Ordenação temporal de Expressão Dynamic Data de expressão espacial mapas detalhados

O objetivo geral deste procedimento experimental é mapear a dinâmica espacial e temporal da expressão gênica do relógio de segmentação de vertebrados utilizando amostragem de tecido fixado. Este método permite uma avaliação imparcial da dinâmica oscilatória dos genes no mesoderma pré-somítico, o que é crucial para compreender os mecanismos moleculares que regem a somatogênese em vertebrados. A principal vantagem desta técnica é que muitas amostras podem ser geradas e processadas simultaneamente, permitindo uma análise tridimensional abrangente da dinâmica da expressão gênica em tecido fixado.

Quem demonstrará o procedimento será a Dra. Charlotte Bailey, ex-pós-doutoranda no meu laboratório. Após obter um corno uterino de camundongo de acordo com o protocolo descrito no texto, utilize uma tesoura curva sob um microscópio estereoscópico para cortar a membrana muscular espessa do corno uterino e extrair cuidadosamente cada embrião. Com a tesoura curva e pinças finas, dissecar a bolsa amniótica de cada embrião.

Em seguida, utilizando uma agulha cirúrgica ou tesoura curva, colete o tecido da cauda de cada embrião cortando o embrião anteriormente aos brotos das patas traseiras. Posicione o tecido da cauda com o lado ventral voltado para baixo. Em seguida, obtenha pares de explantes do mesoderma paraxial (PSM) dissecando o tecido da cauda em duas metades ao longo da linha média, usando um movimento suave de vaivém com a agulha.

Certifique-se de que o tubo neural, a notocorda e o tecido da MPE sejam igualmente divididos entre os dois explantes. Em seguida, pipete cada explante contralateral da MPE para o lado inferior da tampa de uma placa de cultura plástica de 35 mm, em um pequeno volume de meio de cultura pré-aquecido. Coloque a placa sobre a tampa e inverta rapidamente, de modo que o tecido da MPE fique suspenso na tampa em uma gota suspensa de meio.

Em seguida, cultive os explantes de MSP em uma câmara umidificada a 37 graus Celsius por uma a duas horas. Transfira pares de explantes de MSP para os poços individuais de uma placa de cultura celular de 24 poços. Em seguida, adicione paraformaldeído a 4% em PBS às amostras e incube a placa à temperatura ambiente por uma hora, ou a quatro graus Celsius em uma plataforma oscilante durante a noite.

Após a incubação, use PBS para lavar as cavidades da amostra à temperatura ambiente em uma plataforma agitadora. Com uma pipeta Pasteur plástica fina, troque a solução de PBS nas amostras de três a quatro vezes. Para realizar a imunohistoquímica, adicione 2% de Triton X-100 em PBS a um explante de SMS de cada par embrionário e incube as amostras à temperatura ambiente em uma plataforma agitadora por uma hora para lavá-las.

Use PBS para lavar brevemente as amostras. Em seguida, substitua o PBS pela solução de bloqueio e incube as amostras a quatro graus Celsius em uma plataforma agitadora durante a noite. Dilua os anticorpos primários desejados usando o tampão de trabalho.

Neste exemplo, utilizam-se anticorpos contra Delta-like 1 e Notch1 em uma diluição de 1:25. Adicione os anticorpos aos explantes e incube as amostras em uma plataforma agitadora a quatro graus Celsius por três a cinco dias. Após a incubação, use PBS para lavar as amostras duas vezes, por cinco a dez minutos cada.

Em seguida, realize três lavagens com Triton X-100 0,3% em PBS à temperatura ambiente em plataforma agitadora. Após diluir os anticorpos secundários no tampão de trabalho, adicione 250-500 microlitros da solução de anticorpo a cada poço da amostra, tomando cuidado para não utilizar os últimos microlitros da solução, que podem conter agregados de anticorpos. Com folha de alumínio, cubra a placa e incube as amostras na solução de anticorpo secundário no escuro a quatro graus Celsius por três a cinco dias.

Após a incubação, use PBST para lavar as amostras duas vezes, durante dez minutos cada. Em seguida, lave o tecido uma vez com PBS à temperatura ambiente em uma plataforma oscilante durante cinco minutos. Conforme o protocolo descrito, desidrate e reidrate os explantes restantes do PSM contralateral por meio de uma série de diluições de etanol em PBST.

Adicione dez microgramas por mililitro de Proteinase K em PBST 0,1% aos explantes e incube o tecido sem agitação por cinco minutos. Em seguida, remova rapidamente a solução de Proteinase K e use PBST para lavar brevemente as amostras. Adicione 4% de formaldeído e 0,1% de glutaraldeído em PBST aos explantes de PSM para pós-fixá-los e incube as amostras por 30 minutos.

Em seguida, após lavar as amostras duas vezes com PBST, durante dez minutos cada, adicione a mistura de hibridização a 50% ao tecido e incube a 65 graus Celsius sem agitação por dez minutos. Após a incubação das amostras com a mistura de hibridização conforme o protocolo descrito, remova a solução e adicione de 0,25 a 0,5 mililitros da mistura de hibridização pré-aquecida contendo uma sonda de RNA antissenso marcada com digoxigenina contra um componente conhecido do relógio de segmentação. Use fita adesiva para selar a placa e incube as amostras a 65 graus Celsius por duas noites.

Após a incubação, use uma mistura de hibridização pré-aquecida a 50% em TBST para lavar as amostras durante 15 minutos. Em seguida, enxágue as amostras duas vezes com TBST antes de incubá-las em TBST à temperatura ambiente em uma plataforma agitadora durante 30 minutos. A seguir, pré-incube os explantes na solução bloqueadora por um mínimo de duas horas.

Em seguida, substitua a solução por solução bloqueadora fresca, contendo uma diluição 1:200 do anticorpo anti-digoxigenina conjugado com HRB. Incube as amostras a quatro graus Celsius durante a noite. No dia seguinte, use TBST para lavar as amostras três vezes à temperatura ambiente e transfira-as para poços individuais de uma nova placa de cultura de tecidos de 24 poços.

Em seguida, lave os explantes três vezes com TBST, durante uma hora cada vez. Utilize um kit de amplificação de sinal com tiramida para visualizar o mRNA detectado antes de preparar as amostras para a obtenção de imagens. Prepare um lâmina de vidro adesiva carregada para cada par de explantes removendo o revestimento adesivo de um espaçador de imagem com espessura de 0,12 mm e fixando-o em uma lâmina de vidro.

Após posicionar um par de explantes sobre a lâmina conforme descrito no protocolo, deixe as amostras aderirem à lâmina por 45 a 60 segundos, até que o tecido comece a parecer pegajoso e translúcido, sem secar completamente. Enquanto isso, use pinças para remover o forro adesivo restante do espaçador e adicione uma grande gota de meio de montagem de função dupla e solução de clareamento às amostras no centro do espaçador. Coloque uma lamínula circular sobre as amostras, garantindo que o meio de montagem seja distribuído uniformemente e que todas as bordas entrem em contato com o espaçador.

Em seguida, coloque a lâmina com lamínula virada para baixo sobre um papel com baixa quantidade de fiapos. Pressione firmemente para garantir que a lamínula adere completamente ao espaçador e que todo o meio de montagem em excesso seja removido. Repita este processo até que nenhum meio de montagem adicional manche o papel.

Limpe e rotule a lâmina e armazene-a no escuro até a aquisição de imagens. Em seguida, realize a aquisição de imagens e a análise conforme o protocolo descrito no texto. Neste experimento, demonstra-se que a expressão das proteínas Delta-Like 1 e Notch1 oscila fora de sincronia, organizando temporariamente os embriões de acordo com a transcrição nascente do gene do relógio de segmentação regulado pelo Notch, lunatic fringe intrônico, detectada em uma metade de cada par de explantes.

Os painéis estão organizados de acordo com as fases um, dois e três do ciclo do relógio de segmentação. A extensão dos domínios de expressão de Delta-Like 1, Notch1 e lunatic fringe intrônico ao longo do eixo anteroposterior da MPE são delimitadas por barras codificadas por cores. Como mostrado aqui, é gerado um gráfico para quantificar a intensidade do sinal de Delta-Like 1, Notch1 e lunatic fringe intrônico em relação ao eixo anteroposterior da MPE e ilustra a variação axial e a intensidade do sinal ao longo da MPE durante todo o ciclo do relógio.

Os quimógrafos visualizam a distribuição espacial de Delta-Like 1, Notch1 e intronico lunatic fringe em diversos PSMs. Cada linha do quimógrafo representa a intensidade do sinal de um explante individual de PSM. A quantificação da intensidade do sinal de Delta-Like 1, Notch1 e intronico lunatic fringe em relação ao eixo anteroposterior do PSM revela dinâmicas claras de expressão oscilatória para esses alvos.

Por fim, esses quimógrafos mostram a distribuição espacial da forma clivada e ativada do receptor Notch NICD, Delta-Like 1, lunatic fringe intrônico e Notch1 em diversos MPPs. Esta técnica auxiliou pesquisadores na área da mitogênese de vertebrados a compreender melhor a dinâmica da oscilação dos genes de segmentação no mesoderma pré-somítico de galinha e camundongo. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em grande número de amostras, permitindo que os perfis de expressão de diversos RNAs mensageiros e proteínas de interesse sejam analisados simultaneamente.

Após este procedimento, a quantificação adicional dos dados de imagem pode proporcionar uma compreensão dos atrasos temporais na expressão gênica, bem como da localização subcelular dos sinais de RNA e proteína de interesse para o pesquisador. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como mapear a dinâmica espacial-temporal da expressão gênica do relógio de segmentação de vertebrados utilizando amostragem de tecido espesso. Isso pode ser seguido por análise automatizada de imagens conforme detalhado no protocolo textual.

Ao realizar este procedimento, é importante garantir uma distribuição igual de MPE, notocorda e tubo neural entre os explantes de MPE e otimizar cuidadosamente as diluições dos anticorpos antes de iniciar. Lembre-se de que o trabalho com formamida, paraformaldeído e glutaraldeído pode ser extremamente perigoso. Tenha cuidado para usar equipamento de proteção individual e trabalhar em capela de exaustão quando aplicável.