Estudo do retículo endoplasmático e mitocôndrias Interações por In Situ Proximidade Ligadura Ensaio em células fixas

O objetivo geral deste experimento é visualizar e quantificar as interações mitocôndrias do retículo endoplasmático usando um ensaio de ligação de proximidade in situ em células fixas. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo biomédico para analisar melhor as interações das mitocôndrias ER em células fixas usando uma técnica simples de imunofluorescência. Esperançosamente, sugerindo novas estratégias de tratamento. A principal vantagem desta técnica é que podemos visualizar e quantificar as interações das mitocôndrias do RE em células fixas e esta técnica pode ser aplicada a biópsias de tecido embebidas em parafina de pacientes. Usando o ensaio de ligação de proximidade in situ demonstrado neste vídeo, um anticorpo primário de camundongo direcionado contra VDAC1 na membrana mitocondrial externa e um anticorpo primário de coelho direcionado contra IP3R1 na membrana do retículo endoplasmático combinam-se com seus epítopos próximos na interface da membrana associada mitocondrial. Sondas de ligação de proximidade que têm caudas de extremidade de DNA anexadas e que são direcionadas contra IgG de camundongo e coelho são adicionadas e podem formar modelos para a ligação de oligos conectores e podem ser amplificadas e visualizadas usando oligonucleotídeos vermelhos do Texas. De acordo com a distância entre as duas membranas de organelas, na interface da membrana associada mitocondrial. Para fixar e bloquear células para o ensaio de ligação de proximidade in situ, colocar células H7 humanas em placas a 150.000 células por prato de fundo de vidro não codificado de 35 mm. No dia seguinte, remova o meio de cultura e use 1 mL de PBS para lavar as células. Em seguida, aspire o tampão e adicione 1 mL de dez por cento de formaldeído. Incube as placas em temperatura ambiente com agitação por 10 minutos para fixar as células. Para interromper a reação, adicione 1 mL de glicina 1 M e misture as placas por rotação. Remova a solução de glicina e adicione 1 mL de 1XPBS. Em seguida, agite brevemente as placas e aspire o tampão. Em seguida, adicione 1 mL de glicina 100 mM às células. Incube as placas em temperatura ambiente com agitação por 15 minutos. Após aspirar a solução, permeabilize as células adicionando 1 mL de 0,1% de triton-X100 em PBS. E repita a incubação. Aspire o detergente e adicione 1 mL de PBS para lavar as células. Depois de remover o tampão, adicione 40 microlitros de solução de bloqueio a cada prato de células e incube as amostras em uma câmara úmida a 37 graus Celsius por 30 minutos. Em seguida, retire a solução de bloqueio dos pratos, tentando obter volumes residuais iguais de tampão para cada lâmina, sem permitir que as lâminas sequem. Para realizar o ensaio de ligadura de proximidade, use PBS para diluir os anticorpos primários. Vortex e adicione a solução aos pratos. Incubar as amostras a 4