Name: Métodos de estudo epitelial Transporte função das proteínas e Expressão em Native Intestino e Caco-2 células cultivadas em 3D (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 27 s
Description: Aprenda a cultivar células Caco-2 em 3D e a usar a câmara de Ussing para estudar a regulação do transportador de serotonina SERT no intestino. Esses métodos avançam a pesquisa em biologia do transporte epitelial.

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Agradecemos ao Sr. Christopher Manzella, estudante de MD/PhD no laboratório RKG, por ajudar a editar e revisar nosso manuscrito.

1. Estudo de intestinal transportador num sistema de cultura 3D de Caco-2: Cultivo Cultura de Células Caco-2 3D sobre uma mistura de proteína gelatinoso <ol><li> factor de crescimento reduzida Descongelar mistura gelatinosa proteína em gelo durante 8 h (ou O / N) a 4 ° C. Uma vez descongelada, fazer 1 mL ou 500 mL alíquotas para uso ou armazenar a -20 ° C para uso posterior. </li><li> No dia da cultura, as placas de cultura pré-resfriamento (para extracção de ARN e proteína) ou lâminas de câmaras (por imunocoloração) em gelo. Adicionar 30 uL de mistura de proteína gelatinosa a cada poço de uma corrediça de vidro compartimentado oito poços (ou 120 uL por poço de uma placa de 6 poços) e espalhar uniformemente. Tome cuidado para não gerar bolhas de ar durante o processo. </li><li> Colocar as lâminas / placas dentro de uma incubadora de cultura de células a 37 ° C durante 15-30 min e permitir que a mistura de proteína gelatinoso para solidificar. </li><li> Enquanto a mistura de proteínas é gelatinoso solidificando, trypsinize um frasco confluente de células Caco-2. </li><li> Contar o númerode células e colocá-los a 500 xg numa centrifugadora de mesa, durante 5 min. Re-suspender o sedimento de células em 3D Caco-2 médio, conforme necessário. </li><li> Semear as lâminas de câmara de vidro e 4.000 células por poço (para placas, 20.000 por poço). Permitir que as células a crescer numa incubadora humidificada com 5% de CO2 a 37 ° C. Alterar médio a cada 3 - 4 d. </li></ol> 2. Imunofluorescência coloração para epitelial Transportadores em 3D Caco-2 Cells: Dia 1 <ol><li> Aspirar o meio e fixar as células com 400 uL de 2% de paraformaldeído (PFA) (em PBS com o pH ajustado para 8,5 com NaOH) durante 30 min à TA. NOTA: solução PFA não devem ser armazenados durante mais de 1 semana a 4 ° C, e frescos solução pode ser utilizada. CUIDADO: PFA é altamente tóxico e potencialmente cancerígeno. Sempre lidar com isso com cuidado em uma capa química e uso de equipamentos de proteção individual. </li><li> Lavar as cavidades duas vezes com PBS 1x e armazenar as lâminas a 4 ° C em PBS (400 ul /bem). Uma vez fixo, armazená-los a 4 ° C durante até uma semana. </li><li> Aquecer as lâminas de câmara para RT (isso vai endurecer a cama mistura de proteína gelatinosa e torná-lo fácil para aspirar durante as etapas de lavagem). </li><li> Permeabilizar as células com 0,5% de Triton em PBS durante não mais do que 15 min. </li><li> Preparar tampão PBS-glicina (130 mM de NaCl, 7 mM de Na 2 HPO 4, 3,5 mM de NaH 2 PO 4, e 100 mM de glicina). Lavar 3x com PBS 1x-glicina durante 10 minutos cada à temperatura ambiente. </li><li> Preparar tampão de imunofluorescência (IF): 130 mM de NaCl, 7 mM de Na 2 HPO 4, 3,5 mM de NaH 2 PO 4, glicina 100 mM, NaN 7,7 3, 0,1% de BSA, 0,2% Triton X-100, e 0,05% de Tween-20 . </li><li> Lavar 3x em tampão IF durante 10 minutos cada à temperatura ambiente. Bloco em 5% normal Goat Serum (NGS) em tampão IF. Incubar com anticorpo primário diluído em soro de cabra + 1% de SE, 200 uL / ​​poço, durante 1 - 2 h à TA. Lave com tampão IF 3x durante 10 minutos cada um. </li><li> Incube com anti secundáriocorpo (1: 200) diluída em SE + 1% de NGS, 200 uL / ​​poço, durante 1 h, à RT. </li><li> Lave com tampão IF três vezes durante 10 minutos cada. Mantenha os slides no escuro a partir deste passo. Levante as câmaras de plástico dos lâminas de vidro, colocando o slide câmara em um suporte preto e deslizando um levantador branca através do suporte até que seus contatos de borda a borda dos poços. Gentilmente puxar para cima as câmaras (o titular eo levantador deve vir com os slides de cultura). </li><li> Montagem com meio anti-fade lento e deixe-a secar por 10 minutos em temperatura ambiente. </li><li> Uma vez completamente seco, selar as lâminas com unha polonês e imagem-los com a microscopia confocal. Armazenar as lâminas a 4 ° C durante duas semanas ou a -20 ° C durante vários meses. </li></ol> 3. RNA e extração de proteínas de 3D Caco-2 células <ol><li> Tratar as células cultivadas na mistura gelatinosa proteína de 12 - 14 d, com um agente de teste, tais como TGF- β1 (10 ng / mL, 1 h). </li><li> Após o tratamento, lavar as células com umax PBS. Manter as células em gelo durante 30 min para se liquefazer a mistura de proteína gelatinosa. </li><li> Lavar os poços com PBS gelada e recolher as células em tubos de centrífuga individuais. Recolher as células através de centrifugação a baixa velocidade a 500 xg e 4 ° C durante 10 min. Extrai-se a ARN utilizando procedimentos padrão e utilizar em tempo real de RT-PCR. </li><li> Para a extracção de proteínas, a lise das células utilizando tampão de lise celular 1x suplementado com inibidor de protease 1x cocktail. Após a adição de tampão de lise de células para o sedimento, a lise das células por ultra-sons e remover os restos celulares por centrifugação a 7500 xg e 4 ° C durante 10 min. </li></ol> 4. Medição do 5-HT A captação do rato íleo Utilizando uma Câmara de Ussing: Preparação intestinal e seromuscular Decapagem <ol><li> Após a eutanásia, dissecar os ratos e remover o intestino delgado (após o estômago e antes do ceco). Dividir o intestino delgado em três partes. Descartar o terço médio, use o terço proximalcomo jejuno, e usar o terço distal como íleo. Evitar puxar o intestino a partir da sua ligação mesentérica para evitar danos ao epitélio. Manter o frio secção de tecido cobrindo-o com gelado bicarbonato de Krebs-Ringer tampão (KBR). </li><li> Abra o intestino longitudinalmente com uma tesoura. Incubar secções intestinais recentemente excisadas em gelada, gaseamento KBR contendo 1 uM de indometacina durante 10 min antes da seromuscular decapagem. </li><li> Pin a secção intestinal (~ 1 cm de comprimento) da mucosa voltada para baixo para uma placa contendo 7% de agarose ou de elastómero de silicone curado (0,5 cm de espessura). </li><li> Tira as camadas seromuscular sob um microscópio estereoscópico de dissecação com iluminação de fundo. Cortar a camada seromuscular usando uma lâmina de bisturi pena. Utilize uma pinça fina para obter o bordo da camada ao longo do eixo longitudinal do intestino. NOTA: Durante o processo de extracção, a iluminação de fundo do microscópio estereoscópico ajuda a identificar e evitar áreas com placa de Peyeres. </li><li> Após a conclusão da operação de stripping seromuscular, montar a mucosa cuidadosamente sobre os pinos de uma meia-câmara Ussing. Durante todo o processo, tome cuidado para segurar o tecido da mucosa despojado pelas bordas, para evitar que se rasgue. </li></ol> 5. A equilibração e o tratamento dos tecidos <ol><li> Preparar a solução de Kreb: NaCl 115 mM, NaHCO3 25, 2,4 mM de K 2 HPO 4, CaCl2 1,2, MgCl2 1,2, e 0,4 mM de KH 2 PO 4 a pH 7,4, gaseificado com 95% O2 / 5% CO 2 a 37 ° C. Adicionar 10 mM de glucose para o banho de seroso para servir como um substrato energético e manitol 10 mM ao banho mucoso para manter o equilíbrio osmótico. Nota: A solução de Krebs é suplementada com ácido L-ascórbico (100 uM) e pargilina (100 uM, inibidor de monoamina-oxidase) para evitar a degradação intracelular de 5-HT. </li><li> Insira o controle deslizante para a câmara para expor tanto a si (luminal) apicale de o (seroso) lado basolateral do tecido a uma solução de Kreb. </li><li> Após um período de equilibração de 10 min, o pré-tratamento do tecido do íleo com fluoxetina (10 uM) durante 30 min no lado apical para o MS de fluxo (J-a-mucosa da serosa). </li><li> Tratar o tecido com TGF-β1 (10 ng / mL) durante 1 h no lado basolateral e depois incubar com 3 [H] -5-HT (20 nM) durante 30 min sobre o lado apical. </li></ol> 6. A quantificação da mucosa a serosa fluxo (J ms) e 3 [H] -5-HT acumulação no tecido <ol><li> Recolhe 0,75 mL alíquotas do reservatório seroso (total de 5 ml) para medir a radioactividade num contador de cintilação líquida e para calcular mucosa-a serosa (J ms) taxas de fluxo; sensíveis fluoxetina-flux representa SERT mediada por 3 a absorção de [H] -5-HT. </li><li> Para evitar diferenças de pressão hidrostática através da mucosa durante um período de fluxo, recolher amostras do lado da serosa e recolocá-los com volumes iguais de meio de banho. NOTA: O cálculo do fluxo corrige para a diluição final da amostra (4,25 ml / 5 ml = 0,85). </li><li> Para a quantificação de 3 [H] -5-HT acumulada no tecido, desmontar a mucosa do cursor, lavar uma vez com tampão KRB gelada, e colocá-lo em tubos de cultura de vidro. </li><li> Incubar a mucosa em 0,5 mL de KOH a 10% durante a noite a 37 ° C. Medir a radioactividade em 150 ul de aliquotas dos lisados ​​(em triplicado), utilizando um contador de cintilação líquida. </li><li> Utilizar-se aliquotas (3-5 ul) dos lisados ​​para medir a concentração de proteína utilizando o método de Bradford. NOTA: 10 ml de meio de incubação contendo serotonina radioactivos é usada como um padrão. 5-HT retidos no tecido é expressa em pmol / mg de proteína / min. </li></ol>

<ol><li>Simon-Assmann, P., Turck, N., Sidhoum-Jenny, M., Gradwohl, G., Kedinger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+models+of+intestinal+epithelial+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biol+Toxicol%22%5BJournal%5D)">In vitro models of intestinal epithelial cell differentiation.</a> Cell Biol Toxicol. 23 (4), 241-256 (2007).</li>
<li>Shen, C., Meng, Q., Zhang, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+of+3D+printed+insert+for+hanging+culture+of+Caco-2+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biofabrication%22%5BJournal%5D)">Design of 3D printed insert for hanging culture of Caco-2 cells.</a> Biofabrication. 7 (1), 015003(2014).</li>
<li>Jaffe, A. B., Kaji, N., Durgan, J., Hall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cdc42+controls+spindle+orientation+to+position+the+apical+surface+during+epithelial+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cdc42 controls spindle orientation to position the apical surface during epithelial morphogenesis.</a> J Cell Biol. 183 (4), 625-633 (2008).</li>
<li>Martel, F., Monteiro, R., Lemos, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uptake+of+serotonin+at+the+apical+and+basolateral+membranes+of+human+intestinal+epithelial+%28Caco-2%29+cells+occurs+through+the+neuronal+serotonin+transporter+%28SERT%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharmacol+Exp+Ther%22%5BJournal%5D)">Uptake of serotonin at the apical and basolateral membranes of human intestinal epithelial (Caco-2) cells occurs through the neuronal serotonin transporter (SERT).</a> J Pharmacol Exp Ther. 306 (1), 355-362 (2003).</li>
<li>Gill, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Function%2C+expression%2C+and+characterization+of+the+serotonin+transporter+in+the+native+human+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Gastrointest+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Function, expression, and characterization of the serotonin transporter in the native human intestine.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 294 (1), G254-G262 (2008).</li>
<li>Esmaili, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enteropathogenic+Escherichia+coli+infection+inhibits+intestinal+serotonin+transporter+function+and+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Enteropathogenic Escherichia coli infection inhibits intestinal serotonin transporter function and expression.</a> Gastroenterology. 137 (6), 2074-2083 (2009).</li>
<li>Wade, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+and+function+of+a+5-HT+transporter+in+crypt+epithelia+of+the+gastrointestinal+tract%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Localization and function of a 5-HT transporter in crypt epithelia of the gastrointestinal tract.</a> J Neurosci. 16 (7), 2352-2364 (1996).</li>
<li>Clarke, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+Ussing+chamber+studies+of+mouse+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Gastrointest+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">A guide to Ussing chamber studies of mouse intestine.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 296 (6), G1151-G1166 (2009).</li>
<li>Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphogenesis+and+oncogenesis+of+MCF-10A+mammary+epithelial+acini+grown+in+three-dimensional+basement+membrane+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures.</a> Methods. 30 (3), 256-268 (2003).</li>
<li>Vedeler, A., Pryme, I. F., Hesketh, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin+induces+changes+in+the+subcellular+distribution+of+actin+and+5%27-nucleotidase%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biochem%22%5BJournal%5D)">Insulin induces changes in the subcellular distribution of actin and 5'-nucleotidase.</a> Mol Cell Biochem. 108 (1), 67-74 (1991).</li>
<li>Botvinkin, A. D., Selimov, M. A., Zgurskaia, G. N., Kulikov, L. G., Aksenova, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%5BDetection+of+rabies+virus+antibodies+in+human+blood+serum+by+an+immunoenzyme+method%5D%5BTitle%5D)+AND+%22Vopr+Virusol%22%5BJournal%5D)">[Detection of rabies virus antibodies in human blood serum by an immunoenzyme method].</a> Vopr Virusol. 31 (3), 333-334 (1986).</li>
<li>Woods, G. L., Mills, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+dexamethasone+on+detection+of+herpes+simplex+virus+in+clinical+specimens+by+conventional+cell+culture+and+rapid+24-well+plate+centrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Effect of dexamethasone on detection of herpes simplex virus in clinical specimens by conventional cell culture and rapid 24-well plate centrifugation.</a> J Clin Microbiol. 26 (6), 1233-1235 (1988).</li>
<li>Chase, A. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acyclovir+for+shingles%5BTitle%5D)+AND+%22Br+Med+J+%28Clin+Res+Ed%22%5BJournal%5D)">Acyclovir for shingles.</a> Br Med J (Clin Res Ed. 295 (6603), 926-927 (1987).</li>
<li>Churchill, P. F., Churchill, S. A., Martin, M. V., Guengerich, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+rat+liver+cytochrome+P-450UT-H+cDNA+clone+and+comparison+of+mRNA+levels+with+catalytic+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Characterization of a rat liver cytochrome P-450UT-H cDNA clone and comparison of mRNA levels with catalytic activity.</a> Mol Pharmacol. 31 (2), 152-158 (1987).</li>
<li>Steiner, M., Tateishi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+and+transport+of+calcium+in+human+platelets%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Distribution and transport of calcium in human platelets.</a> Biochim Biophys Acta. 367 (2), 232-246 (1974).</li>
<li>McClelland, M., Nelson, M., Cantor, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+Mbo+II+methylase+%28GAAGmA%29+from+Moraxella+bovis%3A+site+specific+cleavage+of+DNA+at+nine+and+ten+base+pair+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Purification of Mbo II methylase (GAAGmA) from Moraxella bovis: site specific cleavage of DNA at nine and ten base pair sequences.</a> Nucleic Acids Res. 13 (20), 7171-7182 (1985).</li>
<li>Chatterjee, I. shita, K, A., Gill, R. avinder K., Alrefai, W. addah A., Dudeja, P. radeep K. <a target="_blank" href="http://www.gastrojournal.org/article/S0016-5085(14)62381-7/abstract">3D Cell Culture of CaCo2: A Better Model to Study the Functionality and Regulation of Intestinal Ion Transporters.</a> Gastroenterology. 146 (5, Supplement 1), S-654(2014).</li>
<li>Fagg, R. H., Hyslop, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+a+variant+strain+of+foot-and-mouth+disease+virus+%28type+O%29+during+passage+in+partly+immunized+cattle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Hyg+%28Lond%29%22%5BJournal%5D)">Isolation of a variant strain of foot-and-mouth disease virus (type O) during passage in partly immunized cattle.</a> J Hyg (Lond). 64 (4), 397-404 (1966).</li>
<li>Shilkina, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%5BThe+aspects+of+the+problem+of+systemic+vasculitis+open+to+discussion%5D%29%5BTitle%5D)+AND+%22Ter+Arkh%22%5BJournal%5D)">[The aspects of the problem of systemic vasculitis open to discussion]).</a> Ter Arkh. 61 (12), 102-106 (1989).</li>
<li>Derichs, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+current+measurement+for+diagnostic+classification+of+patients+with+questionable+cystic+fibrosis%3A+validation+and+reference+data%5BTitle%5D)+AND+%22Thorax%22%5BJournal%5D)">Intestinal current measurement for diagnostic classification of patients with questionable cystic fibrosis: validation and reference data.</a> Thorax. 65 (7), 594-599 (2010).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

As monocamadas de células Caco-2 completamente diferenciadas foram utilizados extensivamente como monocamadas epiteliais polarizadas para estudar o transporte intestinal 10, 11, 12, 13, 14, 15. No entanto, para imitar a organização fisiológico das células epiteliais intestinais, tem havido um interesse considerável no desenv...

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Arivarasu N. Anabazhagan
to:
Arivarasu N. Anbazhagan

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Erratum: Methods to Study Epithelial Transport Protein Function and Expression in Native Intestine and Caco-2 Cells Grown in 3D

O epitélio intestinal é equipado com várias proteínas de transporte (canais, ATPases, co-transportadores e trocadores) que realizam numerosas funções que vão desde a absorção de nutrientes, electrólitos, e medicamentos para a secreção de fluido e de iões no lúmen. proteínas de transporte gerar gradientes electroquímicos que permitem o movimento de iões ou moléculas de um modo vectorial. Isto é conseguido por as distribuições assimétricas de os sistemas de transporte nas membranas basolaterais e apicais de células epiteliais polarizadas. Além disso, as junções apertadas, que amarrar as células epiteliais adjacentes, desempenham um papel importante neste processo, servindo como uma barreira para a difusão dos componentes intramembranar entre os domínios de membrana apical e basolateral. Sistemas modelo adequado que mimetizam estas características do intestino nativo (isto é, a polaridade, a diferenciação e a integridade junção estanque) são críticos para o estudo da functionalidade de sistemas de transporte epiteliais. No que diz respeito aos modelos, as linhas celulares típicas actualmente utilizadas na pesquisa de transporte epitelial intestinal Caco-2 são, de um modelo completamente diferenciado, absorventes de células epiteliais do intestino delgado; e células T84 ou HT-29 subclones, modelos de grandes células epiteliais intestinais derivado 1-crypt. Convencionalmente, estas linhas de células são crescidas como monocamadas em superfícies de plástico ou em inserções Transwell revestidas. Trans poços de cultura de células inserções em certa medida, assemelhar-se ao ambiente in vivo, permitindo que as células polarizadas para alimentar basolateralmente. No entanto, uma limitação dos sistemas de cultura 2D convencionais é que as células são forçadas a se adaptar a uma superfície artificial, plana e rígida. Assim, a complexidade fisiológica do epitélio nativa não é reflectida de forma adequada num sistema 2D. Esta limitação foi superada através de métodos de cultivar células em 3D em um microambiente específico, como MIXTUR proteína gelatinosaE, contendo uma variedade de componentes da matriz extracelular 2, 3. No entanto, as culturas in vitro não pode simular a complexidade do epitélio intestinal, o que tem vários tipos de células e a arquitectura específica da região no intestino. Assim, os estudos utilizando modelos de cultura celular exigir uma validação adicional no intestino nativo. Utilizando a cultura de células in vitro 3D e da mucosa intestinal do rato, que descrevem aqui métodos simples para estudar a regulação do transportador de serotonina intestinal (SLC6A4, SERT). O transportador SERT regula a disponibilidade extracelular de uma hormona importante neurotransmissor e, 5-hidroxitriptamina (5-HT), transportando-o através de uma rápida Na + / Cl - dependente de processo. SERT é um alvo conhecido dos anti-depressivos e surgiu recentemente como um novo alvo terapêutico de distúrbios gastrointestinais, como diarréia e inflamação intestinal.Métodos para investigar absorção de 5-HT, em células epiteliais intestinais foram anteriormente descritos. Por exemplo, Caco-2 células cultivadas em suportes de plástico ou inserções permeáveis têm mostrado exibir absorção 3 H-5-HT fluoxetina e minúsculas em ambos os domínios basolaterais e apicais 4. A medida da função SERT em escova isolado beira da Membrana As vesículas (BBMVs) preparado a partir de doadores de órgãos humanos intestino delgado, também foi descrita por 5 nós. 3 absorção de H-5-HT em BBVMs humanos mostrou-se fluoxetina-sensível e Na + / Cl - dependente, e exibiu uma cinética de saturação com um K m de 300 nM 5. Utilizando métodos semelhantes, também medido anteriormente função de SERT como 3 absorção de H-5-HT no rato BBMVs intestinais 6. No entanto, a preparação de vesículas de membrana de plasma puro requer uma grande quantidade de tecido de mucosa. Outros métodos, tais como o radiographic visualização de locais de recaptação 3 H-5-HT, têm também sido mostrado anteriormente na cobaia e de ratazana intestino delgado 7. A câmara Ussing proporciona um sistema mais fisiológico para medir o transporte de iões, nutrientes, e medicamentos através de vários tecidos epiteliais. A principal vantagem da técnica de câmara Ussing é que ele permite a medição precisa dos parâmetros eléctricos e de transporte de intacta, epitélio intestinal polarizada. Além disso, para minimizar a influência do sistema neuromuscular intrínseca, de decapagem seromuscular da mucosa intestinal pode ser realizada para investigar a regulação dos transportadores no epitélio 8. Nós demonstramos que as células Caco-2 cultivadas em 3D na proteína gelatinosa formar um lúmen oco que expressam marcadores apical e basolateral distintas. Estas células apresentam maior expressão de SERT do que as células Caco-2 2D. Métodos para cultivar células em 3D e perform imunocoloração ou extração de RNA e de proteínas são descritos. Além disso, descrevemos métodos para estudar a função SERT e regulação dos TGF-β1, uma citocina pleiotropic, na mucosa do intestino delgado, utilizando uma técnica de câmara de Ussing.

<table><tbody><tr><td>10x PBS</td><td>ATCC</td><td>ATCC&reg; HTB&tímido; 37&trade;</td><td>Células</td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>Microsope para Imagem Confocal</td></tr><tr><td>3[H]-5-HT&nbsp;</td><td>LabtekII</td><td>152453</td><td>Células de cultura para microscopia</td></tr><tr><td>5-HT&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>70013-032</td><td>Não é uma substância perigosa</td></tr><tr><td>95% O2- 5% CO2 cilindro</td><td>KPL</td><td>71-00-27</td><td>Não é uma substância perigosa</td></tr><tr><td>Ágar (para placas de ágar)</td><td>Fischer</td><td>BP151-100</td><td>Toxicidade aguda, Ora</td></tr><tr><td>Ágar (para eletrodo)</td><td>Sigma</td><td>G7126-1KG</td><td>Não é uma substância perigosa</td></tr><tr><td>Alexa Fluor Faloidina</td><td>Sigma</td><td>C3867-1VL</td><td>Não é uma substância perigosa</td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino (BSA)</td><td>Sigma</td><td>P6148-500G</td><td>Nocivo se ingerido ou inalado</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>LifeTechnologies</td><td>A12380</td><td>Não é uma substância perigosa</td></tr><tr><td>Células Caco-2 Sigma</td><td></td><td>A8806-5G</td><td>Não é uma substância perigosa</td></tr><tr><td>Tampão de lise celular</td><td>Fischer</td><td>BP337-100</td><td>Não é um substância perigosa</td></tr><tr><td>Lâminas Chabered</td><td>Sigma</td><td>S5886-1KG</td><td>Não é uma substância perigosa</td></tr><tr><td>Solução de colágeno tipo 1</td><td>Sigma</td><td>S8045-500G</td><td></td></tr><tr><td>Eletrodos</td><td>Sigma</td><td>S-0876</td><td></td></tr><tr><td>EMEM</td><td>Gibco da Life Technologies</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Soro fetal bovino (FBS)</td> <td>Corning</td><td>356234</td><td>usado como matriz extracelular</td></tr><tr><td>Fluoxetina</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicina</td><td>ATCC</td><td>30-2003 Mídia de</td><td>Cultura</td></tr> de <tr>Células<td>Sinalização Celular de Glicina</td><td>, Danvers, MA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hepes&nbsp;</td><td>Roche</td><td>11836145001</td><td></td></tr><tr><td>Indometacina</td><td>Gibco da Life Technologies</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Gibco da Life Technologies</td><td>15710-064</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Gibco da Life Technologies</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>Ácido L-ascórbico&nbsp;</td>Contador de cintilação <td>líquida 10082147</td><td></td> <td>da Gibco by Life</td></tr><tr><td>Technologies&nbsp;</td><td>Gibco by Life Technologies</td><td>70013--032</td><td></td></tr><tr><td>LSM710 Meta</td><td>Physiologic Instruments, San Diego, CA&nbsp;</td><td>EM-CSYS-8</td><td></td></tr><tr>Instrumentos Fisiológicos<td>de Manitol</td><td>, San Diego, CA&nbsp;</td><td>P2304</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Physiologic Instruments, San Diego, CA&nbsp;</td><td>VCC MC8</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Physiologic Instruments, San Diego, CA&nbsp;</td><td>DM MC6</td><td></td></tr><tr><td>Multicanal Tensão/corrente Clamp</td><td>Physiologic Instruments, San Diego, CA&nbsp;</td><td>P2300</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Physiologic Instruments, San Diego, CA&nbsp;</td><td>P2023-100</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific, Hampton, NH</td><td>BP1423</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>Soro de cabra normal (NGS, 10%)</td><td>Fisher Scientific, Hampton, NH</td><td>S233</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeído (PFA)</td><td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO</td><td>P288</td><td></td></tr><tr><td>Pen-Strp</td><td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO</td><td>C3881</td><td></td></tr><tr><td>Reagente de ensaio de proteína</td><td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO</td><td>10420</td><td></td></tr><tr><td>Coquetel de inibidor de proteinase</td><td>MEDOX, Chicago, IL&nbsp;</td><td>estilo G- 12300</td><td></td></tr><tr><td>RNA easy Mini kit</td><td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO</td><td>M4125</td><td></td></tr><tr><td>Módulo de Entrada de Eletrodo de Canal Único&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO</td><td>A92902</td><td></td></tr><tr><td>Controles deslizantes para câmaras snapwell</td><td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO</td><td>H9523</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de sódio (Na2HPO4)</td><td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO</td><td>F132</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de sódio (NaOH)</td><td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO</td><td>T7039</td><td></td></tr><tr><td>TGF-&beta; 1</td><td>Perkin-Elmer, Waltham, MA</td><td>NFT1167250UC</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Packard Instruments, Downers Grove, IL</td><td>B1600</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina EDTA</td><td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO</td><td>221473</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Bio Rad Laboratories, Hércules, CA</td><td>5000006</td><td></td></tr><tr><td>Câmara de Ussing (somente câmara)</td> <td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO</td><td>I7378</td><td></td></tr><tr><td>Sistemas de Câmara Ussing</td><td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO</td><td>A1296</td><td></td></tr></tbody></table>

métodos de estudo epitelial transporte função das proteínas e expressão em native intestino e caco-2 células cultivadas em 3d

Methods to Study Epithelial Transport Protein Function and Expression in Native Intestine and Caco-2 Cells Grown in 3D

O epitélio intestinal tem importantes funções de transporte e de barreira que desempenham um papel-chave nas funções fisiológicas normais do corpo, proporcionando uma barreira para partículas estranhas. transporte epitelial prejudicada (íon, nutrientes, ou drogas) tem sido associada a muitas doenças e pode ter consequências que ultrapassam as funções fisiológicas normais dos transportadores, como por influenciar a integridade do epitélio e o microbioma intestinal. Compreendendo a função e a regulação das proteínas de transporte é crítico para o desenvolvimento de intervenções terapêuticas melhoradas. O maior desafio no estudo do transporte epitelial é o desenvolvimento de um sistema modelo adequado que recapitula características importantes das células epiteliais intestinais nativas. Vários modelos in vitro de cultura de células, tais como células Caco-2, T-84, e células HT-29-Cl.19A são normalmente utilizados em pesquisa de transporte epitelial. Estas linhas celulares representam uma abordagem reducionista para modelar o epithelium e têm sido utilizados em vários estudos mecanicistas, incluindo o seu exame de interacções epiteliais-microbiana. No entanto, as monocamadas de células não reflectem com precisão as interacções célula-célula e o microambiente in vivo. As células cultivadas em 3D mostraram-se promissores modelos para estudos de permeabilidade de drogas. Mostra-se que as células Caco-2 em 3D podem ser utilizados para estudar os transportadores epiteliais. É também importante que os estudos em células Caco-2 são complementados com outros modelos para excluir efeitos específicos de células e para ter em conta a complexidade do intestino nativo. Vários métodos têm sido anteriormente utilizados para avaliar a funcionalidade de transportadores, como o saco evertido e absorção nas células epiteliais isolados ou em vesículas da membrana do plasma isoladas. Levando em consideração os desafios no campo com respeito a modelos ea medição da função de transporte, demonstramos aqui um protocolo para crescer células Caco-2 em 3D e descrevem o uso de uma câmara Ussing como umabordagem eficaz para medir o transporte da serotonina, como no epitélio intestinal polarizadas intactas.

A imunocoloração em 3D Caco-2 cistos é mostrado na Figura 1. Uma imagem representativa de um plano XY mostrando lúmen bem demarcadas do cisto 3D coradas com faloidina actina é representado na Figura 1A. O lado voltado para o lúmen denota o lado apical. As células epiteliais de cultura em resultado ambiente 3D num fenótipo epitelial robusto. Diferentes células Caco-2 cistos no dia 12, quando a actina e SERT foram co-corados, são mostradas na Figur...

Nós descrevemos métodos simples para o estudo da regulação da função intestinal transportador de serotonina (SERT) e de expressão, utilizando um modelo in vitro de células de cultura de células Caco-2 cultivadas em 3D e um modelo ex vivo de intestino de rato. Estes métodos são aplicáveis ​​para o estudo de outros transportadores epiteliais.

Métodos de estudo epitelial Transporte função das proteínas e Expressão em Native Intestino e Caco-2 células cultivadas em 3D

The intestinal epithelium has important transport and barrier functions that play key roles in normal physiological functions of the body while providing ...

O objetivo geral deste protocolo é cultivar células intestinais Caco-2 em três dimensões e demonstrar o uso da câmara de Ussing em estudos sobre a regulação do transportador de serotonina. Os métodos apresentados aqui podem responder perguntas-chave na área de transporte epitelial, como a forma pela qual o transportador intestinal de serotonina, SERT, é regulado. A principal vantagem do modelo Caco-2 tridimensional é que ele reflete as interações célula-célula e célula-matriz extracelular de maneira mais precisa do que as monocamadas.E a técnica de câmara de Ussing permite medidas precisas da função de transporte no epitélio intestinal. A implicação do uso de culturas Caco em 3D se estende para a descoberta de terapêuticas, pois esses modelos permitem a triagem de agentes contra doenças associadas à função de transporte alterada. Embora este método forneça informações sobre a regulação do transportador de serotonina, ele também pode ser aplicado a estudos de outros transportadores de eletrólitos, como os de sódio e cloreto.A demonstração visual dessas técnicas é fundamental, pois a remoção da camada seromuscular e o posicionamento da mucosa intestinal em câmaras de Ussing são difíc

methods-to-study-epithelial-transport-protein-function-expression

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Muitas aplicações terapêuticas necessitam de transporte seguro e eficiente de transportadores de drogas e suas cargas através das barreiras celulares no organismo. Este artigo descreve uma adaptação de métodos estabelecidos para avaliar a taxa e o mecanismo de transporte da droga nanocarriers (NCS) através das barreiras celulares, tais como o tracto gastrointestinal (GI) epitélio.

Modelos e Métodos para avaliar Transporte de Drug Delivery Systems através das barreiras celulares

As células Caco-2 podem servir como um modelo in vitro para estudar o transporte de lipídios por enterócitos e drogas/vitaminas lipossolúveis. O sistema de membrana permeável separa o compartimento apical do basolateral, enquanto o sistema de expressão de lentivírus oferece um método eficaz de superexpressão gênica. O isolamento das lipoproteínas é confirmado por TEM.

Usando Caco-2 em células para estudo LIPID Transportes pelo intestino

Apresentamos os protocolos para isolamento de estruturas 3D intestinais do tecido em vivo e em vitro matriz de porão embutido organoids e fixação de diferentes detalhes e protocolos otimizados para imuno-rotulagem dos microtúbulos, de coloração proteínas centrosomal e juncionais, bem como célula marcadores incluindo a proteína de células-tronco Lgr5.

Imuno-fluorescente rotulagem de microtúbulos e proteínas Centrosomal em tecido Intestinal Ex Vivo e 3D em Vitro Intestinal Organoids

Este protocolo descreve a medição da permeabilidade da barreira epitelial em tempo real seguir tratamento farmacológico em organoids intestinal humana, usando microscopia fluorescente e vive microscopia de célula.

Medição em tempo real da permeabilidade da barreira epitelial no Organoids Intestinal humana

Aqui são apresentados dois métodos para determinar a função de barreira intestinal. Um medidor epitelial (volts/ohms) é usado para a medição da resistência elétrica transepitelial de epitélios cultivadas diretamente nos poços de cultura de tecidos. Nos ratos, o método de gavage FITC-dextrano é usado para determinar a permeabilidade intestinal na vivo.

In Vitro e In Vivo de abordagens para determinar a permeabilidade da célula epitelial Intestinal

Aqui, apresentamos um protocolo para a cultura humana enteroid ou monocamadas de colonoid que têm a função de barreira intacta para estudar interações de epitélio-microbiota de acolhimento a nível celular e bioquímico.

Colonoid humana monocamadas para estudar interações entre epitélio Intestinal do hospedeiro, comensais e patógenos

Aqui descrevemos uma técnica para quantificar a integridade da barreira de pequenos organóides intestinais. O fato de o método ser baseado em organóides vivos permite a investigação sequencial de diferentes substâncias moduladoras de integridade de barreira ou combinações dos mesmos de forma resolvida pelo tempo.

Investigando a quebra da barreira intestinal em organóides vivos

Aqui, descrevemos a preparação de monocamadas epiteliais intestinais derivadas de organoides humanos para estudar a função da barreira intestinal, a permeabilidade e o transporte. Como os organoides representam a resposta original do tecido epitelial a estímulos externos, esses modelos combinam as vantagens da expansão das linhas celulares e a relevância e complexidade do tecido primário.

Monocameira epitelial derivada organoide: um modelo in vitro clinicamente relevante para a função da barreira intestinal

Aqui apresentamos dois protocolos que permitem a modelagem de interações apical-específicas intestinais. Monocamadas intestinais derivadas de organoides e culturas de Interface Ar-Líquido (ALI) facilitam a geração de epitélio bem diferenciadas acessíveis tanto de lados luminosos quanto basolaterais, enquanto as organoides intestinais invertidas pela polaridade expõem seu lado apical e são favoráveis a ensaios de alto rendimento.

Métodos culturais para estudar interações específicas apical usando modelos organoides intestinais

Este estudo descreve um protocolo para gerar monocamadas 2D de organoides suínos derivados dos intestinos delgado e grosso. O crescimento dessas monocamadas é marcado pelo aumento dos valores de TEER, indicando integridade epitelial robusta. Além disso, essas monocamadas exibem respostas secretoras fisiológicas em experimentos de câmara de Ussing após a aplicação de forscolina.

Organoides intestinais suínos bidimensionais refletindo as propriedades fisiológicas do intestino nativo

Aprenda a cultivar células Caco-2 em 3D e a usar a câmara de Ussing para estudar a regulação do transportador de serotonina SERT no intestino. Esses métodos avançam a pesquisa em biologia do transporte epitelial.

Métodos de estudo epitelial Transporte função das proteínas e Expressão em Native Intestino e Caco-2 células cultivadas em 3D

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