A quantificação temporal da expressão MAPK induzida em células de levedura Solteiro

O objetivo geral do experimento a seguir é quantificar a expressão da proteína ativada por mitógeno ao nível de célula única. Para isso, foi gerada uma linhagem de levedura contendo o repórter fluorescente quadruplo Venus, controlado pelo promotor STL1 e específico para a ativação da quinase Hog1 da via MAPK. A expressão da proteína fluorescente pode ser quantificada por meio de um ensaio de microscopia em células vivas, no qual as células são submetidas a estresse diretamente no microscópio para facilitar o aparecimento em tempo real da fluorescência, ou por citometria de fluxo, caso em que as células são estressadas em um tubo microcêntrifugo e a síntese proteica é interrompida em um determinado momento.

Com a adição de cicloheide, apenas algumas células por vez podem ser analisadas por microscopia de células vivas, mas o destino das células individuais pode ser diretamente observado e correlacionado com outras propriedades celulares. A citometria de fluxo, por outro lado, também permite a avaliação da expressão de proteínas ativadas por mitógeno em grande número de células simultaneamente. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de sinalização, como quais proteínas estão envolvidas na regulação da expressão gênica. Embora este método possa fornecer informações sobre a via de levedura, ele também pode ser aplicado a outras cascatas de sinalização, dependendo da disponibilidade do repórter de expressão adequado.

Para preparar as células para microscopia de células vivas, comece inoculando cinco mililitros de meio sintético com levedura e então cultive as células a 30 graus Celsius durante a noite. Na manhã seguinte, meça a DO 600 da cultura noturna e dilua a cultura em cinco mililitros de meio sintético até uma DO 600 de 0,05. Cultive a cultura diluída a 30 graus Celsius por pelo menos mais quatro horas.

Em seguida, filtre cerca de 200 microlitros de uma solução de con A recém-preparada para dentro do poço da lâmina. Após 30 minutos, remova a solução de con A e adicione 150 microlitros de água ao poço. Agora, remova a água e deixe o poço secar enquanto as células são preparadas.

Meça novamente a DO a 600 nm da cultura celular e, em seguida, dilua as células para obter 300 microlitros de cultura celular com uma DO a 600 nm de 0,02 em um tubo microcêntrifugo de 1,5 mililitro. Sonique as células em banho-maria por 45 segundos. Vortexe brevemente os tubos microcêntrifugos e, em seguida, sonique e vortexe as células novamente.

Agora, adicione 200 microlitros das células à lamínula, e após deixar as células sedimentarem no fundo do poço por cerca de 30 minutos, coloque a lamínula no microscópio. Em seguida, selecione as configurações de iluminação para o canal fluorescente a ser registrado e para duas imagens de campo claro, ajustando uma das configurações de campo claro aproximadamente três micrômetros abaixo do plano focal para permitir uma segmentação celular adequada. Depois, defina os intervalos de tempo para as medidas de lapso de tempo e selecione os campos de visão para a aquisição de imagens.

Agora, inicie a aquisição por algumas quadros e, em seguida, pause a aquisição para adicionar 100 microlitros de meio recém-preparado de cloreto de sódio 0,6 molar e retome a aquisição de imagens para preparar as células para medição por citometria de fluxo. Comece inoculando a levedura em cinco mililitros de meio sintético e cultive as células durante a noite a 30 graus Celsius. Na manhã seguinte, meça a DO 600 da cultura de crescimento noturno e, em seguida, dilua a suspensão celular em cinco mililitros de meio sintético até uma DO 600 de 0,1.

Cultive a cultura por pelo menos quatro horas a 30 graus Celsius para atingir uma DO 600 de 0,2 a 0,4. Em seguida, adicione 100 microlitros de cloreto de sódio 0,6 molar recém-preparado a um tubo microcentrífuga de 1,5 mililitro para cada ponto temporal a ser medido no tempo zero. Adicione 200 microlitros de células a cada tubo microcentrífuga e incube as culturas sob agitação a 30 graus Celsius.

Em seguida, em cada um dos pontos experimentais de tempo, adicione 30 microlitros de ciclo-heide recém-preparado a um dos tubos micro. Enquanto os tubos micro estão em incubação, adicione 400 microlitros de PBS a um tubo fax correspondente para cada tubo micro. Após a incubação, vortexe brevemente os tubos micro e, em seguida, sonique as células e adicione banho de água por um minuto, conforme acabou de ser demonstrado.

Em seguida, adicione 100 microlitros de cultura celular de cada microtubo ao tubo FACS correspondente no citômetro de fluxo. Carregue as configurações adequadas de excitação e detecção e teste as amostras não expressantes e totalmente expressantes para verificar se estão dentro da faixa de sensibilidade do detector. Por fim, meça 10.000 células para cada amostra nestas imagens, células de levedura portando o repórter de expressão da proteína verde quadrupla sob o controle do promotor TL1 e aderidas ao fundo de uma lâmina de poço foram estimuladas pela adição direta do meio de estresse.

Como acabou de ser demonstrado, as células foram monitoradas por cerca de duas horas em intervalos de 10 minutos, e imagens foram adquiridas tanto antes quanto depois da edição do estímulo. Observe a expressão fluorescente do repórter nas células ativadas. Para extrair as informações quantitativas contidas nessas imagens, um processo complexo de análise de imagem deve ser realizado aqui.

Os resultados obtidos com a plataforma de análise quantitativa de levedura são apresentados. Cada traço vermelho representa a evolução temporal da intensidade média de fluorescência de uma única célula. A linha azul ilustra a mediana de mais de 500 células que foram segmentadas e rastreadas ao longo de 20 quadros de cinco filmes de microscopia de tempo real adquiridos de cinco campos de visão diferentes do mesmo poço; a área azul claro representa o 25º e o 75º percentil de todas as intensidades medidas em um determinado ponto temporal. Para estudar a dinâmica da expressão do mesmo repórter por citometria de fluxo, cicloheximida foi adicionada aos cultivos de células de levedura em diferentes pontos temporais, em intervalos de cinco a dez minutos.

O fármaco bloqueia a síntese de novas proteínas, mas a maturação da proteína fluorescente já expressa não é perturbada. Assim, a expressão proteica visualizada pelo deslocamento do histograma para a direita pode ser quantificada no momento da edição de Cycl H, contornando os problemas associados à maturação da proteína fluorescente. Neste gráfico, as dinâmicas do repórter de expressão, medidas por microscopia ou citometria de fluxo, são comparadas enquanto o sinal fluorescente aumenta entre 30 e 40 minutos após a troca do meio de estresse, conforme medido pela microscopia; as medições de citometria de fluxo indicam claramente que as proteínas já estão sendo produzidas entre 10 e 15 minutos após o estímulo, demonstrando a lenta maturação das proteínas fluorescentes.

Ambas as técnicas permitem o acesso a informações de célula única para esses experimentos simples, sendo a variabilidade entre três repetições biológicas pequena em comparação com a grande variabilidade observada nas respostas de célula única por microscopia ou citometria de fluxo. Após seguir estes procedimentos, outros métodos, como essas medições de resposta, podem ser realizados para responder perguntas adicionais, tais como, qual é o limiar para a expressão gênica. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como medir a expressão proteica no nível de célula única por microscópio ou citometria de fluxo.