Padronização Subtractive rápida de camadas de células vivas com uma Probe microfluídicos

O objetivo principal do método apresentado neste artigo em vídeo é gerar rapidamente padrões celulares espacialmente definidos para facilitar a análise espaço-temporal in-situ das interações célula a célula. A estratégia apresentada aproveita a tecnologia de sonda microfluídica. A cabeça da sonda microfabricada localiza volumes de nanolitros de bioquímicos em substratos biológicos para padronizar as monocamadas celulares.

A principal vantagem de uma técnica de padronização baseada em MFP é que ela é quase instantânea, devido à lise local, permitindo a modificação em tempo real dos padrões a serem gerados. Tivemos a ideia desse método pela primeira vez quando percebemos que outros métodos para gerar padrões celulares exigem protocolos longos e de várias etapas antes de realmente ver o sucesso dos padrões celulares. Para executar experimentos estáveis com um confinamento de fluxo hidrodinâmico na superfície de uma célula, os parâmetros do MFP precisam ser otimizados.

Para isso, a demonstração visual é fundamental. Aditya Kashyap e Julien Cors demonstrarão esse procedimento. Os módulos operacionais da plataforma compreendem seringas motorizadas, estágios motorizados e um controlador.

O MFP é conectado a um estágio Z motorizado para controlar a distância entre o cabeçote e o substrato, e o suporte do substrato é conectado aos estágios motorizados X e Y que constituem o sistema de digitalização. O cabeçote MFP possui vias fluídicas para conectar à estação de bombeamento, orifícios de montagem para montar o cabeçote no estágio Z e canais que saem do ápice polido. O ápice é definido coplanar ao substrato de cultura de células.

Para preparar a estação de bombeamento e o aparelho de manuseio de fluidos, limpe as seringas e os êmbolos da seringa por sonicação e solução de alvejante a 0,5% em água ultrapura antes e depois dos experimentos com células vivas. Enxágue-os bem com água. Encha as seringas com água mergulhando completamente as pontas em banho-maria e aspirando com o êmbolo.

Purgue o líquido enquanto estiver dentro do banho-maria com o eixo da seringa em contato com o selo na saída da seringa. Continue a aspirar e purgar até que não sejam vistas bolhas de ar nas colunas da seringa. Conecte as seringas cheias às bombas de seringa usando conectores de trava inferior.

Use a válvula de comutação montada nas bombas para direcionar o líquido da seringa para um dos dois capilares que levam ao cabeçote do MFP ou aos reservatórios de líquido. Purgue ambos os capilares com água das seringas a uma taxa de fluxo de cerca de 10 a 50 microlitros por minuto, dependendo do tamanho da seringa, até que restem cerca de 10 microlitros de água nas seringas. Limpe a cabeça do MFP por sonicação usando detergente de vidro para limpeza padrão ou alvejante 0,5% para limpeza rigorosa, por cinco minutos.

Purgue os canais com água imergindo o ápice em água e aplicando vácuo nas vias. Inspecione os canais sob um microscópio estéreo quanto a possíveis obstruções e repita a etapa anterior, se necessário. Em seguida, monte a cabeça limpa no suporte da cabeça e aparafuse o conector na cabeça.

Insira os capilares purgados em um adaptador de conector microfluídico apropriado que faça interface com as vias do canal no cabeçote. Aparafuse o suporte da cabeça ao estágio Z, que é usado para o controle da distância entre a cabeça e a monocamada da célula, antes de realizar a calibração do ponto final conforme descrito no protocolo de texto. Obtenha uma distância bruta de lacuna zero trazendo a cabeça do MFP sobre uma lâmina de câmara sem células e descendo lentamente em passos de cinco mícrons.

Ao entrar em contato da sonda com o substrato, os anéis de Newton devem ser observados. Esta é uma estimativa grosseira. Uma posição precisa deve ser obtida após ajustar a coplanaridade do ápice da sonda ao substrato.

Quando formados, certifique-se de que os anéis de Newton sejam simétricos. Para garantir a coplanaridade do ápice da sonda, ajuste a inclinação da cabeça usando um goniômetro na interface da cabeça e no estágio Z. Afaste a cabeça do MFP 20 mícrons do substrato e ajuste a inclinação usando o goniômetro.

Repita o ajuste de descida, zeragem e inclinação até que os anéis de Newton fiquem simétricos ao contato. Com a inclinação ajustada, defina a posição Z, que produz anéis simétricos de Newton, em zero. Em seguida, prepare o líquido de processamento para o canal de injeção interno e a solução tampão de extração necessária para a injeção externa, conforme descrito no protocolo de texto.

Usando a linha de drenagem, conecte às bombas de seringa, purgue a água restante e aspire as soluções desgaseificadas para as seringas de injeção a 40 microlitros por minuto até que as seringas estejam cheias. Isso garante o enchimento sem bolhas das seringas, conectores e capilares. Para preparar as monocamadas de células em lâminas de câmara, gaste células em frascos T usando protocolos padrão de cultura de células.

Ao atingir a confluência celular nos frascos de cultura, tripsinizar e coletar células. Semear 0,2 milhão de células por centímetro quadrado em cada uma das lâminas de duas câmaras para padronização. Cultive as células por mais de 48 horas usando as células em uma das câmaras como controle do crescimento e viabilidade celular.

Ao atingir a confluência celular nas lâminas da câmara, incubar as células por 45 minutos com 500 microlitros de solução de corante rastreador de células a uma concentração de 10 micromolares preparada em meio sem soro. Isso é feito para visualização de células durante a padronização. Lave as células marcadas com PBS lavando suavemente cada câmara usando uma pipeta.

Posteriormente, cultive as células em meio suplementado com soro para os experimentos de padronização. O confinamento de fluxo hidrodinâmico localiza líquidos usando injeção e aspiração simultâneas de um líquido de processamento. No confinamento hierárquico, vários líquidos de processamento são confinados, com o HFC externo protegendo a amostra do HFC de processamento interno.

Mova o MFP sobre a monocamada da célula a uma distância de 50 mícrons da lâmina de vidro. Essa distância de folga garante o contato do HFC hierárquico e também é responsável pela variação de superfície e espessura da monocamada. Injeção de hidróxido de sódio a seis ou oito microlitros por minuto através de I-dois.

Avalie outras taxas de fluxo usando as regras de fluxo no protocolo de texto. Modular a dimensão do HFC interno alterando a relação entre os caudais de injecção QI-dois e QI-um utilizando as seringas de injecção. Por exemplo, use um QI-one entre 1,3 microlitros por minuto e quatro microlitros por minuto, com o QI-dois fixado em oito microlitros por minuto, para resultar em uma pegada de hidróxido de sódio de 150 a 300 células.

Injete o meio completo das aberturas mais externas no cabeçote do MFP a uma taxa de fluxo de 20 microlitros por minuto para contabilizar a evaporação do meio e a aspiração durante a operação do hHFC. Para padronizar as monocamadas de células, defina o software de estágio para escanear a cabeça da sonda sobre a monocamada de célula em padrões definidos pelo usuário a uma velocidade de varredura de 10 mícrons por segundo e uma distância de lacuna de 50 mícrons. Com o hHFC aninhado em operação e em contato com a monocamada, escaneie o MFP com a trajetória do padrão desejado para efetuar a remoção da célula padronizada.

Para uma cocultura após a primeira remoção do tipo de célula, semeie uma linha celular diferente para preencher as lacunas, como antes. Preparar a estação de recolha de amostras para a análise a jusante do lisado Aqui é mostrado um exemplo de uma estação de amostragem, que compreende um suporte de PCR de oito tiras impresso em três D.

Limpe o suporte do tubo com etanol 70% ou outros descontaminantes de superfície, com base no rigor desejado para a aplicação. Use um clipe magnético no suporte do tubo para prendê-lo ao suporte do substrato. Depois de preparar a estação de amostragem, posicione a cabeça do MFP a 100 mícrons da monocamada.

Comece a operar o hHFC com solução de hidróxido de sódio 50 milimolares como líquido de processamento para o canal de injeção interno com uma taxa de fluxo de um microlitro por minuto para QI-um, seis microlitros por minuto para QI-dois, menos sete microlitros por minuto para QA-um e menos -17,5 microlitros por minuto para QA-dois. Uma vez que o confinamento do fluxo tenha se estabilizado, desça a cabeça da sonda a uma distância de 50 mícrons para realizar a lise local à base de hidróxido de sódio na subpopulação escolhida de células com o hHFC. Uma vez concluída a lise da subpopulação, direcione a cabeça para os tubos na estação de amostragem.

Ejete o lisado coletado diretamente nos tubos de PCR. Após o processamento do lisado, conforme descrito no protocolo de texto, carregue o lisado em um fluxo de trabalho qPCR padrão, conforme definido pelo fornecedor do instrumento. Ao controlar a proporção dos líquidos de injeção no HFC hierárquico, o tamanho da pegada em contato com a superfície da célula é modulado.

As taxas de fluxo foram escolhidas, de modo que o efeito químico, em vez do cisalhamento, seja o mecanismo dominante para a lise celular. Isso foi corroborado pela determinação do cisalhamento usando dinâmica de fluidos computacional. Aqui é mostrada a geração de uma grade de ilhas de células por programação de trajetória de varredura com o MFP.

A modulação do tamanho da pegada usando a proporção de líquido de injeção permite o controle da resolução da remoção da célula. Este método pode ser usado para a cocultura sequencial de múltiplas populações de células, gerando padrões complexos de interações célula a célula. O uso de hidróxido de sódio como líquido de processamento torna o lisado compatível com a análise baseada em PCR das células.

Aqui, o conteúdo de DNA foi quantificado a partir de cinco e uma pegada, lisada usando o método descrito. Uma vez dominada, essa técnica pode ser realizada em células em menos de 30 minutos. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de certificar-se de que os canais e os capilares estejam livres de bolhas de ar, pois isso pode afetar adversamente o HFC.

Não se esqueça de que trabalhar com hidróxido de sódio, uma solução química corrosiva, pode ser extremamente perigoso, e precauções como óculos de segurança e jalecos devem sempre ser tomadas ao realizar este procedimento. Seguindo este procedimento, podemos analisar localmente as células por imunocoloração ou sequenciamento de DNA-RNA por lise mediada por MFP, a fim de responder a perguntas adicionais, como quais proteínas são superexpressas devido ao confinamento geométrico das células. Após seu desenvolvimento, essa técnica pode abrir caminho para pesquisadores da área de biologia molecular explorarem a sinalização inter e extracelular durante a geração e degeneração de tecidos.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter um bom entendimento sobre como padronizar subtrativamente as monocamadas celulares configuradas no MFP para processamento local e fazer geometrias complexas de coculturas de células.