Eletroconvulsiva convulsões em ratos e fracionamento de seu hipocampo para examinar alterações induzidas pelo ataque em densidade pós-sináptica proteínas

O objetivo geral da indução de convulsões eletroconvlusivas e subsequente fracionamento em pequena escala do hipocampo é induzir a atividade convulsiva global no cérebro de ratos e examinar as alterações induzidas pela atividade convulsiva de proteínas na densidade pós-sináptica do hipocampo. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no processo neural do filme, como quais proteínas blácticas são reguladas em regiões específicas do cérebro após a convulsão e se essa regulação pode contribuir para a neuroplasticidade. A principal vantagem deste protocolo de indução de convulsões eletroconvulsivas é que podemos induzir vivamente a elevação lo-bal da atividade cerebral sem morte neuronal.

Demonstrando o procedimento estaremos eu e Han Gil Jeong do laboratório do Dr. Hee Jung Chung. Para iniciar este procedimento, coloque um rato macho em uma gaiola limpa e vazia com tampa. Deixe o rato se habituar por 30 minutos e, em seguida, defina o gerador de pulsos para indução de ECS.

Prepare o gerador de pulsos pressionando o botão de reinicialização e certifique-se de que o botão de pronto esteja aceso. Certifique-se de que os clipes de ouvido não estejam conectados ao gerador de pulsos. Em seguida, pressione o botão de choque por alguns segundos e, em seguida, conecte os clipes de ouvido ao gerador de pulso.

Nesta etapa, molhe os clipes auriculares com solução salina estéril e certifique-se de que estejam saturados. Em seguida, molhe as orelhas do rato com soro fisiológico estéril, envolvendo-as em gaze embebida em soro fisiológico. Quando estiverem molhados, remova a gaze.

Prenda os clipes nas orelhas em um clipe por orelha e posicione-os além da faixa de cartilagem principal. Pressione o botão de choque por alguns segundos e observe a convulsão. Para a farsa, sem controle de convulsão, trate o rato de forma idêntica, mas não entregue a corrente.

Quando o clônus começar, desconecte os clipes auriculares e registre o comportamento convulsivo de acordo com uma escala de Racine revisada de um a cinco. Isso inclui a criação com clônus de quatro membros no estágio quatro e a criação e queda com clônus de quatro membros no estágio cinco. A convulsão deve durar aproximadamente 10 segundos.

Registre a duração da convulsão usando um cronômetro. Após o término da convulsão, devolva o rato à sua gaiola de origem. Monitore o rato por mais cinco minutos para garantir sua recuperação das convulsões.

Mantenha-o alojado individualmente na gaiola e devolva a gaiola para a sala de recuperação. Neste procedimento, coloque dois hipocampos de um rato em uma placa de cultura de tecidos de 30 milômetros e pique-os em pedaços pequenos usando uma tesoura. Depois disso, transfira o hipocampo picado para um homogeneizador de vidro manual e adicione um mililitro de tampão de homogeneização a frio gelado.

Em seguida, insira uma pecil redonda em um homogeneizador de vidro. Enquanto o homogeneizador de vidro estiver no gelo, acaricie suave e firmemente o pecil, 10 a 15 vezes por um minuto até que pequenos pedaços de tecido do hipocampo desapareçam. Em seguida, transfira o homogenote para um tubo de microcentrífuga de 1,7 milômetro usando uma pipeta de um milômetro e centrifugue o homogenota a 800 vezes G por 10 minutos a quatro graus Celsius para separar o sobrenadante pós-nuclear do pellet contendo tecido e núcleos insolúveis.

Em seguida, transfira 50 microlitros e 950 microlitros da fração S1 para dois novos tubos de microcentrífuga de 1,7 mililitro separados e armazene esses tubos no gelo. Além disso, guarde o pellet da fração P1 no gelo. Em seguida, centrifugue a fração S1 de 950 microlitros por 10 minutos a 13.800 vezes G e quatro graus Celsius para separar o sobrenadante enriquecido com proteínas solúveis citosólicas e o pellet enriquecido com proteínas ligadas à membrana, incluindo proteínas sinaptossômicas.

Transfira a fração S2 para uma nova microcentrífuga de 1,7 mililitro e armazene-a no gelo. Em seguida, ressuspenda o pellet da fração P2 em 498 microlitros de água purificada gelada. Adicione dois microlitros de heeps de um molar para atingir uma concentração final de quatro heeps milimolares.

Incubar a suspensão a quatro graus Celsius com agitação por 30 minutos. Após 30 minutos, conservar a fracção P2 ressuspensa no gelo. Nesta etapa, centrifugar a fração P2 por 20 minutos a 25.000 vezes G e quatro graus Celsius para separar o sobrenadante lisado e o pellet lisado.

Transfira a fração LS2 para um novo tubo de microcentrífuga de 1,7 mililitro e armazene-o no gelo. Em seguida, ressuspenda o pellet LP1 em 250 microlitros a 50 milimolares heeps, misturado com 250 microlitros de detergente a um por cento e 1 X PBS. Incubar a suspensão a quatro graus Celsius com agitação suave durante 15 minutos.

Em seguida, centrifugue o pellet LP1 ressuspenso por 3 horas a 25.000 vezes G e quatro graus Celsius para separar o sobrenadante da fração não PSD do pellet da fração PSD. Remova o sobrenadante para um tubo de microcentrífuga de 1,7 mililitro e ressuspenda o pellet PSD em 100 microlitros de heeps de 50 milimolares. Nesta figura, os western blots representativos mostram a expressão proteica da subunidade receptiva NMDA GluN2B, receptor ampa, GluA2 e STEP 61 nas frações S2, P2 e PSD do hipocampo de ratos simulados, sem convulsão e ratos que receberam ECS agudo.

A proteína solúvel citoplasmática alfa-tubulina é enriquecida na fração S2. A sinaptofisina é uma proteína de vesícula pré-sináptica e é enriquecida na fração P2 da membrana bruta, mas não na fração PSD, enquanto a PSD-95 é enriquecida nas frações P2 e PSD. Aqui são mostradas a quantificação de GluN2B e GluA2 nas frações P2 e PSD em três e 24 horas após o ECS agudo.

A expressão de GluN2B e GluA2 na fração P2 foi normalizada para alfa-tubulina na fração S2. Em GluN2B e GluA2 expressão na fração PSD, foi normalizada para PSD 95 na fração PSD. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em cinco a seis horas se for executada corretamente.

Seguindo este procedimento, auto-masser como massa, espectrometria, com base na mistura de proteínas pode ser realizada para responder a perguntas adicionais, quais outras proteínas sinápticas são alteradas pelo ECS. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo das doenças neurológicas explorarem o mecanismo subjacente da disfunção sináptica para o ato de leis, transmitindo motores de doenças neurológicas. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como induzir o ECS em leis, realizar homogeneização e fracionamento de PSD a partir do hipocampo e examinar alterações de proteínas sinápticas após ECS.