque em densidade pós-sináptica proteínas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 7 s
Description: Aprenda a induzir convulsões eletroconvulsivas em ratos e fracionar o hipocampo para examinar alterações em proteínas da densidade pós-sináptica. Este método permite estudar neuroplasticidade e disfunção sináptica.

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Os autores agradecer Dr. Eric C. Bolton por nos permitir usar sua centrífuga para fracionamento e Dr. Graham H. Diering no laboratório do Dr. Richard L. Huganir Universidade de John Hopkins, nos fornecer o protocolo de pequena escala para o fraccionamento do PSD.

Todos os procedimentos experimentais, incluindo assuntos animais foram aprovados pelo Comitê de uso na Universidade de Illinois em Urbana-Champaign e cuidado de animais institucionais.
1. manter uma colônia de rato
<ol><li>Raça de ratos Sprague-Dawley (consulte a Tabela de materiais) e mantê-las em condições normais, com um ciclo de 12 h claro-escuro e ad libitum acesso à comida e água.</li>
	<li>Desmamar os filhotes de rato no dia pós-natal (P) 28 e colocá-los em grupos de 2-4 machos ou fêmeas littermates.</li>
	<li>Marca as caudas dos ratos machos com um marcador preto permanente de tóxicos para identificação.</li>
	<li>Pesar os ratos machos 3 vezes por semana e registar a sua bodyweights.</li>
</ol>2. preparação de uma máquina de ECS
<ol><li>Às 07:30, desinfectar o banco na sala de preparação de animais e colocar uma máquina ECS (gerador de pulso) no banco.</li>
	<li>Coloque um rato masculino individual pesando 200-250 g numa gaiola limpa e vazia com tampa. Repita isto para todos os ratos machos devem ser tratados com indução de ECS. Deixe os ratos se habituar por 30 min.</li>
	<li>Enquanto os ratos são habituating em suas gaiolas, defina um gerador de pulso para indução de ECS para a frequência de 100 pulsos/s, uma largura de pulso de 0,5 ms, a duração do choque de 0,5 s e uma corrente de 55 mA (Figura 1A).</li>
	<li>Prepare o gerador de pulso, apertando o botão de "RESET" e garantindo que o botão "Pronto" estiver acesa. Certifique-se de que os clipes de ouvido não estão conectados a um gerador de pulso e em seguida, pressione o botão de "Choque" por alguns segundos. Nota: neste ponto, o gerador de pulso está pronto para a indução de ECS.</li>
	<li>Conecte os clipes de orelha o gerador de pulso.</li>
</ol>3. indução de ECS aguda
Nota: Ver Figura 1B, painel superior.
<ol><li>Molhar os clipes de orelha com solução salina estéril e certifique-se de que eles estão saturados.</li>
	<li>Molhe as orelhas de um rato com solução salina estéril por envolvê-los em gaze embebida em soro fisiológico. Uma vez que eles estão molhados, remova a gaze.</li>
	<li>Anexe um clip por orelha, posição além da banda principal de cartilagem.</li>
	<li>Confirmar na máquina ECS que seja estabelecido um laço verdadeiro; Se não, uma leitura de "1" ou uma mensagem de erro aparecerá na máquina.</li>
	<li>Use uma luva grossa, não-metálicos. Enquanto segura o rato delicadamente em uma mão enluvada, pressione o botão de "Choque" por alguns segundos e solte lentamente o punho no rato para observar a apreensão. Para a farsa "nenhuma apreensão" (NS) controlam, manipular o rato de forma idêntica, mas não entregam a corrente.</li>
	<li>Desconecte os clipes de orelha como clonus começa e registrar o comportamento de ataque de acordo com uma revista Racine escala22 que inclui "os movimentos faciais e boca" (fase 1), "cabeça a acenar" (fase 2), "clonus membro anterior" (fase 3), "criação com clonus membro anterior" (etapa 4) e "criação e caindo com clonus membro anterior" (etapa 5). A apreensão deve durar cerca de 10 s; registar a duração de ataque usando um timer.</li>
	<li>Após a cessação de apreensão, retorne o rato para sua gaiola em casa. Monitore o rato para outro 5 min certificar-se da recuperação do rato de apreensões. Mantê-lo isoladamente alojado na gaiola e retornar a gaiola para a sala de recuperação.</li>
	<li>Repita a indução de ECS no próximo rato.</li>
	<li>Monitore os ratos no restante do dia e pelo menos uma vez de manhã e uma vez na parte da tarde no dia seguinte, até que eles são sacrificados para experimentos. Nota: O método de indução de ECS pode levar a sinais clínicos como um efeito colateral incidental, o que requer atenção. Por exemplo, o protocolo de indução de ECS pode induzir convulsões que duram mais de 15 s e causa sofrimento desnecessário para os ratos. Neste caso, encerrar o ataque usando o diazepam (10 mg/kg, i.p.) ou pentobarbital (25-30 mg/kg, i.p.). Se os ratos desenvolvem insuficiência respiratória ou graves anomalias comportamentais após a cessação de apreensão, sacrificá-los por inalação de dióxido de carbono, seguida por decapitação.</li>
</ol>4. indução de ECS crônica
Nota: Consulte a Figura 1B, painel inferior.
<ol><li>Induzi uma ECS por dia ao mesmo tempo pela manhã, conforme descrito nas etapas 1-3, acima, durante sete dias consecutivos.</li>
	<li>Monitor os ratos gaiolas duas vezes um dia depois que eles são retornados para a sua casa.</li>
</ol>5. homogeneização e fracionamento do hipocampo de rato
Nota: Consulte a Figura 2.
<ol><li>Preparar uma reserva de homogeneização fresco (solução A) que contém sacarose 320mm, pirofosfato de sódio de 5 mM, 1 mM EDTA, pH de 10 mM HEPES 7.4, 200 o ácido ocadaico nM e inibidores da protease. Filtro-esterilizar o buffer usando filtros com um tamanho de poro 0,22 µm para filtragem do vácuo e colocá-lo no gelo.</li>
	<li>Em um determinado momento ponto seguinte ECS aguda ou crônica ECS (Figura 1), eutanásia o rato por inalação de CO2 por 5-10 min, seguido por decapitação usando uma guilhotina.</li>
	<li>Remover o cérebro e dissecar o hipocampo na placa de metal colocados no gelo, conforme descrito anteriormente,23,24.</li>
	<li>Coloque dois hipocampo de um rato em uma cultura de tecido de 30 mm do prato e pique-os em pequenos pedaços com uma tesoura.</li>
	<li>Transferir o hipocampo picado para um homogeneizador de vidro manual usando uma pipeta de 1 mL e adicionar 1 mL de tampão de homogeneização gelada (solução A, passo 5.1). Inserir um pilão redondo em um homogeneizador de vidro. Enquanto o homogenizador de vidro está no gelo, delicadamente e com firmeza curso acima e para baixo sobre o pilão 10 - 15 vezes por 1 min, até pequenos pedaços de tecido hippocampal desapareceram.</li>
	<li>Transfira o homogeneizado para um tubo de microcentrifuga de 1,7 mL com uma pipeta de 1 mL e centrifugar o homogenate a 800 x g durante 10 minutos a 4 ° C para separar o sobrenadante pós-nucleares (fração de S1) da pelota contendo tecido insolúvel e núcleos (fração de P1). Transferir 50 µ l e 950 µ l da fração S1 para dois tubos de microcentrifuga separado, nova 1,7 mL com uma pipeta de 1 mL e armazenar esses tubos no gelo. Salve a pelota de fração de P1 no gelo.</li>
	<li>Centrifugue a fração de S1 (950 µ l) durante 10 minutos a 13.800 x g e 4 ° C para separar o sobrenadante (fração S2), enriquecido com proteínas solúveis no citosol, e a pelota (fração P2), enriquecido com proteínas de membrana-limite, incluindo proteínas synaptosomal. Transferir a fração S2 para novo microcentrifuga 1,7 mL com uma pipeta de 1 mL e armazená-lo no gelo.</li>
	<li>Resuspenda o pellet (fração P2) em 498 µ l de água filtrada gelada, utilizando uma pipeta de 1 mL. Adicionar 2 µ l de 1 M HEPES (pH 7,4) utilizando uma pipeta de 20 µ l a obter uma concentração final de 4 mM HEPES (pH 7,4). Incube a 4 ° C, com agitação por 30 min. loja a ressuspensa fração P2 no gelo.</li>
	<li>Determine a concentração de proteína das frações S1, S2 e P2 usando um ensaio BCA. Adicionar 50 mM HEPES (pH 7,4) a cada fração para atingir uma concentração de 1 mg/mL e armazenar a-80 ° C até o uso, ou processar a fração P2 para isolar o PSD.</li>
</ol>6. isolamento do PSD da fracção membrana bruto proteína (P2)
<ol><li>Centrifugue a fração P2 (500 µ l) por 20 min em 25.000 x g e 4 ° C para separar o sobrenadante lisado (LS2 fração) e o pellet lisado (LP1 fração). A fração LS2 de transferência para um novo tubo de microcentrifuga 1,7 mL com uma pipeta de 1 mL e armazená-lo no gelo.</li>
	<li>Resuspenda o pellet LP1 em 250 µ l de 50 mM HEPES (pH 7,4) misturado com 250 µ l de detergente de 1% em tampão PBS, usando uma pipeta de 1 mL de 1x. Incube a 4 ° C, com agitação suave por 15 min.</li>
	<li>Centrifugue o ressuspenso LP1 para 3h em 25.000 x g e 4 ° C para separar o sobrenadante (fração não-PSD) a pelota (fração do PSD). Remover o sobrenadante para um tubo de microcentrifugadora 1,7 mL e ressuspender o PSD em 100 µ l de 50 mM HEPES (pH 7,4) utilizando uma pipeta de 200 µ l.</li>
	<li>Determine a concentração de proteína da LS2, não-PSD e frações PSD usando um ensaio BCA. Adicione 50 mM HEPES (pH 7,4) a cada fração para atingir uma concentração de 1 mg/mL e armazenar a-80 ° C até o uso. Nota: Todas as soluções utilizadas nas etapas 5-6 (ou seja, A solução tampão HEPES e tampão PBS) devem ser feitas com água purificada e livre de partículas e contaminantes orgânicos e iônicos.</li>
</ol>7. mancha ocidental
<ol><li>Descongele a cada fração de proteína no gelo. Transferência para um novo tubo de microcentrifuga 1,7 mL com uma pipeta de 20 µ l de 12 µ l de cada fração (S2, P2 e PSD em 1 mg/mL).</li>
	<li>Adicione 3 µ l de buffer de amostra 5 x SDS e incubar a 75 ° C por 30 min em um banho de água. Refrigerar a amostra até à temperatura (RT).</li>
	<li>Carrega 10 µ l da amostra da proteína em cada poço de 4-20% gradiente 15-bem pente SDS-gel de eletroforese (SDS-PAGE) do gel de polyacrylamide usando uma pipeta de 20 µ l. Funcione o gel no aparato de SDS-PAGE e em 80-100 V em reserva de marcha (25 mM Tris glicina de 190 mM e 0,1% SDS; pH 8.3). Nota: Cada gel deve conter amostras da proteína de NS ratos e ratos ECS em pontos diferentes do tempo seguindo ECS aguda ou crônica.</li>
	<li>Transferência das proteínas da SDS-página do gel para uma membrana de policloreto difluoreto (PVDF) no aparelho de transferência em 25-30 V (60 mA) para 9-12 h no buffer de transferência (25 mM Tris glicina 190mm e 20% de metanol; pH 8.3).</li>
	<li>Retire o aparelho de transferência da membrana PVDF e lavá-lo em salino Tris (TBS) por 5 min em um rotador de múltiplos propósito a RT</li>
	<li>Bloquear a membrana em leite de 5% e 0,1% Tween-20 em TBS para h. 1-incubar em anticorpos primários (tabela 1) em tampão de lavagem (leite de 1% e 0.1% Tween-20 em TBS) durante a noite em um rotador de múltiplos propósito a 4 ° C (ver a Tabela de materiais para as diluições).</li>
	<li>Lavar a membrana por 10 min cada por 4 vezes em tampão de lavagem e incube-a então com peroxidase de rábano (HRP)-conjugados com anticorpos secundários no buffer para 1h de lavagem em rotacao multi-uso em RT</li>
	<li>Lave a membrana por 10 min cada por 4 vezes em tampão de lavagem e depois com TBS por 5 min.</li>
	<li>Incubar a membrana com substrato chemifluorescence reforçada por 1 min e expô-la a película de raio x. Desenvolva o filme exposto com um processador de filme.</li>
</ol>8. quantificação dos borrões ocidentais
<ol><li>Varredura do Western blot como um arquivo TIFF e salve este arquivo no computador.</li>
	<li>Abra o arquivo de borrão ocidental no programa ImageJ como uma imagem em tons de cinza, em "Arquivo", "Abrir imagem", seta para a direita "escala de cinza".</li>
	<li>Escolha a ferramenta de seleção retangular na barra de ferramentas do ImageJ e desenhe um retângulo que abrange uma banda simples borrão ocidental de uma proteína de interesse.</li>
	<li>Sob "Analisar," bateu "Medida" para obter a área e a densidade média de uma banda selecionada.</li>
	<li>Mova o retângulo de uma área de fundo sem alterar seu tamanho e forma. Repita a etapa 8.4 para a área e a densidade média de um plano de fundo.</li>
	<li>Subtrai o valor da densidade média de uma banda de fundo daquele de uma banda de Western blot, dando a densidade de fundo-subtraído banda da proteína de interesse.</li>
	<li>Repita as etapas de 8,2-8,6 para todas as bandas de borrão ocidental de interesse.</li>
	<li>Dividir a densidade de fundo-subtraído banda da proteína de interesse pela densidade banda fundo-subtraído de um produto de gene das tarefas domésticas, tais como a α-tubulina; Esta etapa produz o valor normalizado da proteína de interesse.</li>
</ol>

Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente.

Aqui, descrevemos um método de indução de ECS em ratos que provoca a estimulação global da atividade neuronal em seu hipocampo. ECS é um modelo animal de eletroconvulsoterapia, que clinicamente é usada para tratar transtornos depressivos refratários de drogas em seres humanos1,2,3. Apesar do uso da terapia electroconvulsive para tratar a depressão grave, o mecanismo preciso subjacente permanece obscuro. Porque ECS induz comporta...

Eletroconvulsoterapia tem sido usada para tratar pacientes com distúrbios depressivos major, incluindo depressão severa resistente a medicamentos, depressão bipolar, a doença de Parkinson doenças e esquizofrenia1,2. Esta terapia, convulsão é gerado pelo estímulo eléctrico entregado na cabeça de pacientes anestesiados através de sub-fascial eletrodos1,2,3. Administração repetitiva de ECS tem sido clinicamente benéfica para transtornos depressivos resistentes1,2,3. No entanto, o mecanismo exato subjacentes a eficácia a longo prazo do efeito antidepressivo em humanos permaneceu indescritível. ECS é um modelo animal de eletroconvulsoterapia e é amplamente usado para investigar seu mecanismo terapêutico. Em roedores, ambos ECS aguda e crônico tratamento ECS promovem neurogénese adulta no hipocampo em reorganizar a rede neural4,5, susceptível de contribuir para melhorias na flexibilidade cognitiva. Além disso, elevação global da atividade cerebral por ECS altera a abundância de transcrições, tais como um cérebro derivada neurotrópica fator6e várias proteínas, incluindo metabotrópico glutamato receptor 17 e o N-metil-D-aspartato (NMDA) tipo glutamato receptor subunidades7. Estas mudanças estão envolvidas na mediação a longo prazo modificação do número de sinapse, estrutura e força do hipocampo7,8,9.
Modelos ECS, estimulação elétrica é entregue para roedores via stereotaxically implantados eletrodos, eletrodos corneais ou eletrodos de orelha para evocar as convulsões tônico-clônica generalizada10,11. Estereotáxica implante de eletrodos envolve cirurgia cerebral e exige um tempo significativo para melhorar habilidades cirúrgicas do experimentador para minimizar a lesão. Menos invasivos eletrodos corneais podem causar secura e abrasão corneal e requer anestesia. O uso de eletrodos de orelha-clip ignora essas limitações porque eles podem ser usados em roedores sem cirurgia ou anestesia e causam lesão mínima. De fato, descobrimos que atual entregues ao acordado ratos através de orelha-clip eletrodos confiantemente induz convulsões tônico-clônicas fase 4-5 e altera as proteínas sinápticas em seu hipocampo10.
Para examinar a abundância de ECS-induzida de proteínas sinápticas em regiões específicas do cérebro dos roedores, é importante escolher os métodos experimentais que são mais adequados para a sua detecção e quantificação. Fraccionamento subcelular do cérebro permite o isolamento bruto de proteínas citosólico solúveis; proteínas de membrana; proteínas de organela-limites; e até mesmo proteínas em estruturas subcelulares especiais, tais como o PSD12,13,14. O PSD é um domínio subcellular denso e bem organizado em neurônios no qual proteínas sinápticas são altamente concentradas em e perto da membrana pós-sináptica12,13,15. O isolamento do PSD é útil para o estudo de proteínas sinápticas enriquecido no PSD, desde mudanças dinâmicas na abundância e função de receptores pós-sinápticos glutamato, andaimes proteínas e proteínas de transdução de sinal no PSD12 , 15 , 16 , 17 são correlacionadas com plasticidade sináptica e o synaptopathy observado em várias doenças neurológicas17,18. Um método de fracionamento subcelular anterior usado para purificar o PSD envolveu o isolamento da fração insolúvel em detergente da fracção bruto da membrana do cérebro pela centrifugação diferencial de gradientes de sacarose14, 19. o grande desafio com esse método tradicional é que ele requer grandes quantidades de roedores cérebros14,19. Preparação de 10-20 roedores para isolar a fração do PSD por tratamento exige extensivo custo e investimento de tempo e não é praticamente viável se existem muitos tratamentos.
Para superar este desafio, nós adaptamos um método mais simples que diretamente isola a fração do PSD, sem sacarose centrifugação gradiente20,21e revisto para ser aplicável ao isolamento do PSD do hipocampo de rato único cérebro. Nosso método de fracionamento de PSD em pequena escala produz sobre 30-50 µ g de proteínas PSD de 2 hipocampo, suficiente para o uso em vários ensaios bioquímicos, incluindo imunoprecipitação e mancha ocidental. Mancha ocidental demonstra o sucesso do nosso método para isolar o PSD, revelando o enriquecimento da proteína densidade pós-sináptica 95 (PSD-95) e a exclusão de marcador pré-sináptica Sinaptofisina e proteínas citoplasmáticas solúveis α-tubulina. Nossa indução ECS e métodos de fracionamento de PSD em pequena escala são facilmente adaptáveis para outras regiões do cérebro de roedor e fornecem uma maneira relativamente simples e confiável para avaliar os efeitos da ECS na expressão de proteínas do PSD.

<table><tbody><tr><td>Rato Spargue-Dawley</td><td>Charles River Laboratories</td><td></td><td>ECS fornece</td></tr><tr><td>um gerador de pulsos</td><td>Ugo Bsile, Comerio, Itália</td><td>57800</td><td>ECS fornece</td></tr><tr><td>sistema de purificação de água MilliQ</td><td>EMD Millipore</td><td>Z00Q0VWW</td><td>Suprimentos de fracionamento subcelular</td></tr><tr><td>Sacarose</td><td>Em ciência</td><td>SX 1075-3</td><td>Suprimentos</td></tr> <tr><td>de fracionamento subcelularNa4O7P2</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>221368</td><td>Suprimentos de fracionamento subcelular</td></tr><tr><td>Ácido etilenodiaminotetracético (EDTA)</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>E9884</td><td>Suprimentos de fracionamento subcelular</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>H0527</td><td>Suprimentos de fracionamento subcelular</td></tr><tr><td>Ácido ocdaico</td><td>TOCRIS</td><td>1136</td><td>Suprimentos de fracionamento subcelular</td></tr><tr><td>Inibidor de protease Halt</td><td>Thermo Scientific</td><td>78429</td><td>Suprimentos de fracionamento subcelular</td></tr><tr><td>NaVO3</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>72060</td><td>Suprimentos de fracionamento subcelular</td></tr><tr><td>EMD Millipore Sterito Filtros estéreis de fracionamento a vácuo</td><td>Fisher Scientific</td><td>SCGPS05RE</td><td>Suprimentos de fracionamento subcelular</td></tr><tr><td>Tesoura de íris</td><td>WPI (World Precision Instrumentos)</td><td>500216-G</td><td>Suprimentos de fracionamento subcelular</td></tr><tr><td>Placa de cultura de tecidos de 30 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772B</td><td>Suprimentos de fracionamento subcelular</td></tr><tr><td>Homogeneizador de vidro e um pilão de Teflon</td><td>VWR</td><td>89026-384</td><td>Suprimentos de fracionamento subcelular</td></tr><tr><td>Tubo de microcentrífuga de 1,7 mL</td><td>DENVILLE SCIENTIFIC INC.&nbsp;</td><td>C2170 (1001002)</td><td>Suprimentos de fracionamento subcelular</td></tr><tr><td>Centrífuga Sorvall Legend XT/XF&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>75004521</td><td>Suprimentos de fracionamento subcelular</td></tr><tr><td>Pierce BCA Protein Assay Reagent A, 500 mL</td><td>Thermo Fisher</td><td>#23228</td><td>Western blot fornece</td></tr><tr><td>Pierce BCA Protein Assay Reagent B, 25 mL</td><td>Thermo Fisher</td><td>#1859078</td><td>Western blot fornece</td></tr><tr><td>gel de poliacrilamida (SDS-PAGE)</td><td>BIO-RAD</td><td>#4561086S</td><td>Western blot fornece</td></tr><tr><td>Running Buffer</td><td>Feito no laboratório</td><td></td><td>Suprimentos de Western blot.&nbsp;</td></tr><tr><td>Célula de Eletroforese Vertical Mini-PROTEAN Tetra para Géis MiniPrecast, 4-gel</td><td>BIO-RAD</td><td>#1658004</td><td>Western blot fornece</td></tr><tr><td>membrana de difluoreto de polivinila (PVDF)&nbsp;</td>Suprimentos de Western <td>blot</td>da <td>Milipore</td><td>IPVH00010</td></tr><tr><td>Buffer de Transferência</td><td>Feito no laboratório</td><td></td><td>Suprimentos de Western blot.&nbsp;</td></tr><tr><td>Tris-base</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-1</td><td>Suprimentos de Western blot</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP381-5</td><td>Suprimentos de Western blot</td></tr><tr><td>Sódio dodecyl sulfato</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>436143</td><td>Suprimentos de Western blot</td></tr><tr><td>Metanol&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>A454-4</td><td>Western blot fornece</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151-500</td><td>detergente para isolamento PSD</td></tr><tr><td>Mini Trans-Blot Module&nbsp;</td><td>BIO-RAD</td><td>#1703935</td><td>Suprimentos de Western blot</td></tr><tr><td>Leite seco instantâneo desnatado</td><td>Ótimo valor</td><td></td><td>Suprimentos de Western blot</td></tr><tr><td>Multiuso&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>Model-2314</td><td>Western blot fornece</td></tr><tr><td>filme de autorradiografia Hyblot CL</td><td>DENVILLE SCIENTIFIC INC.&nbsp;</td><td>E3018 (1001365)</td><td>Western blot fornece</td></tr><tr><td>substrato de quimiofluorescência aprimorado&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>32106</td><td>Western blot fornece</td></tr><tr><td>um processador de filme Konica SRX-101A</td><td>KONICA MINOLTA</td><td>SRX-101A</td><td>Western blot fornece</td></tr><tr><td>Nome do Anticorpo</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PSD-95</td><td>Cell Signaling</td><td>#2507</td><td>Diluição do anticorpo = 1:500 - 1.000, tempo = 9 - 12 h, Temperatura de reação = 4 &deg; C, Espécie Hospedeira = Sinalização</td></tr><tr>Celular de<td>Sinaptofisina</td><td>de</td> Coelho<td>#4329</td><td>Diluição do anticorpo = 1:500 - 1.000, tempo = 9 - 12 h, Temperatura de Reação = 4 &graus; C, Espécie Hospedeira =</td></tr><tr><td>Alfa-Tubulina</td><td>Santacruz</td><td>SC-5286</td><td>Diluição do anticorpo = 1:500 - 1.000, tempo = 9 - 12 h, Temperatura de Reação = 4 &deg; C, Espécie Hospedeira = Camundongo</td></tr><tr><td>GluN2B</td><td>Neuromab</td><td>75-097</td><td>Diluição do anticorpo = 1:500 - 1.000, tempo = 9 - 12 h, Temperatura de reação = 4 &deg; C, Espécie hospedeira = Camundongo</td></tr><tr><td>GluA2</td><td>Sigma-aldrich</td><td>Sab 4501295</td><td>Diluição do anticorpo = 1:500 - 1.000, tempo = 9 - 12 h, Temperatura de reação = 4 &deg; C, Espécie Hospedeira = Coelho</td></tr><tr><td>STEP</td><td>Santacruz</td><td>SC-23892</td><td>Diluição do anticorpo = 1:200 - 500, tempo = 9 - 12 h, Temperatura de Reação = 4 &graus; C, Espécie Hospedeira =</td></tr><tr><td>Peroxidas AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoReserch laboratory</td><td>715-035-150</td><td>Diluição de anticorpos = 1:2.000-5.000, tempo = 1 h, Temperatura de Reação = RT, Espécie Hospedeira = Burro</td></tr><tr><td>Peroxidas AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoReserch laboratory</td><td>711-035-152</td><td>Diluição de anticorpos = 1:2.000-5.000, tempo = 1 h, Temperatura de Reação = RT, Espécie Hospedeira = Burro</td></tr></tbody></table>

eletroconvulsiva convulsões em ratos e fracionamento de seu hipocampo para examinar alterações induzidas pelo ataque em densidade pós-sináptica proteínas

Electroconvulsive Seizures in Rats and Fractionation of Their Hippocampi to Examine Seizure-induced Changes in Postsynaptic Density Proteins

Apreensão de electroconvulsive (ECS) é um modelo animal experimental de eletroconvulsoterapia, o tratamento mais eficaz para a depressão severa. ECS induz convulsões tônico-clônica generalizadas com baixa mortalidade e morte neuronal e é um modelo utilizado para droga anti-epiléptica de tela. Aqui, descrevemos um método de indução de ECS em que uma corrente de 55-mA breve é entregue para 0,5 s para macho ratos 200-250 g de peso através de eletrodos de orelha-clip. Tal estimulação bilateral produzida estágio 4-5 convulsões Clônicas que durou cerca de 10 s. Após a cessação da ECS aguda ou crônica, a maioria dos ratos recuperados para ser comportamentalmente indistinguível de sham a ratos "nenhuma apreensão". Porque ECS globalmente eleva a atividade cerebral, ele também serviu para examinar alterações de atividade-dependente de proteínas sinápticas e seus efeitos na força sináptica, usando vários métodos. Em particular, fraccionamento subcelular da densidade pós-sináptica (PSD) em combinação com mancha ocidental permite a determinação quantitativa da abundância de proteínas sinápticas nesta estrutura sináptica especializada. Em contraste com um método de fracionamento anterior que exige grande quantidade de cérebros de roedores, descrevemos aqui um método de fracionamento de pequena escala para isolar o PSD do hipocampo de rato único, sem centrifugação gradiente de sacarose. Usando esse método, mostramos que a fração isolada do PSD contém proteínas de membrana pós-sináptica, incluindo PSD95, GluN2B e GluA2. Sinaptofisina marcador pré-sináptica e proteínas citoplasmáticas solúveis α-tubulina foram excluídas a fração PSD, demonstrando bem sucedido isolamento do PSD. Além disso, a ECS crônica diminuiu GluN2B expressão no PSD, indicando que o nosso método de fracionamento de PSD em pequena escala pode ser aplicado para detectar as alterações no hipocampo proteínas PSD de um único rato após tratamentos genéticos, farmacológicos ou mecânicos .

Usar o procedimento detalhado apresentado aqui, um choque elétrico (55 mA, 100 pulsos/s para 0.5 s) entregues via orelha-clip eletrodos induzidos não recorrente estágio 4-5 convulsões tônico-clônicas em ratos (Figura 1A-B). Um total de 8 de ratos recebeu aguda indução ECS e exibido convulsões tônico-clônicas fase 4-5. As convulsões duraram cerca de 10 s e todos os ratos recuperados dentro de 1-2 min de cessação de apreensão. Sham "nenhuma apr...

Apreensão de electroconvulsive (ECS) é um modelo animal experimental de terapia eletroconvulsiva para depressão grave. ECS globalmente estimula a atividade no hipocampo, levando a sinaptogênese e plasticidade sináptica. Aqui, descrevemos os métodos para a indução de ECS em ratos e para fraccionamento subcelular de seu hipocampo para examinar alterações induzidas pelo ataque em proteínas sinápticas.

Eletroconvulsiva convulsões em ratos e fracionamento de seu hipocampo para examinar alterações induzidas pelo ataque em densidade pós-sináptica proteínas

Electroconvulsive seizure (ECS) is an experimental animal model of electroconvulsive therapy, the most effective treatment for severe depression. ECS ...

O objetivo geral da indução de convulsão elétrica e subsequente fracionamento em pequena escala do hipocampo é induzir atividade convulsiva global no cérebro de ratos e examinar alterações induzidas por convulsão em proteínas da densidade pós-sináptica do hipocampo. Este método pode ajudar a responder perguntas-chave sobre o processo neural do fenômeno, como quais proteínas sinápticas são reguladas em regiões cerebrais específicas após convulsão e se tal regulação pode contribuir para a neuroplasticidade. A principal vantagem deste protocolo de indução de convulsão elétrica é que podemos induzir de forma eficaz uma ativação global da atividade cerebral de baixo limiar sem morte neuronal.Quem demonstrará o procedimento serei eu e Han Gil Jeong do laboratório da Dra. Hee Jung Chung. Para iniciar este procedimento, coloque uma ratazana macho em uma gaiola limpa e vazia com tampa. Deixe o animal se habituar por 30 minutos, então, configure o gerador de pulsos para a indução de ECS.Prepare o gerador de pulsos pressionando o botão de reinicialização e certifique-se de que o botão de pronto esteja aceso. Verifique se as pinças auriculares não estão conectadas ao gerador de pulsos. Em seguida, pressione o botão de choque por alguns segundos e, depois, conecte as pinças auriculares ao gerador de pulsos.Neste passo, umedeça as pinças auriculares com soro fisiológico estéril e certifique-se de que estejam saturadas. Em seguida, umedeça as orelhas do rato com soro fisiológico estéril, envolvendo-as com gaze embebida em soro. Uma vez umedecidas, remova a gaze.Prenda os clipes nas orelhas, um clipe por orelha, posicionando-os além da faixa principal da cartilagem. Pressione o botão de choque por alguns segundos e observe a convulsão. Para o grupo controle simulado, sem convulsão, trate a rata da mesma forma, mas não aplique a corrente elétrica.Quando o clônus começar, desconecte os clipes auriculares e registre o comportamento convulsivo de acordo com uma escala revisada de Racine, variando de um a cinco. Isso inclui elevação sobre as patas traseiras com clônus de quatro membros no estágio quatro e elevação com queda e clônus de quatro membros no estágio cinco. A convulsão deve durar aproximadamente 10 segundos.Registre a duração da convulsão utilizando um cronômetro. Após a cessação da convulsão, retorne o rato à sua gaiola original. Monitore o rato por mais cinco minutos para garantir sua recuperação das convulsões.Mantenha-o alojado individualmente na gaiola e retorne a gaiola à sala de recuperação. Neste procedimento, coloque dois hipocampos de uma rata em uma placa de cultura tecidual de 30 milímetros e pique-os em pedaços pequenos usando tesoura. Em seguida, transfira os hipocampos picados para um homogeneizador manual de vidro e adicione um mililitro de tampão de homogeneização gelado.Em seguida, insira um pincel redondo em um homogeneizador de vidro. Enquanto o homogeneizador de vidro estiver sobre gelo, movimente suave e continuamente o pincel para cima e para baixo, de 10 a 15 vezes durante um minuto, até que os pequenos fragmentos de tecido hipocampal desapareçam. Em seguida, transfira o homogenato para um tubo de microcentrífuga de 1,7 mililitro usando uma pipeta de um mililitro e centrifugue o homogenato a 800 ×g por 10 minutos a quatro graus Celsius para separar o sobrenadante pós-nuclear do pellet contendo tecido insolúvel e núcleos.Posteriormente, transfira 50 microlitros e 950 microlitros da fração S1 para dois novos tubos de microcentrífuga de 1,7 mililitro separados e armazene esses tubos em gelo. Além disso, mantenha o pellet da fração P1 em gelo. Em seguida, centrifugue a fração S1 de 950 microlitros por 10 minutos a 13.800 × g e 4 °C para separar o sobrenadante enriquecido com proteínas solúveis citoplasmáticas do pellet enriquecido com proteínas ligadas à membrana, incluindo proteínas sinaptossomais.Transfira a fração S2 para um novo microcentrífugo de 1,7 mililitro e armazene-o em gelo. Em seguida, ressuspenda o pellet da fração P2 em 498 microlitros de água purificada gelada. Adicione dois microlitros de heeps a um molar para obter uma concentração final de quatro milimolar de heeps.Incube a suspensão a quatro graus Celsius com agitação por 30 minutos. Após 30 minutos, armazene o fracionamento P2 re-suspenso em gelo. Nesta etapa, centrifugue o fracionamento P2 por 20 minutos a 25.000 vezes G e quatro graus Celsius para separar o sobrenadante lisado e o pellet lisado.Transfira a fração LS2 para um novo tubo microcentrífugo de 1,7 mililitro e armazene-o em gelo. Em seguida, ressuspenda o pellet LP1 em 250 microlitros de hipes 50 milimolares, misturado com 250 microlitros de detergente a um por cento e 1 X PBS. Incube a suspensão a quatro graus Celsius com agitação suave por 15 minutos.Em seguida, centrifugue o pellet LP1 re-suspenso por 3 horas a 25.000 × g e 4 °C para separar o sobrenadante da fração não PSD do pellet da fração PSD. Remova o sobrenadante para um tubo microcentrífugo de 1,7 mililitro e re-suspenda o pellet da fração PSD em 100 microlitros de heeps 50 milimolar. Nesta figura, os western blots representativos mostram a expressão proteica da subunidade receptora NMDA GluN2B, receptor ampa, GluA2 e STEP 61 nas frações S2, P2 e PSD dos hipocampos de ratos submetidos a procedimento simulado, ratos sem convulsão e ratos que receberam estimulação eletroconvulsiva aguda.A proteína solúvel citoplasmática alfa-Tubulina está enriquecida na fração S2. A Sinaptofisina é uma proteína de vesículas pré-sinápticas e está enriquecida na fração de membrana bruta P2, mas não na fração PSD, enquanto a PSD-95 está enriquecida tanto nas frações P2 quanto PSD. Aqui são mostradas a quantificação de GluN2B e GluA2 nas frações P2 e PSD em três e 24 horas após a ECT aguda.A expressão de GluN2B e GluA2 na fração P2 foi normalizada em relação à alfa-Tubulina na fração S2. Na expressão de GluN2B e GluA2 na fração PSD, a normalização foi feita em relação à PSD 95 na fração PSD. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em cinco a seis horas, se for executada corretamente.Após este procedimento, pode-se realizar a espectrometria de massas automatizada, baseada em misturas de proteínas, com o objetivo de responder a questões adicionais, como quais outras proteínas sinápticas são alteradas pelo ECS. Após seu desenvolvimento, esta técnica abriu caminho para pesquisadores na área de doenças neurológicas explorarem os mecanismos subjacentes à disfunção sináptica, com vistas aos modelos animais, motores transgênicos de doenças neurológicas. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como induzir o ECS em modelos animais, realizar a homogeneização e a fracionamento da PSD a partir dos hipocampos e examinar as alterações em proteínas sinápticas após o ECS.

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Research

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Neuroscience

Neurociência

Este vídeo demonstra o registro eletroencefalográfico (EEG) de crises epilépticas em ratos induzidos por epilepsia. Um rato com eletrodos implantados no hipocampo ventral é conectado ao sistema de registro de EEG e colocado em uma câmara de plexiglass. O rato pode se mover livremente enquanto a atividade cerebral é registrada para monitorar a ocorrência de convulsões.

Registro eletroencefalográfico de crises epilépticas em ratos induzidos por epilepsia

Fonte: Soukupová, M., et al. Microdiálise de aminoácidos excitatórios durante registros de EEG em ratos em movimento livre. J. Vis. Exp. (2018)Este vídeo demonstra a avaliação dos níveis de neurotransmissores excitatórios extracelulares em ratos com indução de epilepsia crônica. Após a implantação de uma sonda de microdiálise no cérebro e a confirmação da ausência de convulsões por meio de eletroencefalografia (EEG), o fluido extracelular é coletado para avaliar níveis elevados de...

Avaliação dos níveis de neurotransmissores excitatórios em ratos induzidos por epilepsia crônica

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Induzindo uma convulsão eletroconvulsiva aguda em um modelo de rato

Este vídeo apresenta os procedimentos de preparação, gravação e análise de fonte de EEG de alta resolução em ratos sedados com um modelo pré-clínico específico de epilepsia focal em condições não invasivas.

Cérebro Fonte Imaging no rato pré-clínica Todos os modelos de Focal Epilepsia usando de alta resolução EEG Recordings

Este protocolo detalhado descreve a colocação de eletrodos de estimulação transcraniana no osso temporal a fim de investigar os efeitos a curto e longo prazo da estimulação elétrica transcraniana em ratos movimentando-se livremente.

Estimulação elétrica transcraniana crônica e gravação Intracortical em ratos

Ilustramos como executar gravação e elétrica de modulação da atividade epileptiforme 4-aminopiridina-induzida em fatias de cérebro de roedor usando matrizes de microeletrodos. Uma câmara de gravação personalizada mantém a viabilidade do tecido durante prolongadas sessões experimentais. Viver o mapeamento de eletrodo e seleção de pares estimulantes são executadas por uma interface de usuário gráfica personalizada.

Gravação e modulação da atividade epileptiforme em fatias de cérebro de roedor acoplado para matrizes de microeletrodos

Modelos de convulsão aguda são importantes para estudar os mecanismos subjacentes epileptiforme eventos. Além disso, a capacidade de gerar eventos epileptiforme sob demanda fornece um método altamente eficiente para estudar a sequência exata de eventos subjacentes a sua iniciação. Aqui, descrevemos os modelos de apreensão cortical aguda 4-aminopiridina estabelecidos em mouse e tecido humano.

Iniciação de geração e demanda de atividade estável aguda em roedores e tecido humano

Aqui, descrevemos um método na vivo microdialysis analisar a liberação de aspartato e glutamato no hipocampo ventral de ratos epilépticos e não-epiléptica, em combinação com gravações de EEG. Concentrações extracelulares de aspartato e glutamato podem ser correlacionadas com as diferentes fases da doença.

Microdialysis de aminoácidos excitatórios durante as gravações de EEG em ratos movimentando-se livremente

O desafio da pesquisa da epilepsia é desenvolver tratamentos novos para os pacientes onde a terapia clássica é inadequada. Usando um protocolo novo — com a ajuda de um sistema implantáveis da entrega da droga — nós podemos controlar apreensões em ratos anestesiados pela entrega electrophoretic de GABA no foco epileptic.

A entrega electrophoretic do ácido γ-aminobutyric (GABA) no foco epileptic impede apreensões nos ratos

O protocolo apresentado descreve o transporte e a preparação de tecido hipocampal humano ressecado com o objetivo final de usar fatias cerebrais vitais como uma ferramenta de avaliação pré-clínico para potenciais substâncias antiepilépticas.

Preparação de fatias hipocampais humanas agudas para gravações eletrofisiológicas

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Preparação e implantação de eletrodos para kindling elétrico de camundongos VGAT-CRE para gerar um modelo para epilepsia do lobo temporal

Aprenda a induzir convulsões eletroconvulsivas em ratos e fracionar o hipocampo para examinar alterações em proteínas da densidade pós-sináptica. Este método permite estudar neuroplasticidade e disfunção sináptica.

Eletroconvulsiva convulsões em ratos e fracionamento de seu hipocampo para examinar alterações induzidas pelo ataque em densidade pós-sináptica proteínas (Vídeo) | JoVE Journal

Eletroconvulsiva convulsões em ratos e fracionamento de seu hipocampo para examinar alterações induzidas pelo ataque em densidade pós-sináptica proteínas

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