Padronização de Microrganismos e Micropartículas através da Montagem Sequencial assistida pela Capilaridade

Este método permite produzir padrões definidos pelo usuário de microrganismos dentro de um canal microfluido. Uma vez padronizados, os microrganismos podem ser monitorados para avaliar sua fisiologia de longo prazo e interação com alto rendimento. O uso de forças capilares permite uma rota inespecífica para a padronização, que é aplicável em diferentes classes de materiais.

Por exemplo, partículas coloidais e bactérias. Além disso, permite produzir grandes matrizes com controle requintado do arranjo espacial do material de interesse. Até hoje, testamos e aplicamos o método em partículas coloidais e células microbianas.

Como resultado, ele pode encontrar aplicações em engenharia de materiais e campos que requerem análises quantitativas unicelulares, como a triagem de medicamentos. Para começar, prepare uma mistura de PDMS misturando o elastômero com seu agente de ligação cruzada. Em seguida, mexa a mistura vigorosamente para misturar os dois componentes uniformemente até que as bolhas de ar sejam formadas e a mistura PDMS pareça opaca.

Agora, desgas a mistura em um desiccador a vácuo até que todas as bolhas de ar sejam removidas e a mistura pareça transparente novamente. Para obter um piso de modelo de 400 micrômetros de espessura do chip microfluido, despeje três gramas da mistura no mestre do silício e coloque o mestre de silício em um revestimento de spin para girar o casaco a 21 vezes G por cinco segundos e 54 vezes G por 10 segundos. Degas novamente para remover as bolhas de ar presas como descrito anteriormente.

Despeje 20 gramas da mistura PDMS no molde impresso em 3D para fazer o microcanal que servirá como o teto do chip microfluido e degas-lo por 30 minutos como descrito anteriormente. Asse o wafer de silício e o molde impresso em 3D a 70 graus Celsius por pelo menos duas horas, depois corte o PDMS ao longo do contorno do molde impresso em 3D e retire-o. Corte o PDMS com uma lâmina ao redor dos microcanais e faça os orifícios que servirão de entrada e saída do canal microfluido.

Agora corte o PDMS e retire-o do mestre de silício e corte a camada PDMS em pedaços menores com as mesmas dimensões dos canais microfluidos que serão ligados em cima dos modelos. Esfregue suavemente os modelos e microcanais usando uma solução de detergente de 1% por cinco minutos e enxágue com água deionizada. Em seguida, enxágue os modelos e microcanais com isopropanol, antes de enxágüá-los com água deionizada.

Agora seque os modelos e microcanais à temperatura ambiente por um minuto com ar comprimido em uma barra. Coloque os modelos e os microcanais em um limpador de plasma com as superfícies de ligação voltadas para cima. Depois de ligar o limpador de plasma, o plasma trata os modelos e microcanais por 40 segundos, depois retire-os do limpador de plasma e ligue imediatamente os microcanais em cima dos modelos.

Armazene os chips microfluidos em um forno a 70 graus Celsius durante cinco dias para garantir a recuperação hidrofóbica do PDMS. No dia do experimento, coloque a incubadora da caixa a 37 graus Celsius várias horas antes do experimento, em seguida, configure a bomba de seringa e a placa de vidro aquecida no estágio do microscópio, configurando a mesma temperatura que a da incubadora da caixa. 90 minutos antes do experimento, coloque o chip microfluido em um navio cheio de 100% de etanol e lave o canal com 100% de etanol por pelo menos 10 minutos, depois coloque o chip microfluido em um desiccador de vácuo e degas por pelo menos 30 minutos.

Agora troque o etanol com água destilada e o vácuo trate o chip por pelo menos 30 minutos. Coloque o chip microfluido no forno a 70 graus Celsius por 10 minutos para remover quaisquer traços de líquido deixados no canal. Pipeta um mililitro de mops médio em um frasco de centrífugas e adicionar 10 microliters de 0,132 fosfato de potássio molar.

Alíquota de 100 microliters da cultura da noite para o dia no frasco de centrífugas e centrífuga da cultura a 2.300 vezes G por dois minutos. Descarte suavemente o supernatante para resuspensar a pelota em um mililitro de mops médio fresco com 0,015% de Tween 20 e 0,01% de fosfato de potássio e carregar a suspensão bacteriana em uma seringa mililitro. Para fixar a seringa e a conexão de tubulação, insira diretamente uma agulha na tubulação.

Agora monte a seringa na bomba de seringa e injete a suspensão no chip microfluido através da entrada localizada na parte upstream do canal até que a suspensão cubra a região do modelo com armadilhas. Defina a bomba de seringa a uma taxa de fluxo de 0,07 a 0,2 microlitros por minuto para retirar a suspensão bacteriana e monitorar o processo de padronização via software de microscópio. Uma vez que o modelo tenha sido padronizado com células, aumente a taxa de fluxo de retirada para esvaziar rapidamente o canal microfluido e lavá-lo com LB fresco que foi anteriormente desgaseado por pelo menos 30 minutos e pré-equipado a 30 graus Celsius.

Agora, coloque a bomba de seringa a uma taxa de fluxo de dois microliters por minuto para lavar suavemente o canal. Uma vez preenchido o canal, aumente novamente a vazão. Adquira imagens de bactérias em crescimento na ampliação desejada e intervalo de tempo.

Pipeta 900 microliters de uma solução aquosa 0,015%Tween 20 em um frasco de centrífuga e, em seguida, pipeta 100 microliters da suspensão coloidal original nele. Centrifugar a suspensão a 13.500 vezes G por um minuto e substituir suavemente o supernatante pela solução aquosa Tween 20. Carregue a suspensão coloidal em uma seringa de um mililitro e conecte a seringa ao chip através de tubos microfluidos.

Injete a suspensão no chip microfluídico através da entrada localizada dentro da seção central na parte upstream do canal e empurre gradualmente a suspensão até que o modelo seja coberto. Retire a suspensão coloidal a uma taxa de fluxo de 0,07 a 0,2 microlitros por minuto e imagem do processo de padronização via software de microscópio. Aumente a taxa de fluxo assim que o menisco chegar ao final do modelo rapidamente.

A geometria do canal reto foi explorada para padronizar células estacionárias em fases de uma cepa fluorescente de Escherichia coli depositando 83% das 5.000 armadilhas analisadas. As bactérias padronizadas retomaram o crescimento em diferentes horários dentro de 1,5 horas a partir de quando o canal estava cheio de LB fresco. Uma vez que o crescimento foi retomado, células bacterianas únicas começaram a formar colônias individuais que se expandiram até que uma camada superficial foi formada e a resolução de células únicas foi perdida. Análises realizadas em mais de 55.000 armadilhas mostraram que as partículas verde-vermelhas feitas por duas e um partículas de diâmetro de micrômetro foram formadas em 93% e 89% das armadilhas analisadas, respectivamente.

E aparadores verde-vermelho-verde foram formados em 52% das armadilhas. A distância entre partículas padronizadas pode ser precisamente controlada realizando dois depoimentos em direções opostas, prendendo tais partículas nas extremidades opostas de cada armadilha. É importante garantir a temperatura uniforme em todo o modelo para evitar a condensação durante o processo de padronização.

Para isso, colocamos uma placa de vidro aquecida por baixo do modelo e a colocamos na mesma temperatura da incubadora da caixa. Este método pode ser usado em uma variedade de estudos biológicos envolvendo análises quantitativas unicelulares. Uma vantagem única é que sua natureza de alto rendimento permite a padronização de milhares de células fornecendo grandes estatísticas dentro da mesma arena experimental.