A quantificação temporal da expressão MAPK induzida em células de levedura Solteiro

O objetivo geral do experimento a seguir é quantificar a expressão de proteínas ativadas por mitógenos no nível de uma única célula. Para isso, foi gerada uma cepa de levedura portadora da expressão fluorescente repórter quádruplo Vênus controlada pelo promotor STL one e específica para a ativação da map quinase hog one. A expressão de proteínas fluorescentes pode ser quantificada por um ensaio de microscopia de células vivas no qual as células são estressadas diretamente no microscópio para facilitar a aparição em tempo real da fluorescência ou por citometria de fluxo, caso em que as células são estressadas em um microtubo e a síntese de proteínas é bloqueada em um determinado momento.

Com a adição de cicloureto, apenas algumas células de cada vez podem ser analisadas com microscopia de células vivas, mas o destino das células individuais pode ser observado diretamente e correlacionado com outras propriedades celulares, a citometria de fluxo, por outro lado, também permite a avaliação da expressão de proteínas ativadas por mitógenos em um grande número de células de uma só vez. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da sinalização, como quais proteínas estão envolvidas na regulação da expressão gênica. Embora esse método possa fornecer informações sobre o caminho da levedura, ele também pode ser aplicado a outra cascata de sinalização, dependendo da disponibilidade da expressão adequada. Repórter.

Para preparar as células para a microscopia de células vivas, comece inoculando cinco mililitros de meio sintético com levedura e, em seguida, cultive as células a 30 graus Celsius durante a noite. Na manhã seguinte, medir a DO 600 da cultura durante a noite e, em seguida, diluir a cultura durante a noite em cinco mililitros de meio sintético até uma DO 600 de 0,05. Cultive a cultura diluída a 30 graus Celsius por pelo menos mais quatro horas.

Em seguida, filtre cerca de 200 microlitros de solução de conna valent recém-preparada na lâmina do poço. Após 30 minutos, retire a solução e adicione 150 microlitros de água ao poço. Agora retire a água e deixe o poço secar enquanto as células são preparadas.

Meça novamente o OD 600 da cultura celular e, em seguida, dilua as células para obter 300 microlitros de cultura celular a um OD 600 de 0,02 e um microtubo de 1,5 mililitro. Sonicar as células em banho-maria por 45 segundos. Um breve vórtice dos microtubos e, em seguida, sonice e vórtice as células novamente.

Agora adicione 200 microlitros das células à lâmina do poço e, depois de deixar a célula assentar no fundo do poço por cerca de 30 minutos, coloque a lâmina no microscópio. Em seguida, selecione as configurações de iluminação para o canal fluorescente a ser gravado e para duas imagens de campo claro, ajustando uma das configurações de campo brilhante aproximadamente três mícrons abaixo do plano focal para permitir a segmentação celular adequada. Em seguida, defina os intervalos de tempo para as medições de lapso de tempo e selecione os campos de visão para a imagem.

Agora inicie a aquisição por alguns quadros e, em seguida, pause a aquisição para adicionar 100 microlitros de meio de cloreto de sódio 0,6 molar recém-preparado e retome a imagem para preparar as células para medição por citometria de fluxo. Comece inoculando a levedura em cinco mililitros de meio sintético e cultive as células durante a noite a 30 graus Celsius. Na manhã seguinte, medir a DO 600 da cultura durante a noite e, em seguida, diluir a suspensão celular em cinco mililitros de meio sintético até uma DO 600 de 0,1.

Cultive a cultura por pelo menos quatro horas a 30 graus Celsius para atingir um OD 600 de 0,2 a 0,4. Em seguida, adicione 100 microlitros de cloreto de sódio 0,6 molar recém-preparado a um microtubo de 1,5 mililitro para cada ponto de tempo a ser medido no tempo zero. Adicione 200 microlitros de células a cada microtubo e incube as culturas com agitação a 30 graus Celsius.

Em seguida, em cada um dos pontos de tempo experimentais, adicione 30 microlitros de cicloheide recém-preparado a um dos microtubos. Enquanto os microtubos estão incubando, adicione 400 microlitros de PBS a um tubo de fax correspondente para cada microtubo. Após a incubação, vórtice brevemente os microtubos e, em seguida, sonice as células e adicione banho-maria por um minuto, como acabamos de demonstrar.

Em seguida, adicione 100 microlitros de cultura de células de cada microtubo ao seu tubo de fax correspondente no fluxo do citômetro. Carregue as configurações adequadas de excitação e detecção e teste as amostras que não expressam e expressam totalmente para verificar se elas se enquadram na faixa de sensibilidade do detector. Finalmente, meça 10.000 células para cada amostra nessas imagens, células de levedura com a expressão repórter proteína venosa quádrupla sob o controle do promotor TL um e presas ao fundo de uma lâmina de poço foram estimuladas por edição direta do meio de estresse.

Como acabamos de demonstrar, as células foram monitoradas por cerca de duas horas em intervalos de 10 minutos, e as imagens foram adquiridas antes e depois da edição do estímulo. Observe a expressão fluorescente do relatório durante as células ativadas. Para extrair as informações quantitativas contidas nessas imagens, um complexo processo de análise de imagens deve ser realizado aqui.

Os resultados obtidos com a plataforma de análise quantitativa de levedura são mostrados. Cada traço vermelho representa a evolução temporal da intensidade média de fluorescência de uma única célula. A linha azul ilustra a mediana de mais de 500 células que foram segmentadas e rastreadas ao longo de 20 quadros de cinco filmes de lapso de tempo adquiridos de cinco campos de visão diferentes do mesmo poço, a área azul clara representa o percentil 25 e 75 de todas as intensidades medidas em um determinado momento para estudar a dinâmica da expressão do mesmo repórter por citometria de fluxo A cicloheximida foi adicionada à levedura culturas de células em diferentes pontos de tempo em intervalos de cinco a 10 minutos.

A droga bloqueia a síntese de novas proteínas, mas a maturação da proteína fluorescente já expressa não é perturbada. Portanto, a expressão proteica visualizada pelo deslocamento do histograma para a direita pode ser quantificada no momento da edição do Ciclo H, contornando os problemas associados à maturação da proteína fluorescente. Neste gráfico, a dinâmica do repórter de expressão medida por microscopia ou citometria de fluxo é comparada enquanto o sinal fluorescente aumenta 30 a 40 minutos após a edição do meio de estresse medido pela microscopia, as medições de citometria de fluxo indicam claramente que as proteínas já são produzidas entre 10 a 15 minutos após o estímulo demonstrando a lenta maturação das proteínas fluorescentes.

Ambas as técnicas permitem o acesso a informações de células únicas para esses experimentos simples, a variabilidade entre três réplicas biológicas é pequena em comparação com a grande variabilidade observada nas respostas de células únicas por microscopia ou citometria de fluxo. Seguindo esses procedimentos, outros métodos, como essas medições de resposta, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como qual é o limite para a expressão gênica. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como medir a expressão de proteínas em nível de célula única com microscópio de citometria de fluxo.