Name: Isolamento de células endoteliais progenitoras de voluntários saudáveis e seu potencial migratório influenciada por amostras de soro após cirurgia cardíaca (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 43 s
Description: Aprenda a isolar células endoteliais progenitoras do sangue periférico humano e avaliar seu potencial migratório em resposta a amostras de soro de pacientes cardíacos. Este método permite estudar a neovascularização após eventos isquêmicos.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Os autores não têm confirmações.

Sangue para o isolamento de EPCs foi obtido de voluntários saudáveis ​​após consentimento informado, de acordo com o comitê de ética local. As amostras de soro usados ​​nos ensaios de migração foram obtidas de pacientes submetidos à cirurgia cardíaca convencional com o uso de circulação extracorpórea (CEC). Os critérios de exclusão foram operações de emergência, gravidez conhecida ou suspeita, do doente idade inferior a 18 anos, e falha na obtenção de consentimento informado. As amostras de soro foram desenhados para além das medições de rotina clínica (imediatamente antes da cirurgia e imediatamente após a reperfusão do miocárdio / abertura de aorta de pinçamento) e subsequentemente armazenado a -80 ° C até análise final. O (Comissão de Ética, RWTH Aachen University) de revisão institucional aprovou este estudo. Os pacientes apresentaram média de idade de 68,6 anos e um peso médio de 81,7 kg. doenças pré-existentes foram: hipertensão (65%), doença pulmonar crônica (19%), arteriopatia cardíaca extra (16%), disfunção cerebral (6%), angina instável (3%), enfarte do miocárdio recente (28% dentro de 90 d), doença renal crónica (14%), doença do fígado (2%) e a diabetes (34%). 1. Revestimento da garrafa T75: <ol><li> Prepare 5 mL de solução de fibronectina (1 mg de fibronectina humana diluída em 15 ml de água ultrapura) por frasco T75. </li><li> Adicionar a solução para um frasco T75 e esperar até que a água é evaporada. Para evitar quaisquer interrupções desnecessárias durante o processo de isolamento devido à evaporação, efectuar este processo previamente (por exemplo durante a noite) e à temperatura ambiente. Esta solução dá 4,44 g de fibronectina / cm 2. </li><li> Prepara-se o meio de crescimento celular endotelial MV2, completando a forma MV2 basal com suplementos de factor de crescimento fornecidos pelo fabricante. </li></ol> 2. Isolamento de células progenitoras endoteliais (CPE) a partir de 60 mL de sangue: NOTA: Como o CD34 positivo selecção de cocktails umND as esferas magnéticas estão comercialmente disponíveis em um kit de selecção combinado, não há concentrações fornecidas pelo fabricante. No entanto, cerca de 100 ul do anticorpo são suficientes para o processamento de até 5 x 10 8 células. As pérolas magnéticas são diluídos em água, o dextrano-revestido e cerca 5,000x menor em comparação com outros grânulos disponíveis comercialmente. Para mais informações, consulte instruções do fabricante. <ol><li> Misture sangue (com ou sem anticoagulantes) 1: 1 com Ca 2+ Mg 2 + livre de PBS. </li><li> Adicionar 15 ml de solução de gradiente de densidade por tubo de 50 mL. Para mais informações, consulte instruções do fabricante. </li><li> Lentamente camada do sangue diluído em cima da solução de gradiente de densidade. </li><li> Centrifugar as amostras a 2500 xg durante 30 minutos com a aceleração lenta e sem travagem. </li><li> Recolher cuidadosamente a camada de creme leucocitário de cada tubo (Figura 1) usando uma pipeta de plástico estéril e colocá-lo em outro tubo.Evitar a recolha da solução de gradiente de densidade. O rendimento esperado PBMC é de aproximadamente 3-4 x 10 6 células / ml de sangue. </li></ol><img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/55192/55192fig1.jpg" /> Figura 1: Densidade centrifugação em gradiente de Revestimento na Ficoll Solution Bbuffy. É mostrado o resultado da centrifugação em gradiente de densidade a 2500 xg durante 30 minutos na solução de gradiente de densidade. Descrito são os eritrócitos e granulócitos (vermelho), a fracção de células mononucleares (camada branca), plasma (amarela), e a solução do gradiente de densidade (esbranquiçado). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55192/55192fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <ol start="6"><li> Dilui-se a fracção de células mononucleares de sangue periférico com pelo menos 3 volumes de PBS e misturar. Centrifuga-se a temperatura ambiente durante 15 min a 200 x g. </li><li> Repita o passo 2.6 duas vezes. &lt;/ Li&gt; <li> Aspirar o sedimento celular sobrenadante e ressuspender em 5 mL de meio MV2. </li><li> Adicionar 100 uL de anticorpo CD34 humano (suficiente para o processamento até 5 x 10 8 células) por buffy coat utilizado e girar durante 15 min a 37 ° C com 5% de CO 2. </li><li> Adicionar 50 uL de pérolas magnéticas revestidas com dextrano por buffy coat utilizado e girar durante 10 min a 37 ° C com 5% de CO 2. </li><li> Após a incubação, transferir a suspensão para tubos de FACS com um máximo de 3 mL em cada tubo. quantidades superiores não será permitida com o imã. </li><li> Insira tubo (s) FACS para o ímã (s) e esperar por 5 min. </li><li> Elimine o sobrenadante sem puxar os tubos de FACS fora do ímã. </li><li> Ressuspender as células em cada tubo de FACS com 3 mL de meio MV2 fora do magneto. </li><li> Repita os passos 2,12-2,14 duas vezes. </li><li> Puxe os tubos FACS fora dos ímãs e ressuspender as células em 3 mL de meio MV2. </li><li> Transferir a suspensão de células em pré-revestido T75 flasks e adicionar 17 mL de meio MV2 por frasco. NOTA: O meio deve ser mudado após 3 dias. Após uma semana, as células mostram estruturas fusiformes (Figura 2) e está pronto para usar. Para uma negligência do isolamento ver Figura 3. </li></ol><img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/55192/55192fig2.jpg" /> Figura 2: Imagem microscópica de isolado EPCs. É mostrada uma imagem representativa de isolado early-EPCs em um frasco T75 antes do destacamento. Aparente é a estrutura fusiforme do EPCs. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55192/55192fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/55192/55192fig3.jpg" /> Figura 3: Fluxograma Mostrando o Procedimento de EPC isolamento. Retratado é um esquema, mostraing os passos individuais do protocolo de isolamento EPC. Para um protocolo mais detalhado ver Secção 2 na seção de protocolo. 3. Migration Assay <ol><li> Remover o meio das CPE no frasco T75. </li><li> Lavar com 5 ml PBS, agitando-o com cuidado. </li><li> Remover PBS e adicionar 5 ml de solução de separação celular comercial. Espere até que as células são separadas (verifique sob um microscópio). Acelerar o destacamento tocando cuidadosamente o fundo do frasco. </li><li> Quando as células são separadas, adicionar rapidamente MV2 5 ml de meio completo e transferir a suspensão de células para outro tubo. </li><li> Centrifugar a 2.000 xg durante 5 min. </li><li> Ressuspender as células em 5-10 ml de PBS e centrifugar novamente a 2.000 xg durante 5 min. </li><li> Repita o passo 3.6. </li><li> Ressuspender o sedimento de células em meio de fome MV2 (50.000 células são necessários em 75 uL por poço transmigração). NOTA: Qual sistema de migração é necessária depende do tipo de célula e ensaio. Existem diff<html> diâmetros erent poros e tamanhos de placa (número de poços). Para EPCs um tamanho de poro de 5 um de 96 sistema assim é óptima. </li><li> Preparar a placa de migração através da adição de 235 ul da amostra de soro (soro diluído a 1: 5 em meio de fome MV2) para dentro da câmara inferior (Figura 4). </li></ol><img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/55192/55192fig4.jpg" /> Figura 4: Ensaio de migração de uma câmara de Boyden modificada. É mostrada a concepção geral de uma câmara de Boyden modificada. As inserções de cultura de células (= câmara superior) estão indicados a azul escuro e são inseridos dentro da câmara inferior. A parte inferior (mas não as paredes) destas inserções representa o sistema de filtro incluindo os poros. (A) mostra a configuração no ponto de tempo zero. (B) depois de um ponto de tempo escolhido, as células são migraram através do filtro para um estímulo.fig4large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. <ol start="10"><li> Adicionar a pastilha pouco antes de adicionar a solução de células. </li><li> Adicionar 75 ul da solução de células (células = 50.000) para dentro da câmara superior. </li><li> Deixe o EPCs migrar durante 3 h a 37 ° C e 5% de CO 2 (tempo de migração depende do tipo de célula e o sistema). <ol><li> Para evitar artefactos auto-fluorescência do soro, quantificar as células migraram por tirar fotos do bem sob um microscópio e contar as células utilizando o software semi-automático &quot;ImageJ&quot;. </li></ol></li><li> Retire a câmara superior (contendo todas as células não migrados). </li><li> Adicionar 70 ul solução de paraformaldeído a 3,6%, incluindo de corante Hoechst (diluído 1: 1000). A placa pode ser armazenada a 37 ° C e 5% de CO 2 durante a noite. </li><li> Centrifugar a placa em breve para obter todas as células em um mesmo plano focal a 2.000 xg por 1-2 min. </li><li> Take 5 imagens por well (Figuras 5 e 6) com uma ampliação de 100x. </li></ol><img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/55192/55192fig5.jpg" /> Figura 5: Esquema mostrando a posição das fotos tiradas. O esquema ilustra a posição das cinco fotografias tiradas, os quais são necessários para a determinação das células que migraram, em relação ao poço. As fotos são tiradas para contar as células e calcular um valor médio para cada poço. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55192/55192fig5large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/55192/55192fig6.jpg" /> Figura 6: Imagem microscópica para a quantificação celular. É mostrada uma imagem representativa, que foi feita para quantificação celular. As células foram coradas e fixadas USIng de corante Hoechst, em 3,6% de paraformaldeído. Os pontos representam fixadas e coradas células progenitoras endoteliais. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55192/55192fig6large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <ol start="17"><li> Contar as células que migraram, utilizando o software semi-automático &quot;ImageJ&quot; pelo Instituto Nacional de Saúde. </li></ol>

<ol><li>Emontzpohl, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Key+role+of+MIF+in+the+migration+of+endothelial+progenitor+cells+in+patients+during+cardiac+surgery%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Key role of MIF in the migration of endothelial progenitor cells in patients during cardiac surgery.</a> Int J Cardiol. 181C, 284-287 (2014).</li>
<li>Smadja, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin+8+is+differently+expressed+and+modulated+by+PAR-1+activation+in+early+and+late+endothelial+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Interleukin 8 is differently expressed and modulated by PAR-1 activation in early and late endothelial progenitor cells.</a> J Cell Mol Med. 13 (8B), 2534-2546 (2009).</li>
<li>Asahara, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+putative+progenitor+endothelial+cells+for+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogenesis.</a> Science. 275 (5302), 964-967 (1997).</li>
<li>Simons, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia-induced+endothelial+secretion+of+macrophage+migration+inhibitory+factor+and+role+in+endothelial+progenitor+cell+recruitment%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Hypoxia-induced endothelial secretion of macrophage migration inhibitory factor and role in endothelial progenitor cell recruitment.</a> J Cell Mol Med. 15 (3), 668-678 (2011).</li>
<li>Dernbach, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antioxidative+stress-associated+genes+in+circulating+progenitor+cells%3A+evidence+for+enhanced+resistance+against+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Antioxidative stress-associated genes in circulating progenitor cells: evidence for enhanced resistance against oxidative stress.</a> Blood. 104 (12), 3591-3597 (2004).</li>
<li>Yang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paracrine+factors+secreted+by+endothelial+progenitor+cells+prevent+oxidative+stress-induced+apoptosis+of+mature+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Atherosclerosis%22%5BJournal%5D)">Paracrine factors secreted by endothelial progenitor cells prevent oxidative stress-induced apoptosis of mature endothelial cells.</a> Atherosclerosis. 211 (1), 103-109 (2010).</li>
<li>Asahara, T., Kawamoto, A., Masuda, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concise+review%3A+Circulating+endothelial+progenitor+cells+for+vascular+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Concise review: Circulating endothelial progenitor cells for vascular medicine.</a> Stem Cells. 29 (11), 1650-1655 (2011).</li>
<li>Schmidt-Lucke, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+number+of+circulating+endothelial+progenitor+cells+predicts+future+cardiovascular+events%3A+proof+of+concept+for+the+clinical+importance+of+endogenous+vascular+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Reduced number of circulating endothelial progenitor cells predicts future cardiovascular events: proof of concept for the clinical importance of endogenous vascular repair.</a> Circulation. 111 (22), 2981-2987 (2005).</li>
<li>Yoder, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+endothelial+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Med%22%5BJournal%5D)">Human endothelial progenitor cells.</a> Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (7), a006692(2012).</li>
<li>Ito, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+progenitor+cells+as+putative+targets+for+angiostatin%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Endothelial progenitor cells as putative targets for angiostatin.</a> Cancer Res. 59 (23), 5875-5877 (1999).</li>
<li>Hill, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+endothelial+progenitor+cells%2C+vascular+function%2C+and+cardiovascular+risk%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Circulating endothelial progenitor cells, vascular function, and cardiovascular risk.</a> N Engl J Med. 348 (7), 593-600 (2003).</li>
<li>Yoder, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redefining+endothelial+progenitor+cells+via+clonal+analysis+and+hematopoietic+stem%2Fprogenitor+cell+principals%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Redefining endothelial progenitor cells via clonal analysis and hematopoietic stem/progenitor cell principals.</a> Blood. 109 (5), 1801-1809 (2007).</li>
<li>Rohde, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+monocytes+mimic+endothelial+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Blood monocytes mimic endothelial progenitor cells.</a> Stem Cells. 24 (2), 357-367 (2006).</li>
<li>Rohde, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+cells+mimic+the+morphology+of+endothelial+progenitor+colonies+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Immune cells mimic the morphology of endothelial progenitor colonies in vitro.</a> Stem Cells. 25 (7), 1746-1752 (2007).</li>
<li>Prokopi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+analysis+reveals+presence+of+platelet+microparticles+in+endothelial+progenitor+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Proteomic analysis reveals presence of platelet microparticles in endothelial progenitor cell cultures.</a> Blood. 114 (3), 723-732 (2009).</li>
<li>Voyta, J. C., Via, D. P., Butterfield, C. E., Zetter, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+isolation+of+endothelial+cells+based+on+their+increased+uptake+of+acetylated-low+density+lipoprotein%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Identification and isolation of endothelial cells based on their increased uptake of acetylated-low density lipoprotein.</a> J Cell Biol. 99 (6), 2034-2040 (1984).</li>
<li>Koch, S., Claesson-Welsh, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+transduction+by+vascular+endothelial+growth+factor+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Med%22%5BJournal%5D)">Signal transduction by vascular endothelial growth factor receptors.</a> Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (7), a006502(2012).</li>
<li>Hirschi, K. K., Ingram, D. A., Yoder, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+identity%2C+phenotype%2C+and+fate+of+endothelial+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Assessing identity, phenotype, and fate of endothelial progenitor cells.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 28 (9), 1584-1595 (2008).</li>
<li>Hur, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+two+types+of+endothelial+progenitor+cells+and+their+different+contributions+to+neovasculogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Characterization of two types of endothelial progenitor cells and their different contributions to neovasculogenesis.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 24 (2), 288-293 (2004).</li>
<li>Tagawa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+Early+and+Late+Endothelial+Progenitor+Cells+in+Peripheral+Circulation+and+Their+Clinical++Association+with+Coronary+Artery+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Vasc+Med%22%5BJournal%5D)">Determination of Early and Late Endothelial Progenitor Cells in Peripheral Circulation and Their Clinical Association with Coronary Artery Disease.</a> Int J Vasc Med. , 2015(2015).</li>
<li>Bernhagen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MIF+is+a+noncognate+ligand+of+CXC+chemokine+receptors+in+inflammatory+and+atherogenic+cell+recruitment%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">MIF is a noncognate ligand of CXC chemokine receptors in inflammatory and atherogenic cell recruitment.</a> Nat Med. 13 (5), 587-596 (2007).</li>
<li>Stoppe, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+MIF+Family+Proteins+in+Myocardial+Ischemia%2FReperfusion+Damage+and+Their+Influence+on+Clinical+Outcome+of+Cardiac+Surgery+Patients%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxid+Redox+Signal%22%5BJournal%5D)">Interaction of MIF Family Proteins in Myocardial Ischemia/Reperfusion Damage and Their Influence on Clinical Outcome of Cardiac Surgery Patients.</a> Antioxid Redox Signal. 23 (11), 865-879 (2015).</li>
<li>Kanzler, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+roles+of+angiogenic+chemokines+in+endothelial+progenitor+cell-induced+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Basic+Res+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Differential roles of angiogenic chemokines in endothelial progenitor cell-induced angiogenesis.</a> Basic Res Cardiol. 108 (1), 310(2013).</li>
<li>Walenta, K. L., Bettink, S., Bohm, M., Friedrich, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+chemokine+receptor+expression+regulates+functional+specialization+of+endothelial+progenitor+cell+subpopulations%5BTitle%5D)+AND+%22Basic+Res+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Differential chemokine receptor expression regulates functional specialization of endothelial progenitor cell subpopulations.</a> Basic Res Cardiol. 106 (2), 299-305 (2011).</li>
<li>Rassaf, T., Weber, C., Bernhagen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+migration+inhibitory+factor+in+myocardial+ischaemia%2Freperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Res%22%5BJournal%5D)">Macrophage migration inhibitory factor in myocardial ischaemia/reperfusion injury.</a> Cardiovasc Res. 102 (2), 321-328 (2014).</li>
<li>Stoppe, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+postoperative+blood+levels+of+macrophage+migration+inhibitory+factor+are+associated+with+less+organ+dysfunction+in+patients+after+cardiac+surgery%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Med%22%5BJournal%5D)">High postoperative blood levels of macrophage migration inhibitory factor are associated with less organ dysfunction in patients after cardiac surgery.</a> Mol Med. 18, 843-850 (2012).</li>
<li>Amin, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Migration+inhibitory+factor+mediates+angiogenesis+via+mitogen-activated+protein+kinase+and+phosphatidylinositol+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Migration inhibitory factor mediates angiogenesis via mitogen-activated protein kinase and phosphatidylinositol kinase.</a> Circ Res. 93 (4), 321-329 (2003).</li>
<li>Kupatt, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+endothelial+progenitor+cells+expressing+a+broad+range+of+proangiogenic+and+remodeling+factors+enhance+vascularization+and+tissue+recovery+in+acute+and+chronic+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Embryonic endothelial progenitor cells expressing a broad range of proangiogenic and remodeling factors enhance vascularization and tissue recovery in acute and chronic ischemia.</a> FASEB J. 19 (11), 1576-1578 (2005).</li>
<li>Colotta, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+a+monocyte+chemotactic+cytokine+by+human+mononuclear+phagocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Expression of a monocyte chemotactic cytokine by human mononuclear phagocytes.</a> J Immunol. 148 (3), 760-765 (1992).</li>
<li>Casale, T. B., Kaliner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+method+for+isolation+of+human+mononuclear+cells+free+of+significant+platelet+contamination%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">A rapid method for isolation of human mononuclear cells free of significant platelet contamination.</a> J Immunol Methods. 55 (3), 347-353 (1982).</li>
<li>Lewandowska, K., Kaplan, D., Husel, W. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12745450">CD34 expression on platelets.</a> Platelets. 14 (2), 83-87 (2003).</li>
<li>Stellos, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet-derived+stromal+cell-derived+factor-1+regulates+adhesion+and+promotes+differentiation+of+human+CD34%2B+cells+to+endothelial+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Platelet-derived stromal cell-derived factor-1 regulates adhesion and promotes differentiation of human CD34+ cells to endothelial progenitor cells.</a> Circulation. 117 (2), 206-215 (2008).</li>
<li>Thornton, M. A., Poncz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+expansion+of+megakaryocytes+from+peripheral+blood+hematopoietic+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">In vitro expansion of megakaryocytes from peripheral blood hematopoietic progenitors.</a> Methods Mol Med. 31, 337-345 (1999).</li>
<li>Ivetic, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Producing+megakaryocytes+from+a+human+peripheral+blood+source%5BTitle%5D)+AND+%22Transfusion%22%5BJournal%5D)">Producing megakaryocytes from a human peripheral blood source.</a> Transfusion. 56 (5), 1066-1074 (2016).</li>
<li>Friedrich, E. B., Walenta, K., Scharlau, J., Nickenig, G., Werner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD34-%2FCD133%2B%2FVEGFR-2%2B+endothelial+progenitor+cell+subpopulation+with+potent+vasoregenerative+capacities%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">CD34-/CD133+/VEGFR-2+ endothelial progenitor cell subpopulation with potent vasoregenerative capacities.</a> Circ Res. 98 (3), e20-e25 (2006).</li>
<li>Wijelath, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+vascular+endothelial+growth+factor+binding+domains+of+fibronectin+enhance+vascular+endothelial+growth+factor+biological+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Novel vascular endothelial growth factor binding domains of fibronectin enhance vascular endothelial growth factor biological activity.</a> Circ Res. 91 (1), 25-31 (2002).</li>
<li>Hulkower, K. I., Herber, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+migration+and+invasion+assays+as+tools+for+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Cell migration and invasion assays as tools for drug discovery.</a> Pharmaceutics. 3 (1), 107-124 (2011).</li>
<li>Yao, E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+the+antioxidative+beta-blocker+celiprolol+on+endothelial+progenitor+cells+in+hypertensive+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hypertens%22%5BJournal%5D)">Effects of the antioxidative beta-blocker celiprolol on endothelial progenitor cells in hypertensive rats.</a> Am J Hypertens. 21 (9), 1062-1068 (2008).</li>
<li>Takahashi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ischemia-+and+cytokine-induced+mobilization+of+bone+marrow-derived+endothelial+progenitor+cells+for+neovascularization%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Ischemia- and cytokine-induced mobilization of bone marrow-derived endothelial progenitor cells for neovascularization.</a> Nat Med. 5 (4), 434-438 (1999).</li>
<li>Kawamoto, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+potential+of+ex+vivo+expanded+endothelial+progenitor+cells+for+myocardial+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Therapeutic potential of ex vivo expanded endothelial progenitor cells for myocardial ischemia.</a> Circulation. 103 (5), 634-637 (2001).</li>
<li>Kim, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myocardial+Ischemia+Induces+SDF-1alpha+Release+in+Cardiac+Surgery+Patients%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cardiovasc+Transl+Res%22%5BJournal%5D)">Myocardial Ischemia Induces SDF-1alpha Release in Cardiac Surgery Patients.</a> J Cardiovasc Transl Res. 9 (3), 230-238 (2016).</li>
<li>Frangogiannis, N. G., Smith, C. W., Entman, M. L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11744011">The inflammatory response in myocardial infarction.</a> Cardiovasc Res. 53 (1), 31-47 (2002).</li>
<li>Zernecke, A., Bernhagen, J., Weber, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+migration+inhibitory+factor+in+cardiovascular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Macrophage migration inhibitory factor in cardiovascular disease.</a> Circulation. 117 (12), 1594-1602 (2008).</li>
<li>White, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pro-inflammatory+action+of+MIF+in+acute+myocardial+infarction+via+activation+of+peripheral+blood+mononuclear+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Pro-inflammatory action of MIF in acute myocardial infarction via activation of peripheral blood mononuclear cells.</a> PLoS One. 8 (10), e76206(2013).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

A primeira parte deste estudo incluiu o isolamento de EPCs humanos do sangue periférico de voluntários saudáveis ​​para permitir uma avaliação completa do sangue de pacientes de cirurgia cardíaca. Portanto, uma centrifugação em gradiente de densidade foi realizada para separar a fracção de PBMC a partir de plasma, granulócitos e eritrócitos. Para remover a maioria dos contaminantes plaquetas, célula esta fracção foi submetida a curto e lavagem lenta os passos 29, 30.<...

<html> As células progenitoras endoteliais (CPE) estão em circulação no sangue humano e têm a capacidade de se diferenciarem em células endoteliais 2. Eles participam na vasculogénese e são capazes de minimizar o dano causado por ferimentos inflamação e isquemia / reperfusão (I / R) de várias maneiras, 3 4. Por exemplo, EPCs mostram níveis elevados de enzimas antioxidantes intracelular, tal como a catalase, glutationa peroxidase ou superóxido dismutase de manganês (MnSOD) 5. A elevada resistência contra o estresse oxidativo permite EPCs para funcionar em microambientes com espécies elevados reactivas de oxigénio (ROS) após a lesão isquêmica 6. Estudos anteriores indicaram que também o número de CPE pode ser correlacionada com a reparação vascular e que um número reduzido de circulantes EPCs prevê a ocorrência de eventos cardiovasculares 7,class = &quot;xref&quot;&gt; 8. No entanto, uma definição clara de um EPC ainda não foi encontrado. Até agora, não existe um marcador da superfície celular específico ou fenótipo consistente para CPE e estas células são muito raros no sangue periférico 9. Um EPC humana deve ser considerada como uma célula de circulação com a capacidade de contribuir para a reconstrução do endotélio lesionado e novas estruturas vasculares. Uma maneira de isolar e caracterizar EPCs é através da adesão à fibronectina. Deste modo, a capacidade destas células é utilizado para mostrar uma aderência superior à fibronectina pratos revestidos em comparação com um tipo de colagénio, por exemplo, 3, 10, 11. No entanto, outros descobriram que o plaqueamento de células mononucleares em pratos revestidos com fibronectina sem qualquer passo de purificação anterior ou ainda leva a colónias incluindo células progenitoras mielóides, monócitos e linfócitos T 12, 13, 14. Além disso, neste caso, as plaquetas podem contaminar a fracção de células mononucleares (MNC) e transferir, assim, proteínas de membrana de plasma de todas as células aderentes 15. Além da caracterização através de ensaios in vitro de adesão, uma combinação de diferentes marcadores de superfície de células é utilizado para descrever um tipo de célula considerado como um EPC. Neste caso, após a adesão mediada por fibronectina, as células são analisadas quanto ao atributos de tipo endotelial. Neste processo, os dois marcadores associados às células endoteliais, de lipoproteínas acetiladas de baixa densidade (AcLDL) e vascular do receptor do factor de crescimento endotelial 2 (VEGFR-2, KDR), desempenham um papel. As células endoteliais e macrófagos foram mostrados para tomar-se especificamente AcLDL em um processo chamado de &quot;via celular sequestrante&quot; 16. Outra proteína marcadora é KDR como o principal receptor de VEGF em endotelialAs células 17. No entanto, como EPCs em geral, são cultivadas em meio suplementado com factores de crescimento endoteliais e soro fetal de vitela, é possível que os macrófagos, que também pode ter sido erroneamente isolado, exibem um perfil de marcadores de tipo endotelial. Como foi mostrado anteriormente, se cultivadas em um meio com ar-endotelial, macrófagos expressam proteínas &quot;específico-endoteliais&quot; 18. Em geral, existem duas categorias de EPCs dentro mais subtipos, os quais podem ser encontrados no sangue ou ser cultivadas in vitro. EPCs final-excrescência (late-EPCs) aparecem após 2-3 semanas de cultura. Estas células são integrados mais rápido para uma monocamada de células endoteliais da veia umbilical humana e pode formar tubos capilares 19. Além disso, os chamados &quot;Early-EPCs&quot; circulam no sangue para cerca de uma semana e agir de uma maneira mais passiva através da realização moléculas angiogénicas, tais como crescimento endotelial vascularfator (VEGF), ou CXCL8 19. Os pacientes com doença arterial coronariana (DAC) mostrou valores significativamente mais baixos de early-EPCs em comparação a um grupo controle sem DAC 20. Curiosamente, o mesmo grupo demonstrou valores mais elevados de final-EPCs em comparação com um grupo de controlo. Outro estudo mostrou que early-EPCs proteger CPE diferenciadas da apoptose em condições oxidantes, de uma forma parácrina 6. Portanto, os primeiros EPCs pode proporcionar efeitos protectores relevantes através da migração de outras células de uma forma automática ou parácrina dentro do sangue periférico. Este protocolo descreve um método para purificar primeiros-EPCs em primeiro lugar isolar as PBMC-fracção a partir de sangue periférico humano e, subsequentemente, isolar as células CD34 + a partir de PBMC-fracção para limpar esta suspensão de células a partir de células não desejadas. O CD34 é um marcador, o qual é utilizado para o isolamento de células-tronco hematopoiéticas humanas 9 </sup&gt;. Em seguida, as células CD34 + são cultivadas em superfícies de cultura de tecidos revestidas com f ibronectina. Depois de três dias, o meio é mudado, perdendo assim todas as células não-aderentes. Finalmente, CPE isoladas são coradas para verificar a absorção de AcLDL e a presença de células endoteliais como KDR-marcador usando células activadas por fluorescência (FACS). Como um marcador adicional, analisamos molécula endotelial de adesão celular das plaquetas (PECAM-1, CD31), que também ocorre em células endoteliais. Restauração do tecido do miocárdio danificado ou infartados pela maior recrutamento de EPCs pertence às estratégias de tratamento intensamente investigadas em doenças cardiovasculares. No entanto, a tradução de resultados experimentais para a prática clínica é ainda difícil, dado o complexo interacção celular no corpo humano durante várias condições fisiopatológicas. Além disso, o miocárdio I / R lesões desencadear uma secreção excessiva de diversas citoquinas, hormonas e FAC crescimento<html> res, que controlam a homing de EPCs a regiões de formação de vasos sanguíneos 13. Tal como já foi mostrado, CXCL8, derivado de células do estroma fator 1α (SDF-1α, CXCL12), VEGF e factor inibidor da migração de macrófagos (MIF) estão significativamente aumentados em amostras de soro após lesão miocárdica de I / R 1. Entre esses fatores, MIF é uma citocina quimiocinas-like pleiotropic com características predominantemente pró-inflamatórias. Em contraste com o seu nome histórico, MIF tem funções pró-migratórios, actuando como uma verdadeira quimiocina em vários tipos de células de 1, 21, 22. Processos de recrutamento celular de MIF-mediadas foram ligados ao receptores de quimioquinas CXCR4 e CXCR2, que MIF se liga e activa de uma forma não-cognato 21. De nota, EPCs expressar ambos estes receptores na sua superfície, o qual, adicionalmente, tornam-se-reguladas sob condições hipóxicasass = &quot;xref&quot;&gt; 23, 24. Além disso, evidências acumuladas sugerem que MIF tem um efeito global cardio-protector durante a lesão de I / R do coração 22, 25, 26. Neste contexto, foi ainda demonstrado que MIF pode apoiar a neovascularização durante o estresse hipóxico que é de particular relevância, quando se analisam os mecanismos de recuperação limitadas do miocárdio lesado 27. Anteriores estudos in vitro e experiências em modelos pré-clínicos de rato fornecida primeira evidência sobre o papel da MIF no EPCs recrutamento 4. De nota, MIF também é uma proteína de carga proeminente de EPCs que pode ser introduzida durante o recrutamento EPCs dentro de sites isquêmicas 28. No entanto, estudos em ambientes clínicos, em especial em comparação com outros (angiogênicas) citocinas séricas permanecem ainda desconhecidos.

<table><tbody><tr><td>Fibronectina</td><td>Biochrom AG</td><td>L7117</td><td>Revestimento de frascos T-75</td></tr><tr><td>Aqua ad iniectabilia</td><td>Fresenius Kabi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Meio de crescimento de células endoteliais MV2</td><td>Promo Cell</td><td>C-22221</td><td></td></tr><tr><td>Meio de crescimento de células endoteliais MV2 SupplementMix</td><td>Promo Cell</td><td>C-39226</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque plus</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-03</td><td>Centrifugação por densidade</td></tr><tr><td>EasySep kit de seleção positiva CD34 humana</td><td>Stemcell Technologies</td><td>18056</td><td>Isolamento de células CD34+</td></tr><tr><td>Ímã EasySep</td><td>Stemcell Technologies</td><td>18000</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6964-100ML</td><td>Desprendimento de células</td></tr><tr><td>Corning HTS transwell 96 suportes bem permeáveis</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS3387-8EA</td><td>Sistema de migração</td></tr><tr><td>Solução Hoechst</td><td>ThermoFisher</td><td>33342</td><td>Coloração de células migradas</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>Institutos nacionais de saúde</td><td>xxx</td><td>Contagem de células migradas</td></tr></tbody></table>

isolamento de células endoteliais progenitoras de voluntários saudáveis ​​e seu potencial migratório influenciada por amostras de soro após cirurgia cardíaca

Isolation of Endothelial Progenitor Cells from Healthy Volunteers and Their Migratory Potential Influenced by Serum Samples After Cardiac Surgery

As células progenitoras endoteliais (CPE) são recrutadas a partir da medula óssea em condições patológicas como a hipóxia e são crucialmente envolvidas na neovascularização de tecidos isquémicos. A origem, classificação e caracterização de EPCs são complexas; Não obstante, dois sub-tipos importantes de EPCs foram estabelecidas: os chamados &quot;early&quot; EPCs (posteriormente referido como primeiros-EPCs) EPCs e tardio-excrescência (late-EPCs). Eles podem ser classificados pelo propriedades biológicas, bem como pela sua aparência durante a cultura in vitro. Enquanto EPCs &quot;precoces&quot; aparecem em menos de uma semana depois de a cultura de células mononucleares derivadas de sangue periférico em meios-CE específico, EPCs de fim de conseqüência pode ser encontrado após 2-3 semanas. EPCs Late-desdobramento ter sido reconhecido como estando directamente envolvido na neovascularização, principalmente através da sua capacidade de se diferenciar em células endoteliais maduras, enquanto que &quot;cedo&quot; EPCs expressar vários fatores angiogênicos como endógenaous carga para promover a angiogénese de um modo parácrino. Durante miocárdio a isquemia / reperfusão (I / R), vários factores controlar o homing de CPE para as regiões de formação de vasos sanguíneos. Factor de inibição de migração de macrófagos (MIF) é uma citocina pró-inflamatória e ubiquamente expresso quimiocina-e como foi recentemente descrito como a função do regulador chave da migração EPCs em concentrações fisiológicas 1. Curiosamente, MIF é armazenado em piscinas intracelulares e pode rapidamente ser liberado na corrente sanguínea após vários estímulos (por exemplo, enfarte do miocárdio). Este protocolo descreve um método para o isolamento seguro e cultura de início-EPCs a partir de sangue periférico humano adulto com base na selecção de células CD34-positivas com a cultura subsequente em meio contendo factores de crescimento endoteliais em placas revestidas com fibronectina para utilização em ensaios in vitro de migração contra amostras de soro dos pacientes cirúrgicos cardíacos. Além disso, oinfluência migratória de MIF em quimiotaxia de EPCs em comparação com outras citocinas de estimulação de angiogénese bem conhecido é demonstrada.

Caracterização de isolados células endoteliais progenitoras Em primeiro lugar, a absorção de AcLDL foi verificado, bem como a expressão de KDR, e CD31 sobre a superfície da população de células isoladas. Como mostra a figura 7A, 85,1% dos EPCs isoladas mostrou uma absorção de AcLDL e expressou CD31. As Figuras 7b e 7c mostram, adicionalmente, uma distribuição homogénea de ambos o...

As células progenitoras endoteliais (CPE) são crucialmente envolvidas na neovascularização de tecidos isquémicos. Este método descreve o isolamento de EPCs humanos a partir de sangue periférico, bem como a identificação do seu potencial migratório contra amostras de soro de pacientes de cirurgia cardíaca.

Isolamento de células endoteliais progenitoras de voluntários saudáveis ​​e seu potencial migratório influenciada por amostras de soro após cirurgia cardíaca

Endothelial progenitor cells (EPCs) are recruited from the bone marrow under pathological conditions like hypoxia and are crucially involved in the ...

O objetivo geral deste procedimento de isolamento celular e protocolo de migração é demonstrar uma maneira confiável de isolar células progenitoras endoteliais e avaliar seu potencial migratório frente a amostras de soro de pacientes submetidos a cirurgia cardíaca. Este método pode ajudar a responder questões fundamentais sobre a regeneração do revestimento endotelial e dos vasos sanguíneos, necessária após cirurgia cardíaca devido a lesões relacionadas à isquemia e à reperfusão. A principal vantagem desta técnica é a forma relativamente simples de isolar células progenitoras, incluindo o pré-isolamento de células positivas para CD-34.Além dos óbitos, as complicações graves da cirurgia cardíaca ainda são muito comuns, destacando a necessidade de identificar os mecanismos de risco e de proteção durante a cirurgia cardíaca. As células progenitoras endoteliais estão crucialmente envolvidas na neovascularização de tecidos isquêmicos e são conhecidas por conferir propriedades cardio-protetoras.Para iniciar o experimento, misture o sangue, na proporção de um para um, com PBS livre de cálcio e livre de magnésio. Adicione 15 mililitros da solução de gradiente de densidade a um tubo de 50 mililitros. E sobreponha lentamente o sangue diluído sobre a solução de gradiente de densidade.Em seguida, centrifugue as amostras. Usando uma pipeta plástica estéril, colete cuidadosamente a camada de buffy coat de cada tubo e transfira para outro tubo, evitando a solução de gradiente de densidade. Dilua a fração de células mononucleares do sangue periférico, ou PBMC, com pelo menos três volumes de PBS e misture a solução por pipetagem.Centrifugue a mistura à temperatura ambiente por 15 minutos a 200 vezes G. Em seguida, aspire o sobrenadante e re-suspenda o pellet celular em cinco mililitros de meio de crescimento para células endoteliais, MV-2. Após a re-suspensão das células, adicione 100 microlitros de anticorpo anti-CD34 humano por camada leucocitária utilizada e gire as células. Adicione 50 microlitros de microesferas magnéticas revestidas com dextran por camada leucocitária utilizada e gire as células.Após a incubação, transfira a suspensão para tubos fax com no máximo três mililitros para cada tubo. Em seguida, insira os tubos fax nos ímãs e aguarde cinco minutos. Descarte o sobrenadante sem retirar os tubos fax do ímã.Em seguida, fora dos ímãs, ressuspenda as células em cada tubo de fax com três mililitros de meio MV-2. Transfira a suspensão celular para frascos T-75 pré-revestidos. Adicione 17 mililitros de meio MV-2 a cada frasco.Para preparar o ensaio de migração, utilize uma pipeta para remover o meio das células progenitoras endoteliais ou CPEs, no frasco T-75. Lave as células com cinco mililitros de solução salina tamponada com fosfato ou PBS, e agite cuidadosamente o frasco. Em seguida, remova o PBS e adicione cinco mililitros de solução comercial de desanexação celular.Em seguida, aguarde até que as células se desprendam ao microscópio óptico. Acelere o desprendimento batendo cuidadosamente na base do frasco. Quando as células estiverem despreendidas, adicione rapidamente cinco mililitros de meio completo MV-2 e transfira a suspensão celular para outro tubo.Centrifugue as células a 2.000 x G durante cinco minutos. Após o pellet das células, re-suspenda-as em cinco a dez mililitros de PBS. E centrifugue novamente.Resuspenda as células em cinco a dez mililitros de PBS novamente e proceda com a centrifugação. Resuspenda o pellet celular em meio MV-2 desprovido de soro. Em seguida, dilua a amostra de soro de um para cinco em meio MV-2 desprovido de soro.Prepare a placa de migração adicionando 235 microlitros da amostra de soro na câmara inferior. Adicione o inserto pouco antes de adicionar a solução celular. Em seguida, adicione 75 microlitros da solução celular na câmara superior.Permita que as EPCs migrem. Remova a câmara superior contendo todas as células não migradas. Adicione 75 microlitros de solução de paraformaldeído a 3,6% contendo corante hoechst diluído na proporção de um para 1.000.Centrifugue a placa brevemente para posicionar todas as células no mesmo plano focal a 2.000 x G por um a dois minutos. Para evitar artefatos de autofluorescência do soro, quantifique as células migradas obtendo cinco imagens por poço com aumento de 100x em um microscópio. Por fim, conte as células migradas utilizando o software semiautomatizado.A análise por citometria de fluxo das CEPs confirma a captação de acLDL, bem como a expressão de CD-31 na superfície da população celular isolada. A análise isolada de acLDL e CD-31 revela uma distribuição homogênea de cada marcador. Elisa para identificar a influência da cirurgia cardíaca após lesão por reperfusão miocárdica sobre as concentrações séricas circulantes de MIF, CXCL12, CXCL8 e VEGF.Foram coletadas amostras de soro antes e durante a cirurgia. Os níveis séricos de MIF, CXCL12 e CXCL8 apresentaram um aumento significativo durante a cirurgia em comparação com os valores basais. Em contraste, as concentrações de VEGF não mostraram alterações significativas.Um ensaio de migração ex vivo, utilizando amostras de soro coletadas antes e durante a cirurgia, foi realizado com CEPs isoladas de voluntários saudáveis e revelou uma taxa de migração significativamente aumentada em direção às amostras obtidas intraoperatoriamente. A partir dessa técnica, as células mononucleares do sangue periférico podem ser facilmente isoladas para responder a outras questões relacionadas à inflamação.

isolation-endothelial-progenitor-cells-from-healthy-volunteers-their

Research

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Endotelial colônia formando células progenitoras (ECFCs) são uma ferramenta promissora para o estudo da homeostase vascular e reparação.

Isolamento e expansão em grande escala de Adulto Humanos endotelial Colony Células Progenitoras Forming

Este protocolo descreve o isolamento ea subsequente expansão de células mesenquimais estromais e as células endoteliais que formam colônias sem o uso de animais soro autólogo para gerar pares para fins de transplante experimental.

Isolamento e animais de Expansão de soro livre de cordão umbilical humano Derivado células mesenquimais estromais (MSCs) e endoteliais Células Progenitoras Colony Forming (ECFCs)

Estamos descrevendo um método para submeter células aderentes a tensão de cisalhamento do fluxo laminar em um circuito de fluxo contínuo estéril. Adesão das células, a morfologia pode ser estudada através da câmara transparente, amostras obtidas do circuito para análise de metabólitos e células colhidos após a exposição de cisalhamento para futuros experimentos ou cultura.

Câmara de placas paralelas de fluxo e Circuito de fluxo contínuo para avaliar células progenitoras endoteliais sob estresse de cisalhamento Fluxo Laminar

Células endoteliais que formam colônias (ECFCs) estão circulando células endoteliais com potencial clonal proliferativa robusto que exibe...

Caracterização fenotípica e funcional das células endoteliais Formadoras de Colônias derivado do sangue do cordão umbilical humano

tecido cardíaco humano abriga populações de células precursoras perivasculares multipotentes que podem ser adequados para a regeneração do miocárdio. A técnica aqui descrita permite o isolamento e purificação simultânea de duas populações de células estromais multipotentes associados com os vasos nativos de sangue, ie CD146 + CD34 - pericitos e células CD34 + CD146 - células adventícias, a partir do miocárdio humano.

Isolamento de perivascular Multipotentes populações de células precursoras a partir de tecido cardíaco humano

O objetivo do presente protocolo é isolar as células progenitoras endoteliais do sangue do cordão umbilical. Algumas das aplicações incluem o uso dessas células como um biomarcador para identificar pacientes com risco cardiovascular, tratamento de doenças isquêmicas, e criando engenharia de tecido vascular e coração válvula de construções.

Isolamento de células progenitoras endoteliais de sangue humano do Cordão Umbilical

Este protocolo descreve uma técnica de diferenciação endotelial para células progenitoras cardíacas. Centra-se sobretudo em como concentração sérica e densidade de semeadura de célula afetam o potencial de diferenciação endotelial.

Indução de diferenciação endotelial em células progenitoras cardíacas sob condições de baixo de soro

O desenvolvimento de grandes eventos cardiovasculares adversos, que afetam o prognóstico cardiovascular após a angioplastia coronariana, são influenciados pela extensão dos danos coronários e reparo vascular. O uso de novos biomarcadores celulares coronários e solúveis, reativos a danos vasculares e reparos, são úteis para prever o desenvolvimento de MACEs e prognósticos.

Células progenitoras coronárias e biomarcadores solúveis no prognóstico cardiovascular após angioplastia coronária

A amputação de membros inferiores pode ocorrer mesmo após a angioplastia de vasos obstruídos em Isquemia de Membros Críticos (CLI). Células Progenitoras Mononucleares (MPCs) refletem o reparo vascular. O presente protocolo descreve a quantificação de CMS de circulação próxima à angioplastia, e sua relação com disfunção endotelial e previsão de amputação de membros inferiores.

Prever amputação usando células progenitoras mononucleares circulantes locais em pacientes tratados com angioplastia com isquemia de membros críticos

O método descrito o isolamento e caracterização de células pulpares humanas estaminais (hDPSCs)...

Isolamento, caracterização e comparativa Diferenciação de células-tronco da polpa dentária Derivado de dentes permanentes usando dois métodos diferentes

Aprenda a isolar células endoteliais progenitoras do sangue periférico humano e avaliar seu potencial migratório em resposta a amostras de soro de pacientes cardíacos. Este método permite estudar a neovascularização após eventos isquêmicos.

Isolamento de células endoteliais progenitoras de voluntários saudáveis ​​e seu potencial migratório influenciada por amostras de soro após cirurgia cardíaca (Vídeo) | JoVE Journal

Isolamento de células endoteliais progenitoras de voluntários saudáveis ​​e seu potencial migratório influenciada por amostras de soro após cirurgia cardíaca

Explorar mais vídeos

Isolamento de células endoteliais progenitoras de voluntários saudáveis e seu potencial migratório influenciada por amostras de soro após cirurgia cardíaca