Ordenação temporal de Expressão Dynamic Data de expressão espacial mapas detalhados

O objetivo geral deste procedimento experimental é mapear a dinâmica da expressão gênica espaço-temporal do relógio de segmentação de vertebrados usando amostragem fixa de tecido. Este método permite uma avaliação imparcial da dinâmica gênica oscilatória no mesoderma pré-somítico, e isso é crucial para a compreensão dos mecanismos moleculares que governam a somatogênese dos vertebrados. A principal vantagem desta técnica é que muitas amostras podem ser geradas e processadas simultaneamente, permitindo a análise em três partes da dinâmica da expressão gênica em tecido fixo.

Demonstrando o procedimento estará a Dra. Charlotte Bailey, que é uma ex-pós-doutoranda em meu laboratório. Após a obtenção de um corno uterino de camundongo de acordo com o protocolo de texto, sob um microscópio estereoscópico, utilizou-se uma tesoura curva para cortar a espessa membrana muscular do corno uterino e extrair cuidadosamente cada embrião. Com uma tesoura curva e uma pinça fina, disseque o saco amniótico de cada embrião.

Em seguida, usando uma agulha cirúrgica ou uma tesoura curva, colha o tecido da cauda de cada embrião cortando o embrião anterior aos botões dos membros posteriores. Equilibre o tecido da cauda com o lado ventral voltado para baixo. Em seguida, gere pares de explantes de PSM dissecando o tecido da cauda em duas metades ao longo da linha média, usando um movimento suave de balanço com a agulha.

Certifique-se de que o tubo neural, a notocorda e o tecido PSM estejam igualmente divididos entre os dois explantes. Em seguida, pipete cada explante PSM contralateral na parte inferior de uma tampa de prato de cultura de plástico de 35 mm em um pequeno volume de meio de cultura pré-aquecido. Coloque o prato na parte superior da tampa e inverta-o rapidamente, de modo que o tecido PSM fique suspenso da tampa em uma gota suspensa de meio.

Em seguida, cultive os explantes PSM em uma câmara umidificada a 37 graus Celsius por uma a duas horas. Transfira pares de explantes PSM para os poços individuais de uma placa de cultura de tecidos de 24 poços. Em seguida, adicione 4% de paraformaldeído em PBS às amostras e incube a placa em temperatura ambiente por uma hora ou a quatro graus Celsius em uma plataforma de balanço durante a noite.

Após a incubação, use PBS para lavar os poços de amostra em temperatura ambiente em uma plataforma de balanço. Com uma pipeta de plástico fino Pasteur, troque a solução de PBS nas amostras três a quatro vezes. Para realizar a imuno-histoquímica, adicione 2% de Triton X-100 em PBS a um explante de PSM de cada par embrionário e incube as amostras em temperatura ambiente em uma plataforma de balanço por uma hora para lavá-las.

Use PBS para enxaguar brevemente as amostras. Em seguida, substitua o PBS por uma solução de bloqueio e incube as amostras a quatro graus Celsius em uma plataforma de balanço durante a noite. Usando o tampão de trabalho, dilua os anticorpos primários desejados.

Neste exemplo, anticorpos para Delta-like 1 e Notch1 são usados em uma diluição de 1:25. Adicione os anticorpos aos explantes e incube as amostras em uma plataforma de balanço a quatro graus Celsius por três a cinco dias. Após a incubação, use PBS para lavar as amostras duas vezes por cinco a dez minutos cada.

Em seguida, execute três lavagens em 0,3% Triton X-100 em PBS em temperatura ambiente em uma plataforma de balanço. Depois de diluir os anticorpos secundários no tampão de trabalho, adicione 250-500 microlitros da solução de anticorpos a cada poço de amostra, tomando cuidado para não usar os últimos microlitros de solução, que podem conter agregados de anticorpos. Com papel alumínio, cubra a placa e incube as amostras em solução de anticorpos secundários no escuro a quatro graus Celsius por três a cinco dias.

Após a incubação, use PBST para lavar as amostras duas vezes por dez minutos cada. Em seguida, use PBS para lavar o tecido uma vez em temperatura ambiente em uma plataforma de balanço por cinco minutos. Seguindo o protocolo de texto, desidratar e reidratar os demais explantes contralaterais de PSM por meio de uma série de diluição de etanol PBST.

Adicione dez microgramas por mililitro de Proteinase K em 0,1% PBST aos explantes e incube o tecido sem agitação por cinco minutos. Em seguida, remova rapidamente a solução de proteinase K e use PBST para enxaguar brevemente as amostras. Adicione 4% de formaldeído e 0,1% de glutaraldeído em PBST aos explantes de PSM para fixá-los e incubar as amostras por 30 minutos.

Em seguida, depois de usar PBST para lavar as amostras duas vezes por dez minutos cada, adicione a mistura de hibridização a 50% ao tecido e incube a 65 graus Celsius sem agitação por dez minutos. Depois de incubar as amostras e a mistura de hibridização de acordo com o protocolo de texto, remova a solução e adicione 0,25 a 0,5 mililitros de mistura de hibridização pré-aquecida contendo uma sonda de RNA antisense marcada com digoxigenina contra um componente de relógio de segmentação conhecido. Use fita adesiva para selar a placa e incubar as amostras a 65 graus Celsius por duas noites.

Após a incubação, use uma mistura de hibridização pré-aquecida a 50% em TBST para lavar as amostras por 15 minutos. Em seguida, use TBST para enxaguar as amostras duas vezes antes de incubar o tecido em TBST em temperatura ambiente em uma plataforma de balanço por 30 minutos. Em seguida, pré-incube os explantes em solução de bloqueio por no mínimo duas horas.

Em seguida, substitua a solução por uma solução de bloqueio nova, contendo uma diluição de 1:200 de anticorpo anti-digoxigenina conjugado HRB. Incube as amostras a quatro graus Celsius durante a noite. No dia seguinte, use TBST para enxaguar as amostras três vezes em temperatura ambiente e transferi-las para poços individuais de uma nova placa de cultura de tecidos de 24 poços.

Em seguida, com TBST, lave os explantes três vezes por uma hora cada. Use um kit de amplificação de sinal de tiramida para visualizar o mRNA detectado antes de preparar as amostras para imagem. Prepare uma lâmina de vidro de adesão carregada para cada par de explantes, removendo o revestimento adesivo de um espaçador de imagem de 0,12 mm de espessura e colando-o em uma lâmina de vidro.

Depois de posicionar um par ou explantes na lâmina de acordo com o protocolo de texto, deixe as amostras aderirem à lâmina por 45 a 60 segundos, até que o tecido comece a parecer pegajoso e translúcido sem secar completamente. Enquanto isso, use uma pinça para remover o revestimento adesivo restante do espaçador e adicione uma grande gota de meio de montagem de dupla função e solução de limpeza às amostras no centro do espaçador. Aplique uma lamínula circular nas amostras, certificando-se de que o meio de montagem seja distribuído uniformemente e que todas as bordas entrem em contato com o espaçador.

Em seguida, coloque a lamínula de cabeça para baixo em um papel de baixo fiapos. Pressione com firmeza para garantir que a lamínula adira totalmente ao espaçador e que qualquer excesso de meio de montagem seja removido. Repita esse processo até que nenhum outro meio de montagem borre o papel.

Limpe e rotule a lâmina e guarde-a no escuro até a geração de imagens. Em seguida, realize imagens e análises de acordo com o protocolo de texto. Neste experimento, a expressão das proteínas Delta-Like 1 e Notch1 oscila fora de sincronia, organizando temporariamente os embriões de acordo com a transcrição nascente da franja lunática intrônica do gene do relógio de segmentação regulada por Notch detectada na metade de cada par de explantes.

Os painéis são organizados de acordo com as fases um, dois e três do ciclo de clock de segmentação. A extensão dos domínios de expressão para Delta-Like 1, Notch1 e franja lunática intrônica ao longo do eixo ântero-posterior do PSM é demarcada por barras codificadas por cores. Conforme mostrado aqui, um gráfico é gerado para quantificar a intensidade do sinal Delta-Like 1, Notch1 e franja lunática intrônica em relação ao eixo ântero-posterior do PSM e ilustra a variação axial e a intensidade do sinal através do PSM ao longo do ciclo do relógio.

Os quimógrafos visualizam a distribuição espacial de Delta-Like 1, Notch1 e franja lunática intrônica em vários PSMs. Cada linha do quimógrafo representa a intensidade do sinal de um explante PSM individual. A quantificação da intensidade do sinal Delta-Like 1, Notch1 e franja lunática intrônica em relação ao eixo ântero-posterior do PSM revela uma clara dinâmica de expressão oscilatória para esses alvos.

Finalmente, esses quimógrafos mostram a distribuição espacial da forma clivada e ativada do receptor Notch NICD, Delta-Like 1, franja lunática intrônica e Notch1 em vários PSMs. Essa técnica ajudou os pesquisadores no campo da mitogênese de vertebrados a entender melhor a dinâmica da oscilação do gene de segmentação no mesoderma pré-somítico de pintinhos e camundongos. Uma vez dominada, essa técnica pode ser realizada em um grande número de amostras, permitindo que os perfis de expressão de vários mRNAs e proteínas de interesse sejam analisados simultaneamente.

Após este procedimento, a quantificação adicional dos dados de imagem pode fornecer uma compreensão dos atrasos temporais na expressão gênica, bem como a localização subcelular dos sinais de RNA e proteína de interesse para o pesquisador. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como mapear a dinâmica da expressão gênica espaço-temporal do relógio de segmentação de vertebrados usando amostragem de tecido espesso. Isso pode ser seguido pela análise automatizada de imagens, conforme detalhado no protocolo de texto.

Ao tentar este procedimento, é importante garantir a distribuição igual de PSM, notocorda e tubo neural entre os explantes de PSM e otimizar cuidadosamente as diluições de anticorpos antes de iniciar. Lembre-se de que trabalhar com formamida, paraformaldeído e glutaraldeído pode ser extremamente perigoso. Tome cuidado para usar equipamento de proteção individual e trabalhar em uma capela de exaustão, quando aplicável.