Padronização Subtractive rápida de camadas de células vivas com uma Probe microfluídicos

O objetivo principal do método apresentado neste artigo em vídeo é gerar rapidamente padrões celulares espacialmente definidos para facilitar a análise in loco de interações espaço-temporais entre células. A estratégia apresentada utiliza a tecnologia de sonda microfluídica. A cabeça da sonda microfabricada localiza volumes na escala de nanolitros de substâncias bioquímicas em substratos biológicos para criar padrões em monocamadas celulares.

A principal vantagem de uma técnica de padronização baseada em MFP é que ela é quase instantânea, devido à lise local, permitindo a modificação em tempo real dos padrões a serem gerados. Tivemos pela primeira vez a ideia deste método quando notamos que outros métodos para gerar padrões celulares exigem protocolos longos e com múltiplas etapas antes de realmente observar o sucesso dos padrões celulares. Para realizar experimentos estáveis com confinamento de fluxo hidrodinâmico sobre uma superfície celular, os parâmetros do MFP precisam ser otimizados.

Para esse fim, a demonstração visual é fundamental. Aditya Kashyap e Julien Cors demonstrarão este procedimento. Os módulos operacionais da plataforma compreendem seringas motorizadas, estágios motorizados e um controlador.

O MFP está conectado a uma platina Z motorizada para controlar a distância do espaçamento entre a ponteira e o substrato, e o suporte do substrato está preso às platina motorizadas X e Y, constituindo o sistema de varredura. A ponteira do MFP possui vias fluidicas para conexão à estação de bombeamento, furos de fixação para montagem da ponteira na platina Z e canais que saem pelo ápice polido. O ápice é posicionado coplanarmente ao substrato de cultura celular.

Para preparar a estação de bombeamento e o equipamento de manipulação de fluidos, limpe as seringas e os êmbolos das seringas por meio de sonicação e solução de hipoclorito a 0,5% em água ultrapura antes e após os experimentos com células vivas. Enxágue-os completamente com água. Encha as seringas com água imergindo completamente suas pontas em um banho de água e aspirando com o êmbolo.

Esvazie o líquido enquanto estiver no banho-maria, com a haste da seringa tocando o selo na saída da seringa. Continue aspirando e esvaziando até que não sejam mais observadas bolhas de ar nas colunas da seringa. Conecte as seringas cheias às bombas de seringa utilizando conectores de travamento inferior.

Use a válvula de troca montada nas bombas para direcionar o líquido da seringa a uma das duas capilares que levam à cabeça do MFP ou aos reservatórios de líquido. Purifique ambas as capilares com água das seringas a uma taxa de fluxo de cerca de 10 a 50 microlitros por minuto, dependendo do tamanho da seringa, até que cerca de 10 microlitros de água permaneçam nas seringas. Limpe a cabeça do MFP por sonicador usando detergente para vidraria para limpeza padrão, ou água sanitária a 0,5% para limpeza rigorosa, durante cinco minutos.

Limpe os canais com água imergindo o ápice em água e aplicando vácuo nos vias. Inspecione os canais sob um microscópio estereoscópico em busca de obstruções potenciais e repita o passo anterior, se necessário. Em seguida, fixe a cabeça limpa no suporte de cabeça e parafuse o conector na cabeça.

Insira os capilares purgados em um adaptador apropriado de conector microfluídico que se conecte aos orifícios do canal na cabeça. Parafuse o suporte da cabeça ao estágio Z, que é usado para controlar a distância do espaço entre a cabeça e a monocamada celular, antes de realizar a calibração final conforme descrito no protocolo textual. Obtenha uma distância aproximada de espaço zero trazendo a cabeça MFP sobre uma lâmina de câmara sem células e descendo lentamente em etapas de cinco mícrons.

Após o contato da sonda com o substrato, devem ser observados os anéis de Newton. Esta é uma estimativa aproximada. Uma posição precisa deve ser obtida após o ajuste da coplanaridade do ápice da sonda com o substrato.

Quando formados, certifique-se de que os anéis de Newton sejam simétricos. Para garantir a coplanaridade do ápice da sonda, ajuste a inclinação da cabeça usando um goniômetro na interface entre a cabeça e a plataforma Z. Mova a cabeça da MFP 20 mícrons para longe do substrato e ajuste a inclinação usando o goniômetro.

Repita a descida, a calibração e o ajuste de inclinação até que os anéis de Newton sejam simétricos ao contato. Com a inclinação ajustada, defina a posição Z, que produz anéis de Newton simétricos, em zero. Em seguida, prepare o líquido de processamento para o canal de injeção interno e a solução tampão de extração necessária para a injeção externa, conforme descrito no protocolo textual.

Usando a linha de drenagem conectada às bombas de seringa, remova a água remanescente e aspire as soluções desgaseificadas para dentro das seringas de injeção a 40 microlitros por minuto até que as seringas estejam cheias. Isso garante o preenchimento sem bolhas das seringas, conectores e capilares. Para preparar as monocamadas celulares em lâminas com câmara, expanda as células em frascos do tipo T utilizando protocolos padrão de cultura celular.

Após atingir a confluência celular nos frascos de cultura, faça a tripsinização e colete as células. Semeie 0,2 milhão de células por centímetro quadrado em cada uma das câmaras dos lâminas de duas câmaras para o padronização. Incube as células por 48 horas, utilizando as células em uma das câmaras como controle de crescimento e viabilidade celular.

Após atingir a confluência celular nas lâminas de câmara, incubar as células por 45 minutos com 500 microlitros de solução de corante marcador celular na concentração de 10 micromolar, preparada em meio sem soro. Isso é feito para visualização celular durante o delineamento. Lavar as células marcadas com PBS, enxaguando suavemente cada câmara com uma pipeta.

Posteriormente, cultive as células em meio suplementado com soro para os experimentos de padronização. O confinamento hidrodinâmico por fluxo localiza líquidos mediante injeção e aspiração simultâneas de um líquido de processamento. No confinamento hierárquico, múltiplos líquidos de processamento são confinados, sendo que o HFC externo protege a amostra do HFC de processamento interno.

Mova a MFP sobre a monocamada celular até uma distância de afastamento de 50 micrômetros do lâmina de vidro. Essa distância de afastamento garante o contato da HFC hierárquica e também leva em consideração a variação da superfície e da espessura da monocamada. Injete hidróxido de sódio a seis ou oito microlitros por minuto através do I-dois.

Avalie outras taxas de fluxo utilizando as regras de fluxo no protocolo descrito no texto. Module o tamanho do HFC interno alterando a relação entre as taxas de fluxo de injeção QI-dois e QI-um usando as seringas de injeção. Por exemplo, utilize um QI-um entre 1,3 microlitros por minuto e quatro microlitros por minuto, mantendo o QI-dois fixo em oito microlitros por minuto, para obter uma pegada de hidróxido de sódio de 150 a 300 células.

Injete meio completo a partir das aberturas mais externas da cabeça do MFP a uma taxa de fluxo de 20 microlitros por minuto para compensar a evaporação do meio e a aspiração durante a operação do hHFC. Para criar padrões nas monocamadas celulares, configure o software da platina para mover a cabeça da sonda sobre a monocamada celular em padrões definidos pelo usuário a uma velocidade de varredura de 10 mícrons por segundo e uma distância de afastamento de 50 mícrons. Com o hHFC aninhado em funcionamento e em contato com a monocamada, varra o MFP ao longo da trajetória do padrão desejado para promover a remoção celular padronizada.

Para um cultivo em co-cultura após a remoção do primeiro tipo de célula, semeie uma linha celular diferente para preencher os espaços, como antes. Prepare a estação de amostragem para a análise subsequente do lisado. Aqui é mostrado um exemplo de uma estação de amostragem, que compreende um suporte de PCR em tira de oito peças fabricado por impressão tridimensional.

Limpe o suporte para tubos com etanol 70% ou outros descontaminantes de superfície, conforme a rigidez desejada para a aplicação. Use um clipe magnético no suporte para tubos para fixá-lo ao suporte do substrato. Após preparar a estação de amostragem, posicione a cabeça do MFP a 100 micrômetros da monocamada.

Inicie a operação do hHFC com solução de hidróxido de sódio 50 milimolar como líquido de processamento para o canal de injeção interno com uma taxa de fluxo de um microlitro por minuto para QI-um, seis microlitros por minuto para QI-dois, menos sete microlitros por minuto para QA-um e menos 17,5 microlitros por minuto para QA-dois. Uma vez que o confinamento de fluxo tenha se estabilizado, desça a cabeça da sonda até uma distância de afastamento de 50 mícrons para realizar a lise local baseada em hidróxido de sódio na subpopulação escolhida de células com o hHFC. Após a conclusão da lise da subpopulação, direcione a cabeça em direção aos tubos na estação de amostragem.

Ejete o lisado coletado diretamente nos tubos de PCR. Após o processamento do lisado, conforme descrito no protocolo textual, carregue o lisado em um fluxo de trabalho padrão de qPCR conforme estabelecido pelo fornecedor do instrumento. Ao controlar a proporção dos líquidos de injeção na HFC hierárquica, o tamanho da área de contato com a superfície celular é modulado.

As taxas de fluxo foram escolhidas de modo que o efeito químico, e não o cisalhamento, fosse o mecanismo dominante para a lise celular. Isso foi confirmado mediante a determinação do cisalhamento utilizando dinâmica de fluidos computacional. Aqui é mostrada a geração de uma grade de ilhas de células por meio de programação de trajetória de varredura com o MFP.

A modulação do tamanho da pegada usando a proporção do líquido de injeção permite o controle da resolução da remoção de células. Este método pode ser utilizado para o cultivo sequencial de múltiplas populações celulares, gerando assim padrões complexos de interações célula a célula. O uso de hidróxido de sódio como líquido de processamento torna o lisado compatível com análises baseadas em PCR das células.

Aqui, o conteúdo de DNA foi quantificado a partir de cinco e uma impressão digital, lisados usando o método descrito. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em células em menos de 30 minutos. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar-se de garantir que os canais e as capilares estejam livres de bolhas de ar, pois isso pode afetar negativamente a HFC.

Não se esqueça de que trabalhar com hidróxido de sódio, uma solução química corrosiva, pode ser extremamente perigoso, e precauções como o uso de óculos de segurança e jalecos laboratoriais devem sempre ser tomadas ao realizar este procedimento. Após este procedimento, podemos analisar localmente as células por imunomarcação ou sequenciamento de DNA-RNA por lise mediada por MFP, a fim de responder perguntas adicionais, como quais proteínas estão superexpressas devido ao confinamento geométrico das células. Após seu desenvolvimento, esta técnica pode abrir caminho para pesquisadores na área de biologia molecular explorarem a sinalização intra- e extracelular durante a geração e degeneração de tecidos.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como criar padrões subtrativos em monocamadas celulares configuradas no MFP para processamento local e produzir geometrias complexas de cocultivos celulares.