Isolamento de linfático humano endotelial por multi-parâmetro activadas por fluorescência celular

O objetivo geral deste procedimento é isolar células endoteliais linfáticas de alta pureza que revestem os vasos linfáticos de malformações linfáticas humanas e prepúcios, utilizando a classificação de células ativada por fluorescência. Isso é realizado primeiramente por meio da digestão enzimática de uma amostra de tecido de paciente. Na segunda etapa, a suspensão de células individuais é cultivada para enriquecer o número de células endoteliais linfáticas.

No exemplo, as células são então marcadas com anticorpos contra os marcadores de superfície celular de interesse e separadas por meio de triagem celular ativada por fluorescência multiparamétrica. Por fim, o prepúcio e a má formação linfática, as células endoteliais linfáticas podem ser expandidas em cultura celular para análises downstream adicionais.

A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes é que a triagem celular ativada por fluorescência fornece células com pureza superior a 99%, evitando os problemas associados à perda de células endoteliais linfáticas devido ao crescimento excessivo por células contaminantes. Comece pesando um tubo de 50 mililitros contendo 10 mililitros de meio, suplementado com uma solução antibiótica antimicótica. Em seguida, transfira a má-formação linfática ou a amostra de pele para o tubo e pese o tubo novamente para determinar o peso do tecido.

Em seguida, em uma cabine de segurança biológica classe dois, utilize pinças estéreis para transferir o tecido e o meio para uma placa de cultura de tecidos de 100 milímetros com o auxílio de tesoura estéril. Por fim, pique o tecido em fragmentos de um milímetro cúbico. Em seguida, transfira os fragmentos para um tubo de 50 mililitros contendo 10 mililitros de meio antibiótico antimicótico fresco.Medium.

Agite o tubo algumas vezes para ressuspender o tecido e, em seguida, centrifugue a amostra. Após a remoção do sobrenadante, adicione um mililitro de solução de digestão pré-aquecida por 100 miligramas de tecido picado e incube o tecido em uma incubadora a 37 graus Celsius com agitação constante a 200 RPM para um enriquecimento bem-sucedido das células endoteliais linfáticas. É fundamental reconhecer quando as células foram suficientemente expostas à reação de colagenase e ao espaço dys, para que sobrevivam ao isolamento.

Isso é alcançado por meio de um monitoramento cuidadoso do processo de digestão tecidual e da interrupção da reação quando a maior parte do tecido tiver sido digerida em fragmentos finos. Ao final da incubação, confirme que quase todo o tecido tenha sido digerido em pequenos fragmentos e filtre a suspensão tecidual através de um filtro de 70 mícrons para um tubo estéril de 50 mililitros. Em seguida, utilize o êmbolo de uma seringa de três mililitros com êmbolo de borracha para triturar o tecido remanescente até que apenas pequenos vestígios de matriz extracelular sejam observados.

Em seguida, lave o filtro celular com um volume de meio para células endoteliais equivalente ao volume do meio enzimático de dissociação e centrifugue as células para sedimentação. Suspenda o pellet em até 20 mililitros de meio para células endoteliais, dependendo do tamanho da amostra. Após a contagem, semeie duas vezes 10 à sexta potência de células em um frasco de 150 centímetros quadrados previamente revestido com fibronectina, em um volume final de 20 mililitros de meio para células endoteliais, para cultura noturna.

Na manhã seguinte, lave as células não ligadas com três lavagens de PBS suplementado com solução antibiótica antimicótica. Em seguida, para expandir o número de células endoteliais linfáticas, adicione meio fresco para células endoteliais às culturas e incube-as por cinco a sete dias, até que a cultura atinja cerca de 80% de confluência. Para corar as células para classificação por meio de citometria de fluxo multicolorida.

Primeiro, remova o meio celular, lave as células três vezes com PBS. Em seguida, adicione sete mililitros de solução de destacamento após uma incubação de cinco a sete minutos a 37 graus Celsius. Recolha as células dissociadas, inative as enzimas com três volumes de meio para células endoteliais e transfira a suspensão celular para um tubo estéril.

Centrifugue as células três vezes, lavando o pellet em cinco mililitros de PBS nas segundas e terceiras centrifugações após a última lavagem. Re-suspenda o pellet em cinco mililitros de PBS fresco e conte o número de células viáveis pelo método de exclusão com azul de tripano. Após a contagem celular.

Transfira assépticamente as células para tubos de citometria de fluxo e centrifugue as células para bloquear a ligação inespecífica. Re-suspenda as células em F-B-S-P-B-S a 5%, e incube no gelo por 20 minutos. Após a centrifugação de bloqueio, remova o sobrenadante e re-suspenda.

Suspenda o pellet em um coquetel de anticorpos CD34, potanina CD31 e receptor VEGF três. Após 20 minutos em gelo, lave as células três vezes em dois mililitros de FBS-PBS para remover qualquer anticorpo não ligado e ressuspenda. Suspenda o pellet em 300 microlitros de iodeto de propídio em solução de FBS-PBS, mantido em gelo.

Por fim, separe as células endoteliais linfáticas humanas purificadas em um instrumento de triagem celular ativado por fluorescência multiparamétrica. Em seguida, centrifugue as células triadas e ressuspenda os pellets no meio apropriado para semeadura em cultura celular. Aqui, são mostrados vasos linfáticos humanos normais e vasos de malformação linfática marcados com anticorpo contra pot deplane; observe a acentuada dilatação e a considerável variação no tamanho da luz nos vasos de malformação linfática humanos.

De fato, a maioria das malformações linfáticas contém estruturas císticas anormais tanto pequenas ou microcísticas quanto grandes ou macrocísticas após a digestão inicial do tecido e 24 horas de cultivo nas amostras não fracionadas. Colônias distintas de células endoteliais podem ser observadas, além de células semelhantes a fibroblastos e células musculares lisas, após a separação celular e mais 24 horas em cultura. No entanto, as células positivas para CD34, baixa expressão de CD31, receptor de VEGF três positivo, podoplanina positiva, aderem ao recipiente de cultura e exibem a morfologia típica de pavimento em mosaico observada nestas imagens.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como isolar com alta pureza a célula endotelial linfática que reveste malformações linfáticas humanas e vasos linfáticos dérmicos completos utilizando a triagem de células ativada por fluorescência. Não se esqueça de que o trabalho com tecido humano primário pode ser perigoso, pois pode conter agentes infecciosos prejudiciais à saúde humana. Precauções padrão, como o uso de luvas, proteção ocular e jaleco de laboratório, devem sempre ser adotadas ao realizar este procedimento.