Name: O Método CrioAPEX para Análise de Microscopia Eletrônica da Localização da Proteína da Membrana dentro de células ultraestruturalmente preservadas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 45 s
Description: Aprenda o método crioAPEX para localização precisa de proteínas de membrana em células HEK293 preservadas por criofixação. Esta técnica combina a marcação APEX2 com microscopia eletrônica para estudar mecanismos virais.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

O protocolo aqui descrito decorre de uma publicação de Sengupta et al., Journal of Cell Science, 132 (6), jcs22315 (2019)48. Este trabalho é apoiado por subsídios R01GM10092 (para S.M.) e AI081077 (R.V.S.) dos Institutos Nacionais de Saúde, CTSI-106564 (para S.M.) do Indiana Clinical and Translational Sciences Institute, e PI4D-209263 (to S.M.) do Instituto purdue university de inflamação, imunologia, imunologia e doença infecciosa.

1. Cultura Celular e Transfecção
<ol><li>As células HEK-293T de sementes em um prato de 60 mm de diâmetro ou cultura tecidual maior e crescem para 60% a 90% de confluência em uma incubadora de cultura celular a 37 °C e 5% de CO2.</li>
	<li>Células transfect com plasmídeos de expressão mamífero com apex2 com marca ção de forma ativa da transfecção usando reagente transfection (ver Tabela de Materiais) de acordo com as instruções do fabricante.</li>
	<li>Às 12 h e 15 h após a transfecção, lave células uma vez com soro lona tampão de fosfato (PBS). Remova as células do prato lavando suavemente com PBS. Um reagente dissociante, como a trippsina, pode ser usado se necessário para um determinado tipo de célula. Centrífuga a 500 x g por 5 min para formar uma pelota.
</li>
</ol>2. Fixação Química e Reação Peroxidase
<ol><li>Remova cuidadosamente o supernatant e resuspenda a pelota em 2 mL de 2% glutaraldeído (v/v) em 0,1 M tampão cacodylate de sódio, pH 7.4, em temperatura ambiente. Coloque a amostra no gelo e incuba por 30 min. Pelota a amostra a 500 x g por 5 min a 4 °C. Deste ponto até a etapa 2.3.3, mantenha a amostra e as soluções no gelo e realize a centrífuga a 4°C. ATENÇÃO: Tanto o glutaraldeído quanto o tampão cacodylate de sódio (contendo arsênico) são tóxicos. Os procedimentos de segurança adequados e equipamentos de proteção individual devem ser utilizados durante o manuseio. Soluções contendo glutaraldeído e/ou tampão cacodylate de sódio devem ser descartadas como resíduos químicos perigosos.</li>
	<li>Lave a pelota 3x por 5 min com 2 mL de 0,1 M tampão de cacodylate de sódio. Para estas, bem como lava-louças subsequentes, suspenda suavemente a pelota celular na solução necessária, em seguida, centrífuga por 5 min a 500 x g e remover cuidadosamente e descartar o supernatant. Deve-se tomar cuidado com as repetidas etapas de pelotização e resuspensão, a fim de minimizar a perda amostral.</li>
	<li>Realizar a reação peroxidase<ol>
<li>Prepare uma nova solução contendo 1 mg/mL de 3,3'-diaminobenzidina tetraclorato (DAB) em 0,1 M tampão de catequeiro de sódio. Dissolva o DAB por vórtice vigorosa por 5-10 min. ATENÇÃO: O DAB é tóxico e um potencial cancerígeno e deve ser tratado com procedimentos de segurança adequados e equipamentos de proteção individual. As soluções que contenham da DAB devem ser tratadas como resíduos químicos perigosos.</li>
		<li>Lave pelotas resuspendendo em 3 mL de solução DAB seguida de pelotas a 500 x g por 5 min.</li>
		<li>Resuspender a pelota em solução DAB de 3 mL à qual o peróxido de hidrogênio foi adicionado para alcançar uma concentração final de 5,88 mM. Incubar por 30 min na temperatura do quarto. A pelota fica visivelmente de cor marrom indicando a presença do produto de reação insolúvel da DAB. NOTA: O tempo de incubação do DAB pode precisar ser otimizado para cada amostra. A mudança de cor pode ser monitorada no microscópio de luz. Em nossa experiência, uma incubação de 15 a 45 min é adequada para a maioria das proteínas. O peróxido de hidrogênio deve ser obtido a partir de uma garrafa recém-aberta ou uma que foi mantida bem lacrada após a abertura.</li>
		<li>Contine as células, depois lave 2x por 5 min com tampão de cacodylate de sódio de 0,1 M, seguido por uma lavagem no meio modificado da Águia de Dulbecco (DMEM) ou mídia celular de escolha.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Resuspender a pelota celular em 500 μL de uma solução crio-protetora de DMEM (ou outra mídia celular escolhida) contendo 10% de soro bovino fetal e 15% de albumina de soro bovino 15%. Pelota novamente, aumentando ligeiramente a velocidade de centrífuga de 500 x g se necessário para alcançar uma pelota na espessa solução crio-protetora. Descarte a maioria do supernatante, garantindo que reste líquido suficiente para que a pelota não seque. Transporte a pelota celular para o instrumento de congelamento de alta pressão.</li>
</ol>3. Congelamento de alta pressão
<ol><li>Encha o reservatório congelador de alta pressão com nitrogênio líquido (LN2)e inicie a bomba para encher a câmara de amostra com LN2. ATENÇÃO: Use procedimentos de segurança adequados e equipamentos de proteção individual ao trabalhar com nitrogênio líquido. NOTA: Estas etapas são específicas para o congelador de alta pressão Leica EMPACT2.</li>
	<li>Afaste qualquer líquido restante da pelota celular usando o canto de um lenço de laboratório ou toalha de papel. O líquido suficiente deve permanecer para que a pelota forme uma pasta semelhante na consistência à pasta de dente. Deve ser fino o suficiente para ser aspirado em uma ponta de tubo de 20 μL.</li>
	<li>Aspirar 2-3 μL da pelota celular e depositá-la em um portador de membrana. Encha completamente o poço do portador da membrana, para que a tensão superficial crie uma leve cúpula em cima, mas o líquido não derrama do poço. Nenhuma bolha de ar deve estar presente.</li>
	<li>Deslize o porta-membrana para dentro do cartucho e proteja. Coloque o cartucho na máquina HPF que foi preparado e preparado, e pressione comece a congelar.</li>
	<li>Inspecione a temperatura versus tempo e a pressão versus gráficos de tempo para verificar se a pressão atingiu 2100 barras e a temperatura chegou a -196 °C dentro de 200 ms, e ambos os parâmetros permaneceram estáveis para os 600 ms de medição.</li>
	<li>Repita as etapas de 3,3 a 3,5 até que a pelota celular tenha sido usada ou o número desejado de amostras tenha sido congelado.</li>
	<li>Mantendo os cartuchos imersos em LN2,remova cada porta-membrana de seu cartucho, coloque em uma cápsula de plástico e coloque a cápsula de plástico em um crio-frasco cheio de LN2. NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui. Os crio-frascos com amostras podem ser armazenados em uma deguerra LN2 em crio-canas ou crio-caixas.</li>
</ol>4. Substituição de congelamento
ATENÇÃO: Use procedimentos de segurança adequados e equipamentos de proteção individual ao trabalhar com nitrogênio líquido. Além disso, muitos dos produtos químicos utilizados na etapa 4 são tóxicos, incluindo ácido tânnico, tetróxido de osmio e acetato de uranyl. Esses produtos químicos devem ser manuseados de acordo com os procedimentos de segurança adequados e descartados como resíduos químicos perigosos.
<ol><li>Preencha a unidade automatizada de substituição de congelamento com LN2. Leve a temperatura para -90 °C.</li>
	<li>Prepare o FS Mix 1 e comece a FS.<ol>
<li>Em uma capa química, prepare uma solução de 0,2% de ácido tânnico (w/v) e 5% de água DI em acetona e alíquota 1 mL por amostra em crio-frascos. Coloque em LN2 para congelar.</li>
		<li>Coloque os frascos FS Mix 1 e os crio-frascos contendo as pelotas de células congeladas na câmara amostral da unidade FS. Transfira a cápsula interna contendo o porta-membrana do frasco LN2 para o frasco correspondente contendo FS Mix 1.</li>
		<li>Inicie um protocolo de FS com seu primeiro passo sendo 24 h a -90°C. Após as 24 horas, pausa ras, e lave as amostras 3x por 5 min com acetona que foi resfriado para -90 °C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prepare fs mix 2 e fs completo ATENÇÃO: O tetróxido de osmio é um produto químico altamente tóxico e oxidante que só deve ser manuseado por indivíduos treinados de acordo com protocolos de segurança estabelecidos. Devem ser seguidos protocolos para armazenamento e descarte de soluções contendo odômio, bem como rotulagem de áreas de laboratório onde o tetróxido de osmio está em uso. O tetróxido de osmio deve ser manuseado em uma capa química com equipamentos de proteção individual, incluindo proteção ocular, um jaleco que fornece proteção completa do braço, luvas de nitrile duplas e um respirador opcional.<ol>
<li>Em uma capa química, prepare uma solução de 1% de tetróxido de osmômio, acetato de uranyl de 0,2% e 5% de água DI em acetona. Aliquot 1 mL por amostra em crio-frascos e coloque em LN2 para congelar. NOTA: As soluções de estoque de ácido tânico (10% w/v na acetona), tetróxido de osmio (10% w/v na acetona) e acetato uranyl (8% w/v no metanol) podem ser preparadas e armazenadas em crio-frascos em uma guerra de LN2 para facilitar a preparação das FS Mixes.</li>
		<li>Coloque os crio-frascos com FS Mix 2 para a unidade FS e transfira as cápsulas da terceira lavagem acetona para os frascos FS Mix 2. Incubar no FS Mix 2 por 72 h a -90 °C, seguido pelo aquecimento gradual para 0 °C acima de 12-18 h.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mantenha a temperatura em 0 °C e lave 3x por 30 min com acetona pré-resfriada de uma garrafa recém-aberta.</li>
</ol>5. Infiltração de Resin e Incorporação
ATENÇÃO: A resina utilizada aqui (ver Tabela de Materiais) é tóxica antes da polimerização, e deve ser tratada com procedimentos de segurança adequados e equipamentos de proteção individual. Qualquer resina não polimerizada deve ser descartada como resíduos químicos perigosos.
<ol><li>Infiltrar-se nas amostras com concentrações crescentes de resina dissolvidas em acetona de uma garrafa recém-aberta. Prepare uma mistura de componentes de resina A, B e D em um béquer plástico de acordo com as direções do fabricante, e incuba amostras nas seguintes concentrações de resina: 2%, 4% e 8% para 2h cada a 0°C. Incubar em 15%, 30%, 60%, 90%, e 100% de resina para 4h cada uma à temperatura ambiente. Incubar por 4 h em uma mistura de componentes A, B, C e D.</li>
	<li>Coloque os portadores de membrana com o lado da pelota celular em moldes de incorporação plana e encha com resina (A, B, C e D). Os rótulos de papel das amostras podem ser adicionados aos poços neste momento.</li>
	<li>Polimerize em um forno a 60 °C por 24-36 h. NOTA: O protocolo pode ser pausado após a polimerização.</li>
	<li>Retire os blocos do molde e deixe esfriar. Para remover o porta-membrana, coloque primeiro a amostra no mchuck vertical do ultramicrotome onde pode ser visualizada com ampliação. Separe o porta-membrana do bloco por uma combinação de nitrogênio líquido no porta-membrana para separar o metal do plástico e usar uma lâmina de barbear para cortar a resina ao redor do porta-membrana. Quando separado, levante suavemente o porta-membrana deixando a cúpula da pelota celular na face do bloco.</li>
	<li>Coloque o bloco com a pelota de célula exposta voltada para cima em um molde de incorporação plana que é ligeiramente mais profundo que o primeiro molde, e encha com resina. Polimerize a 60 °C por 24-36 h. NOTA: O protocolo pode ser pausado após a polimerização.</li>
</ol>6. Seccional
<ol><li>Corte o bloco ao redor da pelota celular usando uma lâmina de barbear. Em seguida, coloque o bloco no mandril de amostra no braço seccional de um ultramicrotome. Usando um vidro ou uma faca de diamante, corte o bloco em uma forma trapezoidal ao redor da pelota celular.</li>
	<li>Obtenha 90 nm seções ultrafinas da pelota celular usando um vidro ou faca de diamante.</li>
	<li>Pegue uma fita de seções em uma grade TEM. As grades de caça-níqueis revestidas de formvar (slot de 1 x 2 mm2) são úteis para seções de série de imagem. Seque a grade manchando a borda em um pedaço de papel filtro e armazene em uma caixa de armazenamento de grade TEM. NOTA: O protocolo pode ser pausado após a secção.</li>
</ol>7. Tem Imagem
<ol><li>Monte a grade no suporte tem e coloque no microscópio. Usamos rotineiramente um Tecnai T12 a 80 kV para triagem de amostras crioAPEX. Adquirir imagens de células e estruturas subcelulares de interesse com rotulagem APEX2.</li>
	<li>Se desejar, obtenha contraste de membrana adicional pelo uso de chumbo pós-coloração. Consulte a Figura 2 para comparação de amostras não manchadas(Figura 2I-K) e leve amostras pós-manchadas(Figura 2A-H).<ol>
<li>Flutue grades secas de lado para baixo em uma gota de solução diluída de cloreto de sódio (~1,5 mM), 2x por 1 min cada, depois 1x por 10 min.</li>
		<li>Grades flutuantes em uma gota da solução de chumbo de Sato por 1 min. Lave flutuando na solução de cloreto de sódio 3x por 1 min, em seguida, na água DI 3x por 1 min. Blot excesso de líquido das grades e armazenar em uma caixa de grade. ATENÇÃO: O chumbo é um produto químico tóxico e deve ser tratado com procedimentos de segurança adequados e equipamentos de proteção individual. Soluções contendo chumbo devem ser descartadas como resíduos químicos perigosos.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Imagem amostras pós-manchadas no TEM. NOTA: Na preparação tradicional da amostra para TEM, o passo contrastante de chumbo é realizado antes da imagem TEM. No entanto, recomenda-se que para amostras crioAPEX, a imagem seja realizada primeiro em amostras não contrastadas. Isso garante que o sinal da tag possa ser facilmente localizado pelo seu forte contraste com as estruturas celulares mais levemente manchadas. Para muitas amostras, não será necessária mais manchas; no entanto, se for desejado contraste adicional de membrana, a pós-coloração do chumbo pode ser realizada (Passo 7.2) e a amostra re-imaged.</li>
</ol>

Os autores não declaram conflito de interesses.

O protocolo crioAPEX aqui apresentado fornece um método robusto para caracterizar a localização das proteínas da membrana dentro do ambiente celular. Não só o uso de uma tag APEX2 geneticamente codificada fornece localização precisa de uma proteína de interesse, mas o uso de criofixação e desidratação de baixa temperatura proporciona excelente preservação e coloração da ultraestrutura celular circundante. Combinados, essas abordagens são uma poderosa ferramenta para localizar uma proteína com alta precisão dentro de seu ...

Estudos biológicos muitas vezes incluem questões de resolução de localização de proteínasubcelular dentro de células e organelas. A microscopia de imunofluorescência fornece uma visão útil de baixa resolução da localização de proteínas, e os recentes avanços na imagem de superresolução estão empurrando os limites de resolução para proteínas fluorescentesmarcadas 1,2,3. No entanto, a microscopia eletrônica (EM) continua sendo o padrão-ouro para a ultraestrutura celular de alta resolução por imagem, embora a rotulagem de proteínas seja um desafio.
Historicamente, vários métodos EM têm sido usados para abordar questões de localização de proteínas ultraestruturais. Um dos métodos mais utilizados é a microscopia imunoeletrônica (IEM), onde anticorpos primários específicos de antígeno são usados para detectar a proteína de interesse. O sinal EM é gerado pela aplicação de anticorpos secundários conjugados com partículas densas eletrônicas, mais comumente ouro coloidal4,5. Alternadamente, anticorpos conjugados com enzimas como peroxidase de rabanete de cavalo (HRP) podem ser usados para produzir um precipitado elétron-denso6,7,8. Existem duas abordagens principais para o IEM, denominada rotulagem pré-incorporação e post-incorporação. Na pré-incorporação do IEM, os anticorpos são introduzidos diretamente nas células, o que requer fixação de luz e permeabilização das células9,10,11. Ambas as etapas podem danificar a ultraestrutura12,13. O desenvolvimento de anticorpos significativamente menores que consistem em um fragmento fab anticorpo conjugado com nanogold de 1,4 nm permite que condições muito suaves de permeabilização sejam usadas; no entanto, o nanogold é muito pequeno para visualização direta TEM e requer passos adicionais de aprimoramento para se tornar visível14,15,16. No IEM pós-incorporação, os anticorpos são aplicados em finas seções de células que foram totalmente processadas por fixação, desidratação e incorporação em resina17. Embora essa abordagem evite a etapa de permeabilização, preservar o epítopo de interesse ao longo da preparação da amostra é desafiador18,19,20. O método tokuyasu de fixação de luz seguido de congelamento, seção crio-seccional e detecção de anticorpos fornece melhor preservação de epitope21,22. No entanto, os requisitos técnicos da crio-ultramicrotomia, bem como o contraste abaixo do ideal alcançado na célula, são desvantagens23.
O uso de tags geneticamente codificadas elimina muitas das dificuldades do IEM relacionadas à detecção da proteína de interesse. Estão disponíveis uma variedade de tags, incluindo HRP, ferritin, ReAsH, miniSOG e metallothionein24,25,26,27,28,29,30,31,32. Cada um deles tem vantagens em relação aos métodos anteriores, mas cada um também tem desvantagens impedindo o uso generalizado. Essas desvantagens vão desde a inatividade de HRP no citosol até o grande tamanho da tag de ferritina, sensibilidade à luz do ReAsH, e tamanho pequeno e falta de compatibilidade com a coloração celular de metallothioneina. Recentemente, uma proteína derivada da peroxidase ascorbate foi projetada como uma tag EM, chamada APEX233,34. Como peroxidase, o APEX2 pode catalisar a oxidação de 3,3' diaminobenzidina (DAB), produzindo um precipitado que reage com tetróxido de osmômio para fornecer contraste EM local com difusão mínima da proteína de interesse (menos de 25 nm)33,35. Ao contrário dos métodos tradicionais baseados em HRP, o APEX2 é extremamente estável e permanece ativo em todos os compartimentos celulares33. As amostras podem ser processadas para TEM usando a coloração tradicional da amostra EM e métodos que permitem uma boa visualização das estruturas circundantes33,34,36. Devido ao seu pequeno tamanho, estabilidade e versatilidade, a APEX2 emergiu como uma tag EM com grande potencial.
Muitas das abordagens discutidas acima não podem ser ou ainda não foram combinadas com o estado atual da arte em preservação ultraestrutural, criofixação e substituição de congelamento de baixa temperatura. Assim, sofrem com a falta de preservação da membrana e/ou coloração celular para determinar a localização precisa das proteínas. Isso limita necessariamente a resolução e interpretação dos dados que podem ser obtidos. A criofixação por congelamento de alta pressão (HPF) envolve o congelamento rápido de amostras em nitrogênio líquido a uma alta pressão (~2.100 bar), o que causa vitrificação em vez de cristalização de amostras aquosas, preservando assim células em um estado quase nativo37,38,39. O HPF é seguido por substituição de congelamento (FS), uma desidratação de baixa temperatura (-90 °C) em acetona combinada com incubação com manchas típicas em como tetróxido de osmó e acetato de uranyl. HPF e FS juntos fornecem uma vantagem distinta sobre a fixação química tradicional (um processo mais longo que pode levar a artefatos) e desidratação alcoólica à temperatura ambiente ou no gelo (o que pode levar à extração de lipídios e açúcares), e, portanto, são desejáveis para combinar com as melhores tags EM para detecção de proteínas.
Uma das razões pelas quais o HPF/FS não foi combinado com a rotulagem APEX2 é que a fixação química leve é um pré-requisito para a reação peroxidase, limitando a difusão do produto de reação DAB. Nos estudos da APEX2 até agora, a fixação e a reação peroxidase são seguidas pelos métodos tradicionais em para coloração e desidratação alcoólica33,36. No entanto, mostrou-se que após a fixação química com o HPF/FS fornece uma vantagem distinta na preservação sobre a fixação química tradicional e a desidratação do álcool sozinha40. A perda de integridade ultraestrutural vista em amostras tradicionais de TEM parece menos ligada à fixação do que à desidratação, que normalmente é feita usando álcool à temperatura ambiente ou no gelo, e pode levar à extração de lipídios e açúcares40,41. Para desenvolver o método crioAPEX, suporam que a fixação química e a reação peroxidase, seguida séfeio e FS, produziriam um resultado ideal em termos de preservação ultraestrutural.
Aqui apresentamos o protocolo crioAPEX, que combina marcação APEX2 com métodos de criofixação e congelamento de métodos de substituição(Figura 1). Este protocolo simples consiste na transfecção de uma proteína de interesse apex2 marcada, fixação química das células e reação peroxidase. HPF e FS são então realizados seguidos de incorporação típica de resina e secção fina. A imagem TEM revela excelente preservação da ultraestrutura usando esse método. Além disso, observou-se localização subcelular de alta resolução e distribuição espacial de uma proteína lumenal de retículo endoplasmático (ER). Este método é amplamente útil para detecção da localização da proteína da membrana dentro das células para análise de microscopia eletrônica. Em nossas mãos, o método tem trabalhado com sucesso para uma variedade de linhas celulares cultivadas na cultura tecidual, incluindo HEK-293T (rim embrionário humano), HeLa (câncer cervical humano), Cos7 (fibroblasto renal de macaco verde africano) e BHK (rim de hamster bebê). Instruções detalhadas são descritas abaixo usando células HEK-293T.

<table><tbody><tr><td>3,3'-Diaminobenzidina tetracloridrato hidrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5637-1G</td><td></td></tr><tr><td>Acetona (Destilado em Vidro)</td><td>Microscopia Eletrônica Sciences</td><td>10016</td><td></td></tr><tr><td>Beakers; Plástico, descartável 120 cc</td><td>Microscopia Eletrônica Sciences</td><td>60952</td><td></td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino</td><td>Frascos de armazenamento criogênico Sigma-Aldrich</td><td>A7906-100G</td><td></td></tr><tr><td>, 2 mL</td><td>VWR</td><td>82050-168</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium</td><td>Corning</td><td>10-017-CV</td><td></td></tr><tr><td>Durcupan ACM Fluka, componente único A, resina epóxi M</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>44611-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Durcupan ACM Fluka, monocomponente B, endurecedor 964</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>44612-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Durcupan ACM Fluka, monocomponente C, acelerador 960 (DY 060)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>44613-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Durcupan ACM Fluka, monocomponente D</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>44614-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Molde de incorporação, plano padrão, 14 mm x 5 mm x 6 mm</td><td>Microscopia eletrônica Sciences</td><td>70901</td><td></td></tr><tr><td>Molde de embutimento, padrão plano, 14 mm x 5 mm x 4 mm</td><td>Microscopia Eletrônica Sciences</td><td>70900</td><td></td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino; Nu-Serum IV Suplemento de Meio de Crescimento</td><td>Corning</td><td>355104</td><td></td></tr><tr><td>Barcos de Faca de Vidro, 6,4 mm</td><td>Ciências de Microscopia Eletrônica</td><td>71008</td><td></td></tr><tr><td>Fabricante de Facas de Vidro</td><td>Leica Microsystems</td><td>EM KMR3</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldeído 10% Solução</td><td>Aquosa Microscopia Eletrônica Ciências</td><td>16120</td><td></td></tr><tr><td>HEK 293 Células</td><td>ATCC</td><td>CRL-1573</td><td></td></tr><tr><td>Freezer de alta pressão com sistema de transferência rápida</td><td>Leica Microsystems</td><td>EM PACT2</td><td>Produto arquivado substituído por solução Leica EM ICE</td></tr><tr><td>Peróxido de hidrogênio 30% Reagente</td> de transfecção <td>Fisher Scientific</td><td>50-266-27</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 3000</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>L3000015</td><td></td></tr><tr><td>Transportador de membrana para EM PACT2, 1,5 mm x 0,1 mm</td><td>Mager Scientific</td><td>16707898</td><td></td></tr><tr><td>Tetróxido de Ósmio, cristalino</td><td>Microscopia Eletrônica Sciences</td><td>19110</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato Tampolado Salino (PBS) 20X, Grau Ultra Puro</td><td>VWR</td><td>97062-950</td><td></td></tr><tr><td>Cápsulas de Plástico para AFS/AFS2, 5 mm x 15 mm</td><td>Mager Scientific</td><td>16702738</td><td></td></tr><tr><td>Slot, cobre 2 x 1 mm com filme de suporte Formvar</td><td>Microscopia Eletrônica Sciences</td><td>FF2010-</td><td></td></tr><tr><td>Tampão de Cacodilato de Sódio, 0,2 M, pH 7,4</td><td>Ciências de Microscopia Eletrônica</td><td>102090-962</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de Sódio, Pellet 500 G (ACS)</td><td>Avantor Macron Fine Chemicals</td><td>7708-10</td><td></td></tr><tr><td>Microscopia Eletrônica</td> de<td>Ácido Tânico</td> Ciências <td>21710</td><td></td></tr><tr><td>Placas de Cultura de Tecidos, Poliestireno, Estéril, Corning, 100 mm</td><td>VWR</td><td>25382-166</td><td></td></tr><tr><td>Tiras de</td> <td>Faca Ultra VidroMicroscopia Eletrônica Ciências</td><td>71012</td><td></td></tr><tr><td>Ultramicrótomo</td><td>Leica Microsystems</td><td>EM UC7</td><td></td></tr><tr><td>Acetato de Uranilo Di-hidratado</td><td>Microscopia Ciências</td><td>22400</td><td></td></tr></tbody></table>

o método crioapex para análise de microscopia eletrônica da localização da proteína da membrana dentro de células ultraestruturalmente preservadas

The CryoAPEX Method for Electron Microscopy Analysis of Membrane Protein Localization Within Ultrastructurally-Preserved Cells

Eventos celulares-chave como transdução de sinal e tráfico de membrana dependem da localização adequada da proteína dentro dos compartimentos celulares. Compreender a localização subcelular precisa das proteínas é, portanto, importante para responder a muitas questões biológicas. A busca por um rótulo robusto para identificar a localização de proteínas combinada com a preservação e a coloração adequadas do celular tem sido historicamente desafiadora. Os recentes avanços nas imagens de microscopia eletrônica (EM) levaram ao desenvolvimento de muitos métodos e estratégias para aumentar a preservação celular e rotular proteínas alvo. Uma tag genética relativamente nova baseada em peroxidase, APEX2, é um líder promissor em etiquetas em ativas em clones. A preparação amostral para microscopia eletrônica de transmissão (TEM) também avançou nos últimos anos com o advento da criofixação por congelamento de alta pressão (FpE) e desidratação e coloração de baixa temperatura via substituição de congelamento (FS). O HPF e o FS proporcionam excelente preservação da ultraestrutura celular para imagens TEM, perdendo apenas para direcionar a crio-imagem de amostras vívidas. Aqui apresentamos um protocolo para o método crioAPEX, que combina o uso da tag APEX2 com HPF e FS. Neste protocolo, uma proteína de interesse é marcada com APEX2, seguida de fixação química e reação peroxidase. No lugar da tradicional coloração e desidratação alcoólica à temperatura ambiente, a amostra é criofixada e sofre desidratação e coloração em baixa temperatura via FS. Usando crioAPEX, não só uma proteína de interesse pode ser identificada dentro de compartimentos subcelulares, mas também informações adicionais podem ser resolvidas em relação à sua topologia dentro de uma membrana estruturalmente preservada. Mostramos que este método pode fornecer alta resolução suficiente para decifrar padrões de distribuição de proteínas dentro de um lumen organela, e distinguir a compartimentação de uma proteína dentro de uma organela próxima a outras organelas não rotuladas. Além disso, o crioAPEX é processualmente simples e incapacitado para células cultivadas na cultura tecidual. Não é mais tecnicamente desafiador do que métodos típicos de criofixação e congelamento de substituição. O CrioAPEX é amplamente aplicável para análise de TEM de qualquer proteína de membrana que possa ser geneticamente etiquetada.

Para comparar a preservação ultraestrutural utilizando o método crioAPEX com fixação e desidratação tradicionais, preparamos amostras em que uma membrana retícula endoplasmática (ERM; O peptídeo da membrana ER foi marcado com APEX2 e transfecdo em células HEK-293T. ERM-APEX2 localiza a face citoplasmática do PS e remodela a estrutura ER em estruturas morfologicamente distintas conhecidas como ER (OSER)34,42,43. A morfologia oSER...

Este protocolo descreve o método crioAPEX, no qual uma proteína de membrana com etiqueta APEX2 pode ser localizada por microscopia eletrônica de transmissão dentro da ultraestrutura celular idealmente preservada.

O Método CrioAPEX para Análise de Microscopia Eletrônica da Localização da Proteína da Membrana dentro de células ultraestruturalmente preservadas

Key cellular events like signal transduction and membrane trafficking rely on proper protein location within cellular compartments. Understanding precise ...

Este método combina a capacidade de coloração para uma proteína de membrana, preservando também a integridade da membrana e a arquitetura subcelular. Então é realmente poderoso para localização precisamente de uma proteína associada à membrana. A principal vantagem desta técnica é que combina o uso de uma marca geneticamente clonável robusta, APEX2, com métodos de última geração na preservação celular para microscopia eletrônica, incluindo criofixação e substituição de congelamento.Juntos, estes permitem uma localização precisa de proteínas dentro de uma célula bem preservada. Este protocolo pode ser usado para dissecar mecanismos pelos quais os vírus se replicam dentro da célula hospedeira. Vírus muitas vezes sequestram proteínas hospedeiras durante seu esquema de infecção.Vírus são os pequenos genomas, que eles utilizam para se replicar dentro dessas células hospedeiras. Recentemente, conseguimos, em dados inéditos, rotular essas proteínas usando essa tecnologia para entender como os vírus se replicam. Essa técnica mostrou-se realmente crítica em um estudo colaborativo recente sobre uma toxina bacteriana que causa a quebra do golgi.Usando crioAPEX, conseguimos localizar precisamente a toxina com as peças de golgi fragmentadas, algo que era realmente difícil de ver usando técnicas normais de imunofluorescência. Demonstrando essa técnica estará Elaine Mihelc, estudante de pós-graduação, e a pesquisadora Stephanie Angel, de nossos laboratórios. Depois de semear células HEK293 no prato, transfeme as células com plasmídeos de expressão de mamíferos marcados APEX2 usando reagente de transfecção de acordo com as instruções do fabricante.Às 12-15 horas após a transfecção, lave as células uma vez com PBS. Em seguida, lave as células com PBS do prato em um tubo cônico de 15 mililitros. Centrifugar a 500 x g por cinco minutos.Remova cuidadosamente o tampão de cacodilato de sódio supernante e suspenda a pelota em dois mililitros de 2%glutaraldeído e 0,1 tampão de cacodilato de sódio molar a pH 7,4 à temperatura ambiente. Coloque a amostra no gelo para incubar por 30 minutos. Em seguida, pelota a amostra a 500 x g por cinco minutos a quatro graus Celsius.Lave a pelota três vezes por cinco minutos cada com dois mililitros de 0,1 amortecedor de cacodilato de sódio molar por centrifugação a quatro graus Celsius. Após a centrifugação, remova o supernante. Para realizar a reação peroxidase, lave a pelota suspendendo-a em três mililitros de solução DAB seguida de pelotização a 500 x g por cinco minutos.Em seguida, suspenda novamente a pelota em três mililitros de solução DAB com peróxido de hidrogênio de 5,88 mililitros. Incubar por 30 minutos em temperatura ambiente. A pelota torna-se visivelmente de cor marrom, indicando a presença do produto de reação DAB insolúvel.Depois de lavar novamente com tampão de cacodilato de sódio no DMEM, de acordo com o manuscrito, suspenda novamente a pelota celular em 500 microliters de uma solução crioprotetora de DMEM contendo soro bovino 10% fetal e 15% de albumina de soro bovino bovino. Transfira a suspensão celular para um tubo de microcentrífuga de 0,5 mililitro. Pelota novamente, aumentando ligeiramente a velocidade da centrífuga de 500 x g.Descarte a maioria do supernante, garantindo que restasse líquido suficiente para que a pelota não seque. Retire qualquer líquido restante da pelota da célula usando o canto de uma toalha de laboratório ou papel toalha. Deixe que o líquido suficiente permaneça que a pelota forme uma pasta, semelhante em consistência à pasta de dente.Aspire de dois a três microliters da pelota celular e deposite-a em um portador de membrana. Encha completamente o poço do portador da membrana para que a tensão superficial crie uma pequena cúpula em cima. Deslize o porta-membrana para dentro do cartucho e fixe.Coloque o cartucho na máquina HPF que foi preparada e preparada e pressione comece a congelar. Mantendo os cartuchos imersos em nitrogênio líquido, remova o porta-membranas de seu cartucho. Coloque em uma cápsula de plástico e coloque a cápsula de plástico em um Criovial cheio de nitrogênio líquido.Em uma capa química, prepare um mililitro por amostra da solução de 0,2% de peso por volume de ácido tânnico e 5% dI em acetona em um Cryovial. Coloque-os em nitrogênio líquido para congelar. Coloque a mistura de substituição de congelamento um frasco e os Criovias contendo as pelotas de célula congelada na câmara de amostra das unidades de substituição de congelamento.Transfira a cápsula interna contendo o portador da membrana do frasco de nitrogênio líquido para o frasco correspondente contendo mistura de substituição de congelamento. Inicie um protocolo de substituição de congelamento a 90 graus Celsius. Após 24 horas, pausa a substituição do congelamento e lave as amostras três vezes por cinco minutos com acetona que foi resfriada a 90 graus Celsius.Em seguida, em uma capa química, prepare um mililitro por amostra de uma solução de 1%tetroxida de 1%osmium, acetato de 0,2%uranyl e 5% dI em acetona em um Cryovial e coloque-os em nitrogênio líquido para congelar. Coloque os Criovias com a mistura de substituição de congelamento dois na unidade de substituição de congelamento e transfira as cápsulas da terceira lavagem de acetona para a mistura de substituição de congelamento dois frascos. Incuba-os e congela a mistura de substituição dois por 72 horas a 90 graus Celsius, seguido de aquecimento gradual para zero graus Celsius ao longo de 12-18 horas.Mantenha a temperatura em zero graus Celsius e adicione acetona pré-resfriada nos frascos para lavar três vezes por 10 minutos cada. Prepare uma mistura de resina de escolha em um béquer plástico de acordo com as instruções do fabricante e adicione 2%4% e 8% de resina nos frascos para imergir as cápsulas. Incubar por duas horas cada um a zero graus Celsius.Em seguida, incubar em 15%30%60%90% e 100% componentes de resina de A, B e D apenas por quatro horas cada a temperatura ambiente. Após as 20 horas, prepare uma mistura de componentes de resina A, B, C e D e incubar por quatro horas. Coloque os portadores de membrana com pelotas celulares lado para cima em moldes planos de incorporação e encha com mistura de resina A, B, C e D.Coloque-os em um forno para polimerizar a 60 graus Celsius por 24-36 horas.Após a polimerização, remova os blocos do molde e coloque a amostra no mandril vertical do ultra microtoma onde pode ser visualizado com ampliação. Separe o portador da membrana do bloco por uma combinação de nitrogênio líquido na membrana para separar o metal do plástico, e usando uma lâmina de barbear para cortar a resina ao redor do portador da membrana. Quando separado, levante suavemente o portador da membrana, deixando a cúpula de pelotas de célula na face do bloco.Coloque o bloco com a pelota de célula exposta voltada para cima em um molde de incorporação plana que é ligeiramente mais profundo do que o primeiro molde e preencha com os componentes de resina A, B, C e D.Polymerize a 60 graus Celsius por 24-36 horas. Corte o bloco ao redor da pelota da célula usando uma lâmina de barbear. Em seguida, coloque o bloco no mandril de amostra no braço de secção de um ultra microtoma.Usando uma faca de vidro ou diamante, corte o bloco em uma forma trapezoidal perto da pelota celular. Obtenha 90 seções ultra finas de nanômetros da pelota celular usando uma faca de vidro ou diamante. Pegue uma fita de seções em uma grade TEM.Seque a grade manchando a borda em um pedaço de papel filtro e armazene-a em uma caixa de armazenamento de grade TEM. Monte a grade no suporte TEM e coloque o suporte no microscópio. Use um Tecnai T12 a 80 kilovolts para triagem de amostras crioAPEX.Adquira imagens de células e estruturas subcelulares de interesse com rotulagem APEX2. Neste estudo, a preparação da amostra pelos métodos tradicionais de APEX resultou em rotulagem clara de estruturas de órticulo endoplasmático organizados e suaves. Na alta ampliação, as membranas empilhadas pareciam babadas e lacunas não uniformes estavam presentes entre densidades de membrana concêntrica, indicando má preservação da membrana e extração lipídica.A amostra preparada pela crioAPEX também tinha rotulagem claramente definida de estruturas de rétilum organizado e suave, porém, as membranas eram lisas e paralelas e pouco ou nenhuma extração lipídica foi vista. A análise tem de 90 nanômetros de seções finas revelou que a proteína interativa de levedura huntington E estava presente em todo o tiquelum endoplasmático periférico, bem como o envelope nuclear. Além disso, a densidade de proteína interativa da levedura huntington E foi resolvida em focos regularmente espaçados ao longo da membrana endoplasmática luminal.A distribuição e os focos de proteína e proteína de Huntington também foram visíveis em uma amostra preparada com fixação e desidratação tradicionais. No entanto, foram presentes extensas interrupções e extrações de membrana, tornando a amostra subótima. A rotulagem APEX2 foi realizada utilizando-se três marcadores celulares, dos quais mito-V5-APEX2 forneceu uma coloração específica apenas de mitocôndrias e CAAX-APEX2 produziu uma coloração distinta apenas da membrana plasmática.Não foi observada rotulagem em organelas intracelulares. A coloração do lúmen golgi também foi avaliada usando um marcador Alpha MAN2-APEX2, conforme descrito em nosso manuscrito sengupta et al original. Após este procedimento, métodos tridimensionais como tomografia eletrônica ou microscopia eletrônica de varredura de feixe de íons focalizada podem ser realizados a fim de investigar a distribuição 3D de uma proteína de interesse.Muitos dos produtos químicos utilizados neste protocolo são tóxicos, por isso, antes do uso, as folhas de dados de segurança devem ser consultadas para garantir que os produtos químicos sejam manuseados usando equipamentos de proteção individual adequados e descartados de acordo com as diretrizes institucionais.

the-cryoapex-method-for-electron-microscopy-analysis-membrane-protein

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Fonte: Schönherr, S., et. al. Imunomarcação Combinada de Réplica Optogenética e de Fratura por Congelamento para Examinar o Arranjo Específico de Entrada de Receptores de Glutamato na Amígdala de Camundongo. J. Vis. Exp. (2016)Este vídeo demonstra a imunomarcação de réplicas fraturadas por congelamento de tecido cerebral de camundongo para microscopia eletrônica. As réplicas fraturadas e revestidas são digeridas para expor os receptores. Anticorpos primários e secundários marcados com ouro são...

Imunomarcação de proteínas da membrana neuronal em uma amostra fraturada por congelamento de tecido cerebral de camundongo

Para preservar processos neuronais para análise ultra-estrutural, nós descrevemos um protocolo para revestimento dos neurônios primários em grades de microscopia eletrônica seguido de congelamento flash, rendendo amostras suspensas em uma camada de gelo vítreo. Essas amostras podem ser examinadas com um microscópio crio-eletrônico para visualizar estruturas em escala nanométrica.

Preparação de primário neurônios para visualizar Neuritos num Estado Frozen-hidratado Usando Cryo-Electron Tomografia

Aqui descrevemos um procedimento para estudar tecidos vegetais fraturados por congelamento. As amostras de folhas congeladas de alta pressão são fraturadas por congelamento e revestidas de camada dupla, produzindo amostras bem preservadas e hidratadas congeladas que são visualizadas usando o microscópio eletrônico de criovarredura em altas ampliações com danos mínimos ao feixe.

Estudar a Organização supramolecular de fotossintéticas membranas dentro de tecidos foliares Freeze-fraturados por Cryo-Microscopia Eletrônica de Varredura

Este manuscrito descreve um método fácil de usar e criofixação de baixo custo para a visualização de células em suspensão por meio de microscopia electrónica de transmissão.

Congelamento Plunge: Uma ferramenta para os estudos ultra-estruturais e de imunolocalização de células em suspensão em Microscopia Eletrônica de Transmissão

Aqui, nós fornecemos um, de baixo custo fácil, e protocolo de tempo-eficiente para corrigir quimicamente o tecido cerebral dos primatas com fixador acroleína, permitindo a preservação a longo prazo que seja compatível com imunohistoquímica pré-incorporação para microscopia eletrônica de transmissão.

Preparação do Tecido Cerebral primata não humano para Pré-incorporação de imuno-histoquímica e Microscopia Electrónica

Nós desenvolvemos uma nova técnica de microscopia electrónica, de "flash-e-congelamento", que permite a visualização da dinâmica da membrana com ms resolução temporal. Esta técnica combina a estimulação optogenetic de neurónios com congelamento de alta pressão. Aqui, demonstramos os procedimentos e descrever os protocolos em detalhe.

Flash-e-Freeze: uma nova técnica para capturar Membrane Dynamics com Electron Microscopy

Um método de microscopia de elétron luz correlativo (CLEM) é aplicado às estruturas intracelulares induzida por vírus imagem através de microscopia eletrônica (EM) em células que são previamente selecionadas pela microscopia de luz (LM). LM e eme são combinados como uma abordagem de imagem híbrida para alcançar uma visão integrada das interações do vírus-anfitrião.

Correlativo luz microscopia eletrônica de varredura (CLEM) para rastreamento e Imaging proteína Viral associado estruturas nas células Cryo-imobilizado

Apresentado aqui é um protocolo para rotular proteínas de membrana em células de mamíferos e revestir a amostra com grafeno para microscopia eletrônica de transmissão de transmissão de fase líquida. A estabilidade das amostras contra os danos causados pela radiação também pode ser estudada com este protocolo.

Gabinete de grafeno de células mamíferas quimicamente fixas para microscopia eletrônica de fase líquida

Este protocolo demonstra como imaginar amostras biológicas conservadas por crio-preservados usando microscopia de iluminação estruturada crioes. Demonstramos a metodologia ao fotografar o citoesqueleto das células U2OS.

Coleta de dados microscópicos de iluminação crioesticamente estruturadas de células criogenicamente preservadas

O objetivo deste protocolo é direcionar a adesão celular e o crescimento para áreas direcionadas de redes para microscopia crio-elétron. Isso é conseguido aplicando uma camada anti-incrustada que é ablada em padrões especificados pelo usuário seguido pela deposição de proteínas de matriz extracelular nas áreas padronizadas antes da semeadura celular.

Micropatterning Transmissão Electron Microscopy Grids para Posicionamento Direto celular dentro de fluxos de trabalho de tomografia crio-elétron inteira

Esse fluxo de trabalho permite a produção de lamelas direcionadas a estruturas biológicas marcadas com fluorescência que são pequenas (&lt;1 μm de extensão axial) e raras (1 cópia por célula) usando uma plataforma de imagem tricoincidente criogênica. Esta plataforma integra microscopia de fluorescência, fresagem de feixe de íons focalizada e microscopia eletrônica de varredura em uma única posição focal e permite microscopia de fluorescência simultânea durante a fresagem.

Fluxo de trabalho usando um microscópio de fluorescência coincidente criogênica, elétron e feixe de íons para moagem direcionada de células

Aprenda o método crioAPEX para localização precisa de proteínas de membrana em células HEK293 preservadas por criofixação. Esta técnica combina a marcação APEX2 com microscopia eletrônica para estudar mecanismos virais.

O Método CrioAPEX para Análise de Microscopia Eletrônica da Localização da Proteína da Membrana dentro de células ultraestruturalmente preservadas (Vídeo) | JoVE Journal

O Método CrioAPEX para Análise de Microscopia Eletrônica da Localização da Proteína da Membrana dentro de células ultraestruturalmente preservadas

Explorar mais vídeos