Name: A quantificação temporal da expressão MAPK induzida em células de levedura Solteiro (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-04T23:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 59 s
Description: Aprenda a quantificar a expressão de MAPK em células individuais de levedura usando microscopia de células vivas e citometria de fluxo. Este método combina análise temporal e visualização em tempo real para estudar dinâmicas de expressão gênica.

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Os autores agradecem Matthias Peter e seu grupo do Instituto de Bioquímica da ETH em Zurique, onde estes métodos têm sido desenvolvidos. Este trabalho foi financiado pela Fundação de Ciência Nacional Suíço.

1. Medidas Microscopia <ol><li> Inocular 5 ml de meio sintético com levedura. </li><li> Crescer as células a 30 ° C durante a noite. </li><li> Medir a OD 600 da cultura durante a noite a na manhã seguinte. </li><li> Dilui-se a cultura durante a noite em 5 ml de meio sintético de OD 600 de 0,05. </li><li> Crescer a cultura diluída a 30 ° C durante pelo menos 4 horas. </li><li> Preparar 3 vezes concentrado (0,6 M) de NaCl em meio sintético. </li><li> Prepara-se uma solução de 1 mg / ml de Concanavalina A (ConA) em PBS. </li><li> Filtrado ~ 200 mL de solução para o poço de ConA corrediça. </li><li> Deixe descansar por 30 min. </li><li> Remover solução ConA. </li><li> Adicionar 150 mL de H 2 O para o poço. </li><li> Retirar H 2 O. </li><li> Medida OD600 da cultura de células. </li><li> Prepare 300 mL de cultura de células em OD 600 = 0,02 em um microtubo de 1,5 ml. </li><li> Sonicar as células num banho de água durante 45 segundos. </li><li> Vortex brevemente a microtube. </li><li> Sonicar as células num banho de água durante 45 segundos. </li><li> Vortex brevemente o microtubo. </li><li> Adicionar 200 mL de cultura de células para o bem. </li><li> Esperar 30 minutos para permitir que as células se depositam no fundo do poço. </li><li> Colocar o bem corrediça sobre o microscópio. </li><li> Selecione as configurações de iluminação para o canal fluorescente para ser gravado. </li><li> Seleccionar as configurações de iluminação por duas imagens de campo claro (um pouco fora do foco: 3 um abaixo do plano focal para permitir uma adequada segmentação das células). </li><li> Selecione os intervalos de tempo para a medição de lapso de tempo </li><li> Selecione os campos de visão a imagem. </li><li> Iniciar a aquisição de alguns fotogramas. </li><li> Pausa a aquisição para adicionar os 100 ml de 0,6 M NaCl médio. </li><li> Retomar imagem. </li></ol> 2. Medidas Citometria de Fluxo <ol><li> Inocular 5 ml de meio sintético com levedura. </li><li> Crescer a 30 ° C durante a noite. </li><li> Medidaa DO600 da cultura durante a noite a na manhã seguinte. </li><li> Dilui-se a cultura durante a noite em 5 ml de meio sintético de OD 600 de 0,1. </li><li> Crescer a 30 ° C durante pelo menos 4 horas, para atingir uma DO 600 de 0,2-0,4. </li><li> Preparar a solução de cicloheximida 1 mg / ml em H 2 O. </li><li> Preparar 3 vezes concentrado (0,6 M) de NaCl em meio sintético. </li><li> Preparar um microtubo de 1,5 mL com 100 uL de 0,6 M de NaCl média para cada ponto de tempo a ser medidos. </li><li> No tempo 0, adicionar 200 mL de cultura de células a cada microtubo. </li><li> Incubar, sob agitação, a 30 ° C. </li><li> No tempo t, adicionar 30 mL cicloheximida para um microtubo. </li><li> Repita o passo 2.11 para todos os momentos desejados. </li><li> Incubar todas microtubos durante pelo menos 45 minutos e até 3 horas a 30 ° C com agitação. </li><li> Prepare os tubos de FACS com 400 mL PBS. </li><li> Sonicar das células em banho de água durante 1 min. </li><li> Vortex brevemente os microtubos. </li><li> Filhoicate das células em banho de água durante 1 min. </li><li> Vortex brevemente os microtubos. </li><li> Adicionar 100 ul de cultura de células a partir de cada microtubo no seu correspondente tubo de FACS. </li><li> Selecione o laser de excitação 488 nm e 530/30 nm filtro passa-banda para a detecção. </li><li> Teste não expressar e expressar totalmente amostra para verificar se eles estão na faixa de sensibilidade do detector. </li><li> Medir 10.000 células por cada amostra adquirida. </li></ol>

<ol><li>Gasch, A. P., Spellman, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+expression+programs+in+the+response+of+yeast+cells+to+environmental+changes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biology+of+the+cell%22%5BJournal%5D)">Genomic expression programs in the response of yeast cells to environmental changes.</a> Molecular biology of the cell. 11 (12), 4241-4257 (2000).</li>
<li>de Nadal, E., Zapater, M., Alepuz, P. M., Sumoy, L., Mas, G., Posas, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+MAPK+Hog1+recruits+Rpd3+histone+deacetylase+to+activate+osmoresponsive+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The MAPK Hog1 recruits Rpd3 histone deacetylase to activate osmoresponsive genes.</a> Nature. 427 (6972), 370-374 (2004).</li>
<li>Ghaemmaghami, S., Huh, W. -K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+analysis+of+protein+expression+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Global analysis of protein expression in yeast.</a> Nature. 425 (6959), 737-741 (2003).</li>
<li>Wu, J. -Q., Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Counting+cytokinesis+proteins+globally+and+locally+in+fission+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Counting cytokinesis proteins globally and locally in fission yeast.</a> Science. 310 (5746), 310-314 (2005).</li>
<li>Colman-Lerner, A., Gordon, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulated+cell-to-cell+variation+in+a+cell-fate+decision+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Regulated cell-to-cell variation in a cell-fate decision system.</a> Nature. 437 (7059), 699-706 (2005).</li>
<li>Acar, M., Becskei, A., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancement+of+cellular+memory+by+reducing+stochastic+transitions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Enhancement of cellular memory by reducing stochastic transitions.</a> Nature. 435 (7039), 228-232 (2005).</li>
<li>Pelet, S., Rudolf, F., Nadal-Ribelles, M., de Nadal, E., Posas, F., Peter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+activation+of+the+HOG+MAPK+pathway+regulates+bimodal+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Transient activation of the HOG MAPK pathway regulates bimodal gene expression.</a> Science. 332 (6030), 732-735 (2011).</li>
<li>de Nadal, E., Casadome, L., Posas, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+the+MEF2-like+transcription+factor+Smp1+by+the+stress-activated+Hog1+mitogen-activated+protein+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Targeting the MEF2-like transcription factor Smp1 by the stress-activated Hog1 mitogen-activated protein kinase.</a> Molecular and Cellular Biology. 23 (1), 229-237 (2003).</li>
<li>Elowitz, M. B., Levine, A. J., Siggia, E. D., Swain, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochastic+gene+expression+in+a+single+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Stochastic gene expression in a single cell.</a> Science. 297 (5584), 1183-1186 (2002).</li>
<li>Pelet, S., Dechant, R., Lee, S. S., van Drogen, F., Peter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrated+image+analysis+platform+to+quantify+signal+transduction+in+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Integrative+biology+%3A+quantitative+biosciences+from+nano+to+macro%22%5BJournal%5D)">An integrated image analysis platform to quantify signal transduction in single cells.</a> Integrative biology : quantitative biosciences from nano to macro. 4 (10), 1274-1282 (2012).</li>
<li>Carpenter, A. E., Jones, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CellProfiler%3A+image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+biology%22%5BJournal%5D)">CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome biology. 7 (10), R100(2006).</li>
<li>Chernomoretz, A., Bush, A., Yu, R., Gordon, A., Colman-Lerner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+Cell-ID+1.4+with+R+for+microscope-based+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Current+protocols+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Using Cell-ID 1.4 with R for microscope-based cytometry.</a> Current protocols in molecular biology. Chapter 14, Unit 14.18(2008).</li>
<li>Dimopoulos, S., Mayer, C., Rudolf, F., Stelling, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automatic+Single+Cell+Segmentation+in+a+Variety+of+Microscopy+Images%5BTitle%5D)+AND+%22Current+protocols+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Automatic Single Cell Segmentation in a Variety of Microscopy Images.</a> Current protocols in molecular biology. , (2012).</li>
<li>Miyawaki, A., Nagai, T., Mizuno, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+protein+fluorophore+formation+and+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of protein fluorophore formation and engineering.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 7 (5), 557-562 (2003).</li>
<li>Hersen, P., McClean, M. N., Mahadevan, L., Ramanathan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+processing+by+the+HOG+MAP+kinase+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Signal processing by the HOG MAP kinase pathway.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (20), 7165-7170 (2008).</li>
<li>Pepperkok, R., Ellenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+fluorescence+microscopy+for+systems+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews+Molecular+cell+biology%22%5BJournal%5D)">High-throughput fluorescence microscopy for systems biology.</a> Nature reviews Molecular cell biology. 7 (9), 690-696 (2006).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Microscopia O tratamento do poço com ConA é um passo essencial para assegurar uma imagem adequada das células. Porque ConA tem uma baixa solubilidade em PBS (5 mg / ml), o processo de filtração permite a remoção de grandes agregados que se encontram presentes na solução não filtrada e interferem com a imagem latente. Células prender de forma relativamente forte à superfície tratada e a adição da solução de indução não deve perturbar a localização das células, o que permite um acompanhamento con...

A sinalização por meio de cascatas de transdução de muitas vezes termina com a expressão de proteínas. A caracterização desse perfil de expressão é um elemento chave para a compreensão da função das vias biológicas. A identificação do espectro de sobre-regulada de proteínas e sua dinâmica de activação pode ser alcançada por diversas técnicas, tais como as micro-matrizes, transferências de Northern ou Western blot 1-3. No entanto, essas técnicas de média a resposta de uma população inteira de células. Para compreender a regulação fina da expressão de proteínas, é desejável reunir as medições ao nível da célula individual. O ideal é que estas medidas também deve fornecer dados quantitativos passíveis de desenvolver modelos matemáticos da via subjacente. Microscopia e citometria de fluxo são duas técnicas, as quais são idealmente adequados para entregar tais medições quantitativas de uma única célula. A marcação de proteínas endógeno com uma proteína fluorescente pode be utilizada para quantificar o nível de expressão 4. No entanto, uma vez que a adição de uma grande porção fluorescente no terminal da proteína pode torná-la não-funcional, isto é, muitas vezes mais desejável gerar repórteres de expressão específicas com base em um promotor dirigindo a expressão de uma construção fluorescente. Esta proteína repórter é exógeno ao sistema celular e, portanto, não influencia os eventos de sinalização que estão ocorrendo na célula. Ambos microscopia e citometria de fluxo têm sido amplamente utilizados no campo de sinalização de levedura. Como exemplos; Colman-Lerner e colaboradores correlacionados, em células individuais, a expressão de acasalamento repórteres específicos e constitutivamente expressos por microscopia para quantificar o ruído em levedura acasalamento cascata de transdução de sinal 5, Acar e colegas utilizados citometria de fluxo para estudar a rede reguladora controlando a expressão dos genes GAL 6. Em um estudo anterior 7, nós usamos uma associaçem uma dessas duas técnicas para estudar a saída expressão do alto glicerol osmolaridade (HOG) via em brotamento da levedura. Este mitógeno proteína quinase ativada (MAPK) é desencadeada por estresse hiper-osmótico. Isso resulta na activação dos Hog1 MAPK, que transloca-se para o núcleo da célula para induzir um programa transcricional resultando na expressão de cerca de 300 genes. Para estudar este processo, que tinha engenharia um repórter com base na expressão do promotor STL1 (um gene induzido especificamente em resposta à actividade Hog1 8) dirigindo a expressão de uma proteína fluorescente Vénus quádruplo (p STL1-qV). A citometria de fluxo medições revelaram a presença de duas populações de células no nível de tensão intermédia (NaCl 0,1 M), com apenas uma fracção da população que expressa o repórter fluorescente. Nós usamos a microscopia para investigar mais este comportamento e descobriu que este ruído na expressão da proteína foi governada por fatores intrínsecos 9. Nós could observar, ainda, que as células com um nível semelhante de atividade Hog1 poderia exibir resultados muito diferentes de expressão. A combinação destas duas técnicas permitiram-nos demonstrar como a remodelação lenta dos genes de resposta ao stress influenciou a expressão resultados ao nível da célula individual 7. Neste trabalho, usamos a expressão da p STL1-qV repórter induzida pelo choque hiper-osmótico como um exemplo da quantificação da expressão da proteína por microscopia e citometria de fluxo. A mesma cepa submetidos a 0,2 M NaCl estresse foi estudado com ambas as técnicas. Isto irá permitir-nos para destacar algumas das principais diferenças nestas duas técnicas altamente complementares.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Reagente</td></tr><tr><td>Levedura Nitrogen Base</td><td>ForMedium</td><td>CYN6202</td><td></td></tr><tr><td>CSM amino-acid mix</td><td>ForMedium</td><td>DCS0011</td><td></td></tr><tr><td>Concanavalin A</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0450-01</td><td></td></tr><tr><td>Cicloheximida</td><td>Fluka Aldrich Sigma</td><td>C7698</td><td>Tóxico</td></tr><tr><td>ySP9</td><td></td><td></td><td>W303Mata leu2::LEU2-pSTL1-quádruploV enus</td></tr><tr><td>pSP34</td><td></td><td></td><td>pRS305 pSTL1 (-800 -0) - quádruplo V enus</td></tr><tr><td colspan="4">Material</td></tr><tr><td>Microscópio</td><td>Nikon</td><td>Ti-Eclipse</td><td></td></tr><tr><td>Software de controle de microscópio</td><td>Micro-manager</td><td>Ver 1.4.11</td><td></td></tr><tr><td>Câmara de incubação</td><td>LIS</td><td>The Box</td><td></td></tr><tr><td>Luz de fluorescência fonte</td><td>Lumencor</td><td>SpectraX</td><td></td></tr><tr><td>Câmera</td><td>Hamamatsu</td><td>Flash 4.0</td><td></td></tr><tr><td>Citômetro de fluxo</td><td>BD</td><td>FACS calibur</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator banho</td><td>Telesonic</td><td>TUC-150</td><td></td></tr><tr><td>8-well-slide </td><td>Thermo Lab-tek</td><td>155409</td><td></td></tr><tr><td>96-well-plate</td><td>Matrical bioscience</td><td>MGB096-1-2-LG</td><td></td></tr><tr><td>FACS tubo</td><td>BD Falcon</td><td>352054</td><td></td></tr></tbody></table>

a quantificação temporal da expressão mapk induzida em células de levedura solteiro

Temporal Quantification of MAPK Induced Expression in Single Yeast Cells

A quantificação da expressão gênica no nível da célula única descobre novos mecanismos de regulação obscurecidos em medições realizadas a nível da população. Dois métodos baseados em citometria de fluxo e microscopia são apresentados para demonstrar a forma como esses dados podem ser adquiridos. A expressão de um repórter fluorescente induzida após a activação da MAPK alta osmolaridade glicerol via em levedura é usada como um exemplo. As vantagens específicas de cada método são realçados. A citometria de fluxo mede um grande número de células (10.000) e proporciona uma medida direta da dinâmica da expressão proteica independente da cinética de maturação lenta da proteína fluorescente. Imagiologia de células vivas por microscopia por contraste é limitada para a medição da forma amadurecida do repórter no menor número de células. No entanto, os conjuntos de dados gerados por esta técnica pode ser extremamente ricos graças às combinações de vários jornalistas e à informação espacial e temporalobtido a partir de células individuais. A combinação destes dois métodos de medição pode oferecer novos insights sobre a regulação da expressão de proteínas por vias de sinalização.

Microscopia As células de levedura que ostentam a expressão repórter p-STL1 qV (ySP9 7) foram ligados ao fundo do poço de deslizamento e colocado sob o microscópio. As células foram estimuladas pela adição de meio de pressão directamente para dentro do poço, durante o decurso da sessão de imagem. Isso nos permite adquirir algumas imagens das células antes da indução da via e seguir o seu destino após a estimulação. No presente caso, as células foram seguidos durante ~ 2 hora...

Dois métodos complementares baseados em citometria de fluxo e microscopia são apresentadas, que permitem a quantificação, no nível de uma única célula, da dinâmica da expressão de genes induzidos pela activação de uma via de MAPK em levedura.

A quantificação temporal da expressão MAPK induzida em células de levedura Solteiro

The quantification of gene expression at the  single cell level uncovers novel regulatory mechanisms obscured in measurements  performed at the population ...

O objetivo geral do experimento a seguir é quantificar a expressão da proteína ativada por mitógeno ao nível de célula única. Para isso, foi gerada uma linhagem de levedura contendo o repórter fluorescente quadruplo Venus, controlado pelo promotor STL1 e específico para a ativação da quinase Hog1 da via MAPK. A expressão da proteína fluorescente pode ser quantificada por meio de um ensaio de microscopia em células vivas, no qual as células são submetidas a estresse diretamente no microscópio para facilitar o aparecimento em tempo real da fluorescência, ou por citometria de fluxo, caso em que as células são estressadas em um tubo microcêntrifugo e a síntese proteica é interrompida em um determinado momento.Com a adição de cicloheide, apenas algumas células por vez podem ser analisadas por microscopia de células vivas, mas o destino das células individuais pode ser diretamente observado e correlacionado com outras propriedades celulares. A citometria de fluxo, por outro lado, também permite a avaliação da expressão de proteínas ativadas por mitógeno em grande número de células simultaneamente. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de sinalização, como qua

temporal-quantification-mapk-induced-expression-single-yeast

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