Isolamento de células endoteliais progenitoras de voluntários saudáveis ​​e seu potencial migratório influenciada por amostras de soro após cirurgia cardíaca

As células progenitoras endoteliais (CPE) são crucialmente envolvidas na neovascularização de tecidos isquémicos. Este método descreve o isolamento de EPCs humanos a partir de sangue periférico, bem como a identificação do seu potencial migratório contra amostras de soro de pacientes de cirurgia cardíaca.

O objetivo geral deste procedimento de isolamento celular e protocolo de migração é mostrar uma maneira confiável de isolar células progenitoras endoteliais e seu potencial migratório para amostras de soro de pacientes cirúrgicos cardíacos. Este método pode ajudar a responder a questões-chave na regeneração do revestimento endotelial e dos vasos sanguíneos, que é necessária após a cirurgia cardíaca devido a lesões relacionadas à isquemia e reperfusão. A principal vantagem desta técnica é a forma relativamente simples de isolar as células progenitoras, incluindo o pré-isolamento das células CD-34 positivas.

Além das mortes, as principais complicações da cirurgia cardíaca permanecem muito comuns. Sublinhando a necessidade de identificar o risco de amarração e os mecanismos de proteção durante a cirurgia cardíaca. As células progenitoras endoteliais estão crucialmente envolvidas na neovascularização dos tecidos isquêmicos e são conhecidas por fornecer propriedades cardioprotetoras.

Para iniciar o experimento, misture sangue, um a um, com PBS sem cálcio e sem magnésio. Adicione 15 mililitros de solução de gradiente de densidade a um tubo de 50 mililitros. E coloque lentamente o sangue diluído em cima da solução de gradiente de densidade.

Em seguida, centrifugue as amostras. Usando uma pipeta de plástico estéril, colete cuidadosamente a camada de revestimento leucocitário de cada tubo e coloque-a em outro tubo, evitando a solução de gradiente de densidade. Diluir a célula mononuclear do sangue periférico, ou fração PBMC, com pelo menos três volumes de PBS e misturar a solução por pipetagem.

Centrifugue a mistura à temperatura ambiente por 15 minutos a 200 vezes G. Em seguida, aspire o sobrenadante e ressuspenda o pellet celular em cinco mililitros de meio de crescimento de células endoteliais, MV-2. Depois de ressuspender as células, adicione 100 microlitros de anticorpo humano CD-34 por camada buffy usada e gire as células. Adicione 50 microlitros de esferas magnéticas revestidas com Dextrano por buffy coat usado e gire as células.

Após a incubação, transfira a suspensão para tubos de fax com no máximo três mililitros para cada tubo. Em seguida, insira os tubos de fax nos ímãs e aguarde cinco minutos. Descarte o sobrenadante sem puxar os tubos de fax para fora do ímã.

Em seguida, fora dos ímãs, ressuspenda as células em cada tubo de fax com três mililitros de meio MV-2. Transferir a suspensão celular para balões T-75 pré-revestidos. Adicionar 17 mililitros de meio MV-2 a cada balão.

Para preparar o ensaio de migração, use uma pipeta para remover o meio das células progenitoras endoteliais ou das EPCs, no frasco T-75. Lave as células com cinco mililitros de solução salina tamponada com fosfato ou PBS e agite cuidadosamente o frasco. Em seguida, remova o PBS e adicione cinco mililitros de solução comercial de descolamento de células.

Em seguida, espere até que as células sejam destacadas sob um microscópio óptico. Acelerar o desprendimento batendo cuidadosamente no fundo do balão. Quando as células estiverem separadas, adicione rapidamente cinco mililitros de meio completo MV-2 e transfira a suspensão celular para outro tubo.

Centrifugar as células a 2 000 x G durante cinco minutos. Depois de peletizar as células, ressuspenda-as em cinco a dez mililitros de PBS. E centrifugue-os novamente.

Ressuspenda as células em cinco a dez mililitros de PBS novamente e siga com a centrifugação. Ressuspenda o pellet celular em meio de privação de MV-2. Em seguida, dilua a amostra de soro de um a cinco em meio sem MV-2.

Prepare a placa de migração adicionando 235 microlitros da amostra de soro na câmara inferior. Adicione o inserto pouco antes de adicionar a solução celular. Em seguida, adicione 75 microlitros da solução celular na câmara superior.

Permita que os EPCs migrem. Remova a câmara superior contendo todas as células não migradas. Adicione 75 microlitros de solução de paraformaldeído a 3,6%, incluindo corante hoechst diluído em um a 1.000.

Centrifugar a placa rapidamente para colocar todas as células no mesmo plano focal a 2 000 x G durante um a dois minutos. Para evitar artefatos de autofluorescência sérica, quantifique as células migradas tirando cinco fotos por poço com ampliação de 100x ao microscópio. Por fim, conte as células migradas usando o software semiautomatizado.

A análise por fax das CPE verifica a captação de acLDL, bem como a expressão de CD-31 na superfície da população celular isolada. Isolando a análise de acLDL e CD-31 revela uma distribuição homogênea de cada marcador. Elyso para identificar a influência da cirurgia cardíaca após lesão de reperfusão miocárdica nas concentrações dos níveis séricos circulantes de MIF, CXCL12, CXCL8 e VEGF.

Amostras de soro foram coletadas no pré e intraoperatório. Os níveis séricos de MIF, CXCL12 e CXCL8 mostraram um aumento intraoperatório significativo em comparação com os valores basais. Em contraste, as concentrações de VEGF não mostraram alterações significativas.

Um ensaio de migração ex vivo, usando amostras de soro coletadas antes e durante a cirurgia, foi realizado usando CPE isoladas de voluntários saudáveis e revelou uma taxa de migração significativamente aumentada em direção às amostras coletadas no intraoperatório. Seguindo esta técnica, as células mononucleares do sangue periférico podem ser facilmente isoladas, a fim de responder a perguntas inflamatórias adicionais.