Estudo do retículo endoplasmático e mitocôndrias Interações por In Situ Proximidade Ligadura Ensaio em células fixas
10 de dezembro de 2016
Aqui, descrevemos um procedimento para visualizar e quantificar com alta sensibilidade as interações endógenos entre o retículo endoplasmático e mitocôndrias nas células fixas. O protocolo apresenta um otimizado no ensaio de ligação de proximidade situ visando o inositol 1,4,5-trifosfato de receptor / proteína regulada por glucose 75 / complexo D canal de ânions / ciclofilina dependente da tensão na interface membrana associada à mitocôndria.
O objetivo geral deste experimento é visualizar e quantificar as interações mitocôndrias do retículo endoplasmático usando um ensaio de ligação de proximidade in situ em células fixas. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo biomédico para analisar melhor as interações das mitocôndrias ER em células fixas usando uma técnica simples de imunofluorescência. Esperançosamente, sugerindo novas estratégias de tratamento. A principal vantagem desta técnica é que podemos visualizar e quantificar as interações das mitocôndrias do RE em células fixas e esta técnica pode ser aplicada a biópsias de tecido embebidas em parafina de pacientes. Usando o ensaio de ligação de proximidade in situ demonstrado neste vídeo, um anticorpo primário de camundongo direcionado contra VDAC1 na membrana mitocondrial externa e um anticorpo primário de coelho direcionado contra IP3R1 na membrana do retículo endoplasmático combinam-se com seus epítopos próximos na interface da membrana associada mitocondrial. Sondas de ligação de proximidade que têm caudas de extremidade de DNA anexadas e que são direcionadas contra IgG de camundongo e coelho são adicionadas e podem formar modelos para a ligação de oligos conectores e podem ser amplificadas e visualizadas usando oligonucleotídeos vermelhos do Texas. De acordo com a distância entre as duas membranas de organelas, na interface da membrana associada mitocondrial. Para fixar e bloquear células para o ensaio de ligação de proximidade in situ, colocar células H7 humanas em placas a 150.000 células por prato de fundo de vidro não codificado de 35 mm. No dia seguinte, remova o meio de cultura e use 1 mL de PBS para lavar as células. Em seguida, aspire o tampão e adicione 1 mL de dez por cento de formaldeído. Incube as placas em temperatura ambiente com agitação por 10 minutos para fixar as células. Para interromper a reação, adicione 1 mL de glicina 1 M e misture as placas por rotação. Remova a solução de glicina e adicione 1 mL de 1XPBS. Em seguida, agite brevemente as placas e aspire o tampão. Em seguida, adicione 1 mL de glicina 100 mM às células. Incube as placas em temperatura ambiente com agitação por 15 minutos. Após aspirar a solução, permeabilize as células adicionando 1 mL de 0,1% de triton-X100 em PBS. E repita a incubação. Aspire o detergente e adicione 1 mL de PBS para lavar as células. Depois de remover o tampão, adicione 40 microlitros de solução de bloqueio a cada prato de células e incube as amostras em uma câmara úmida a 37 graus Celsius por 30 minutos. Em seguida, retire a solução de bloqueio dos pratos, tentando obter volumes residuais iguais de tampão para cada lâmina, sem permitir que as lâminas sequem. Para realizar o ensaio de ligadura de proximidade, use PBS para diluir os anticorpos primários. Vortex e adicione a solução aos pratos. Incubar as amostras a 4
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Visão Geral
Este artigo apresenta um procedimento para visualizar e quantificar as interações entre o retículo endoplasmático e as mitocôndrias em células fixadas com alta sensibilidade. O método utiliza um ensaio de ligação por proximidade in situ otimizado para direcionar complexos proteicos específicos na interface da membrana associada às mitocôndrias.
Componentes Principais do Estudo
Área de Ciência
- Biologia Celular
- Neurociência
- Bioquímica
Contexto
- O retículo endoplasmatico e as mitocôndrias desempenham papéis cruciais no metabolismo celular.
- Compreender suas interações é essencial para elucidar as funções celulares.
- Os ensaios de ligação por proximidade oferecem um método sensível para estudar interações proteicas.
- Este estudo concentra-se em um complexo proteico específico envolvido nessas interações.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um método para visualizar as interações entre retículo endoplasmático e mitocôndrias.
- Quantificar essas interações com alta sensibilidade.
- Aprimorar a compreensão do metabolismo e sinalização celular.
Métodos Utilizados
- Ensaio de ligação por proximidade in situ
- Direcionamento do receptor de inositol 1,4,5-trifosfato
- Participação da proteína regulada pela glicose 75
- Análise do complexo canal dependente de voltagem e ciclofilina D
Resultados Principais
- Visualização bem-sucedida das interações entre retículo endoplasmático e mitocôndrias.
- Quantificação de complexos proteicos na interface da membrana.
- Demonstração de alta sensibilidade na detecção de interações.
Conclusões
- O protocolo desenvolvido permite o estudo detalhado das interações celulares.
- Os conhecimentos obtidos podem contribuir para a compreensão dos processos metabólicos.
- Este método pode ser aplicado a diversas áreas de pesquisa biológica.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A quantificação das interações endógenas entre retículo endoplasmatico e mitocôndrias é essencial para reduzir riscos em hipóteses iniciais de descoberta relacionadas à sinalização celular e regulação metabólica. O ensaio de ligação por proximidade in situ permite a detecção sensível e multiplexada de sítios de contato entre organelas sem superexpressão proteica, reforçando a confiança preditiva em sistemas relevantes para doenças. Essa capacidade fortalece decisões sobre portfólios na interseção entre validação de alvos e análise de vias mecanicistas.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvos
- Permite a visualização direta e a quantificação de contatos entre retículo endoplasmático e mitocôndrias no nível molecular.
- Apoia a desmistificação mecanicista ao confirmar a proximidade de proteínas endógenas em células fixadas e biópsias de tecidos.
- Facilita a validação funcional de alvos em vias envolvendo sinalização de cálcio e comunicação entre organelas.
- Aprimora a confiança preditiva para o avanço de alvos implicados em distúrbios metabólicos e de sinalização.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaio
- Fornece um ensaio padronizado e reprodutível para quantificar interações proteína-proteína com resolução suborganellar.
- Permite testes multiplos condições para avaliar o impacto de compostos ou perturbações genéticas nos contatos entre retículo endoplasmático e mitocôndrias.
- Oferece saídas quantitativas adequadas para análise comparativa entre braços experimentais.
- Permite escalabilidade do ensaio e reutilização da plataforma para iniciativas mais amplas de triagem.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha-se a sistemas relevantes para doenças ao permitir a análise em biópsias de tecido derivadas de pacientes.
- Mantém a continuidade translacional, desde a descoberta até a validação pré-clínica de alvos de interação entre organelas.
- Apoia o avanço ajustado ao risco ao fornecer evidências mecanicistas do envolvimento da via.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este ensaio de ligação por proximidade in situ conecta a fase inicial de descoberta e a pesquisa pré-clínica, permitindo a quantificação robusta das interações entre o retículo endoplasmático e as mitocôndrias em células e tecidos fixados.
- Biologia da Descoberta: Apoia a testagem de hipóteses e a clarificação de vias em mecanismos de crosstalk entre organelas.
- Triagem: Fornece leituras quantitativas e reprodutíveis para campanhas de triagem de compostos ou genéticas.
- Análises: Permite detecção sensível da proximidade proteica abaixo de 40 nm, possibilitando comparação estatística das frequências de interação.
- Pesquisa Translacional: Facilita o alinhamento de biomarcadores e a validação mecanicista em amostras relevantes para doenças.
- Reutilização Empresarial: Oferece uma plataforma reutilizável para diversos estudos de interação proteica em múltiplos programas de P&D.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva e reduz a ambiguidade mecanicista na validação de alvos.
- Valor Operacional: Padroniza a detecção de interações proteicas endógenas com alta sensibilidade e especificidade.
- Valor Estratégico: Permite decisões mais assertivas de avançar/não avançar ao fornecer dados mecanicistas robustos no início do processo.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização e o avanço ajustados ao risco de alvos com perfis de interação em organelas validados.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em protocolos de imunofluorescência e ensaio de ligação por proximidade.
- Necessita de acesso a anticorpos de alta qualidade e infraestrutura de imagem de fluorescência.
- Exige padronização entre equipes para quantificação reprodutível entre estudos.
- Adaptável a linhagens celulares e biópsias de tecido embebidas em parafina, com relevância translacional.
- Limitado a amostras fixadas; não é adequado para estudos de interações dinâmicas em células vivas.
