Isolamento de linfático humano endotelial por multi-parâmetro activadas por fluorescência celular

O objetivo geral deste procedimento é isolar células endoteliais linfáticas de alta pureza que revestem os vasos linfáticos de malformações linfáticas humanas e prepúcios usando classificação de células ativadas por fluorescência. Isso é feito primeiro digerindo enzimaticamente uma amostra de tecido do paciente. Na segunda etapa, a suspensão unicelular é cultivada para enriquecer o número de células endoteliais linfáticas.

Na amostra. As células são então marcadas com anticorpos para os marcadores de superfície celular de interesse e classificadas usando classificação de células ativadas por fluorescência multiparâmetro. Em última análise, as células endoteliais linfáticas do prepúcio e da malformação linfática podem ser expandidas em cultura de células para análise posterior a jusante.

A principal vantagem desta técnica sobre os métodos existentes é que a classificação de células ativadas por fluorescência produz células com pureza superior a 99%, evitando os problemas associados à perda de células endoteliais linfáticas devido ao crescimento excessivo por células contaminantes. Comece pesando um tubo de 50 mililitros contendo 10 mililitros de meio, complementado com uma solução antibiótica antimicótica. Em seguida, transfira a malformação linfática ou quatro amostras de pele para o tubo e pese o tubo novamente para determinar o peso do tecido.

Em seguida, em um gabinete de biossegurança de classe dois, use uma pinça estéril para transferir o tecido e o meio para uma placa de cultura de tecidos de 100 milímetros usando uma tesoura estéril. Finalmente, pique o tecido em pedaços de um milímetro cúbico. Em seguida, transfira as peças para um tubo de 50 mililitros com 10 mililitros de antibiótico antimicótico fresco. Média.

Gire o tubo algumas vezes para ressuspender o tecido e, em seguida, gire a amostra. Depois de remover o sobrenadante, adicione um mililitro de solução de digestão pré-quente por 100 miligramas de tecido picado e incube o tecido em uma incubadora de 37 graus Celsius com agitação constante a 200 RPM Para enriquecimento bem-sucedido das células endoteliais linfáticas. É fundamental reconhecer quando as células foram suficientemente expostas à reação de colagenase e espaço de distensão para que sobrevivam ao isolamento.

Isso é conseguido por meio do monitoramento cuidadoso do processo de digestão do tecido e da interrupção da reação quando a maioria dos tecidos foi digerida em fragmentos finos. No final da incubação, confirme se quase todo o tecido foi digerido em pequenos fragmentos e filtre a pasta do tecido através de um filtro de 70 mícrons em um tubo estéril de 50 mililitros. Agora use um pistão de seringa de três mililitros com êmbolo de borracha para triturar o tecido restante até que apenas pequenos traços de matriz extracelular sejam observados.

Em seguida, lave o filtro de células com um volume de meio de células endoteliais equivalente ao volume do meio enzimático dissociante e gire para baixo as células reus. Suspenda o pellet em até 20 mililitros de meio de células endoteliais, dependendo do tamanho da amostra. Em seguida, após a contagem das sementes, duas vezes 10 elevado às seis células em um frasco de 150 centímetros quadrados pré-codificado com fibronectina em um volume final de 20 mililitros de meio de células endoteliais para cultura durante a noite.

Na manhã seguinte, lave as células não ligadas com três enxágues de PBS suplementados com solução antibiótica antimicótica. Em seguida, para expandir o número de células endoteliais linfáticas, adicione meio de células endoteliais frescas às células e incube a cultura por cinco a sete dias até que a cultura esteja cerca de 80% confluente. Para corar as células para classificação por classificação de células ativadas por fluorescência multiparâmetro.

Primeiro, remova a mídia celular, lave as células três vezes em PBS. Em seguida, adicione sete mililitros de solução de descolamento após cinco a sete minutos de incubação a 37 graus Celsius. Colha as células dissociadas, inative as enzimas com três volumes de meio de células endoteliais e transfira a suspensão celular para um tubo estéril.

Centrifugue as células três vezes lavando o pellet em cinco mililitros de PBS para a segunda e terceira centrifugações após a última lavagem. Ressuspenda o pellet em cinco mililitros de PBS fresco e conte o número de células viáveis por exclusão de azul triano. Seguindo a contagem de células.

Transfira assepticamente as células para tubos de coloração por citometria de fluxo e gire as células para baixo para bloquear a ligação inespecífica. Ressuspenda as células em 5%F-B-S-P-B-S e incube no gelo por 20 minutos. Depois de bloquear a centrífuga, as células removem o sobrenadante e o resus.

Suspenda o pellet em CD 34, CD 31 potanina e coquetel de anticorpos do receptor três VEGF. Após 20 minutos no gelo, lave as células três vezes em dois mililitros de F-B-S-P-B-S para remover qualquer anticorpo não ligado e resus. Suspender o pellet em 300 microlitros de iodeto de propídio em solução de F-B-S-P-B-S sobre gelo.

Finalmente, classifique as células endoteliais linfáticas humanas purificadas em um instrumento de classificação de células ativadas por fluorescência multiparâmetro. Em seguida, gire as células classificadas e suspenda novamente os pellets no meio apropriado para a semeadura da cultura de células. Aqui, os vasos linfáticos humanos normais e de malformação linfática marcados com anticorpos contra o desembarque em pote são mostrados observando a dilatação acentuada e a considerável variação do tamanho do lúmen dentro dos vasos de malformação linfática humana.

De fato, a maioria das malformações linfáticas contém estruturas císticas anormais pequenas ou microcísticas e grandes ou macrocísticas após a digestão inicial do tecido e 24 horas de cultura nas amostras não fracionadas. Colônias distintas de células endoteliais podem ser observadas, além das células semelhantes a fibroblastos e células musculares lisas após a classificação e mais 24 horas em cultura de células. No entanto, o CD 34, o receptor VEGF positivo para baixo CD 31 três planos de podo positivos e células positivas anexadas ao recipiente de cultura exibem a morfologia típica de paralelepípedos observada nessas imagens.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como isolar com alta pureza a célula endotelial linfática que reveste a malformação linfática humana e os vasos linfáticos da pele inteira usando a classificação de células ativadas por fluorescência. Não se esqueça de que trabalhar com tecido humano primário pode ser perigoso, pois pode conter agentes infecciosos prejudiciais à saúde humana. Precauções padrão, como usar luvas, óculos de proteção e avental de laboratório, devem sempre ser tomadas durante a realização deste procedimento.