Microcápsulas de alginato como uma plataforma 3D para Propagação e Diferenciação de Células-Tronco Embrionárias (hESC) para diferentes linhagens

Este protocolo é otimizado para encapsular células-tronco embrionárias humanas pluripotentes e diferenciá-las em neurônios dopaminérgicos em um sistema 3D. Primeiro, trate as colônias com inibidor de rocha ou RI e associe-as em células únicas com acuato misturado com alginato de sódio e passado pelo dispositivo de encapsulamento. Continue o tratamento com RI por três dias, transfira as células encapsuladas para seis células PA e diferencie por 28 dias.

Em última análise, a análise da expressão gênica e proteica mostra uma maior eficiência na geração de neurônios dopaminérgicos. A principal vantagem dessa técnica específica sobre o protocolo de diferenciação 2D existente é que tentamos propagar e diferenciar essas células em ambiente 3D e esse ambiente 3D oferece a oportunidade de que as células possam ser propagadas de maneira de alta densidade. E então também dá a oportunidade de ter uma melhor interação célula a célula para diferenciação.

E em terceiro lugar, também oferece uma melhor eficiência de diferenciação no futuro. E também, se eu puder acrescentar que essa técnica específica também pode ser adaptada para outro tipo de células, que podemos propagar em um ambiente 3D. Agora lembre-se também, por exemplo, que essa técnica específica foi otimizada com base no uso de um inibidor de rocha específico que previne a apoptose celular e também evita o desprendimento da célula das placas de cultura.

Geralmente, os indivíduos novos neste método terão dificuldades no início, pois essa técnica normalmente não é realizada em cultura de tecidos. A seguinte técnica de encapsulamento foi otimizada com base nos estudos resumidos do Dr. Dean Dr. Chad sobre a aplicação do tipo de alginato do inibidor de R, concentração de alginato e configurações do dispositivo de encapsulamento. Jamie e Kim, um estudante de doutorado de nosso laboratório, agora demonstrarão esse protocolo.

Adicione 25 mililitros de solução estéril de gelatina a 0,1% a 275 miligramas de alginato de sódio purificado em um vórtice de tubo estéril de 50 mililitros para dissolver parcialmente o pó de alginato. Em seguida, coloque o tubo em um misturador orbital a 10 vezes G durante a noite. Em seguida, adicione cloreto de sódio estéril a 9% à solução de alginato.

Vortex por 30 segundos e depois centrifugue a 95 vezes G por cinco minutos. Armazene a solução de alginato a quatro graus Celsius. Primeiro, em um ambiente escuro, pré-trate as células-tronco embrionárias humanas com meios de cultura suplementados com 10 micromolares de inibidor de rocha.

Incubar por duas horas a 37 graus Celsius. Agora lave as células duas vezes com DPBS para desalojar as células enzimaticamente. Adicione o accutane e incube por 10 minutos.

A 37 graus Celsius, colha suavemente as células com um raspador de células e transfira para um tubo de 15 mililitros. Neutralize o Accutane com um volume igual de meio SL. Em seguida, passe as células neutralizadas através de um filtro de 40 mícrons para um tubo de centrífuga novo de 50 mililitros.

Agora use um hemocitômetro para enumerar as células. Pulverize as células por centrifugação, descarte cuidadosamente o supinato. Em seguida, lave as células uma vez com pré-aquecimento.

0,9% de cloreto de sódio. Centrifugue seu ganho e descarte o supinato. Para encapsular as células-tronco embrionárias humanas, comece suspendendo as células com solução de alginato pré-aquecida.

Para fazer isso, conecte uma seringa de 20 mililitros a um tubo de plástico macio e aspire alginato na seringa. Em seguida, misture suavemente a suspensão celular usando a seringa sem criar bolhas. Agora aspire as células para a seringa.

Descarte o tubo de plástico e conecte a seringa à máquina de encapsulamento. Prossiga para a configuração dos instrumentos do gerador de contas, bomba de seringa, medidor de fluxo de ar e banho de precipitação de cloreto de cálcio. Verifique uma lacuna de 10 centímetros entre a extremidade da máquina de encapsulamento e o ponto de coleta da placa de Petri.

Em seguida, ajuste a bomba da seringa em 10 mililitros por hora. Taxa de fluxo de ar de oito litros por minuto e uma pressão de 100 quilo pascals. Recolher as células encapsuladas num banho de precipitação pré-quente durante sete minutos.

Em seguida, transfira-os por aspiração suave para um tubo de centrífuga de 50 mililitros contendo 20 mililitros de cloreto de sódio a 0,9%, deixe as cápsulas assentarem no fundo do tubo, descarte suavemente o supinato e lave uma vez com cloreto de sódio a 0,9%. Proceder à ressuspensão das células encapsuladas em meio de cultura pré-quente, complementado com inibidor de rochas. Transfira para um frasco de cultura e incube por três dias.

Semeie a linha estromal do camundongo PA seis células em um frasco T 75 revestido com gelatina a 0,1% e meio de diferenciação neural dopaminérgico condicionante por 24 horas. Transfira as cápsulas para um tubo de centrifugação de 50 mililitros e deixe-as assentar no fundo do tubo. Descarte o supinato e ressuspenda as cápsulas na diferenciação neural dopaminérgica de condição de seis células PA.

Cultura média. As células-tronco embrionárias humanas encapsuladas com a monocamada de seis células PA por 21 dias. Ao reabastecer a mudança de mídia.

Apenas metade dos meios de cada vez continua a cultivar as seis células PA na diferenciação neural dopaminérgica. Meio suplementado com fatores indutores por uma semana. Aspire primeiro as cápsulas e transfira-as para um tubo de centrífuga de 15 mililitros.

Quando as cápsulas assentarem no fundo, descarte o supinato. Lave duas vezes com DPBS, descartando o supinado. Em seguida, adicione cinco mililitros de solução de decapagem e misture bem a suspensão.

Incube por cinco minutos em temperatura ambiente. Após a centrifugação do pellet, as células decapadas e lavadas duas vezes com DPBS continuam a usar células decapadas como uma cultura de monocamada ou para análise imediata a jusante. Em uma preparação típica, o diâmetro das microcápsulas de alginato está entre 400 e 500 mícrons.

Aqui, ensaio C-F-D-A-P-I. Os resultados determinam as células encapsuladas verdes viáveis em 80% análises de viabilidade, proliferação e apoptose de células-tronco embrionárias humanas encapsuladas em diferentes momentos servem para otimizar as condições de cultura. Curiosamente, os efeitos inibidores de rocha previnem a apoptose induzida por dissociação e mantêm a viabilidade celular com indicação de crescimento superior de células-tronco embrionárias humanas encapsuladas cultivadas em H-F-F-C-M mais ri.

Este exemplo aplica o encapsulamento celular como uma plataforma 3D para diferenciar células-tronco embrionárias humanas encapsuladas em neurônios dopaminérgicos. Como esperado, o tamanho dos corpos embrionários aumenta com o tempo de decapsulação; as células demonstram morfologia neuronal progressiva após dois a três dias de cultivo, com viabilidade superior a 90%. A análise da expressão gênica indica uma regulação negativa do marcador pluripotente OCT quatro.

É importante ressaltar que o marcador neuroprogenitor PAC seis e o marcador neuronal dopaminérgico th permanecem regulados positivamente após sete dias de diferenciação. Outras células-tronco embrionárias humanas diferenciadas indicam neurônios positivos superiores a 90% após 21 dias. A análise de perda ocidental confirma os padrões de expressão favoráveis de TH e PAC seis sob sistemas de cultura de células 3D versus 2D.

Uma vez dominada, essa técnica pode ser efetivamente executada em duas horas. Lembre-se de tratar as células com inibidor de rocha antes e depois do encapsulamento. Indutores ou inibidores variantes podem adaptar o protocolo de diferenciação 3D para experimentos futuros.

Esta técnica particular de encapsular ESL humano e diferenciá-los em um ambiente 3D ou para potencial terapia celular para várias doenças, particularmente a doença de Parkinson.