Métodos de estudo epitelial Transporte função das proteínas e Expressão em Native Intestino e Caco-2 células cultivadas em 3D

O objetivo geral deste protocolo é cultivar células intestinais Caco-2 em três dimensões e demonstrar o uso da câmara de Ussing em estudos sobre a regulação do transportador de serotonina. Os métodos apresentados aqui podem responder perguntas-chave na área de transporte epitelial, como a forma pela qual o transportador intestinal de serotonina, SERT, é regulado. A principal vantagem do modelo Caco-2 tridimensional é que ele reflete as interações célula-célula e célula-matriz extracelular de maneira mais precisa do que as monocamadas.

E a técnica de câmara de Ussing permite medidas precisas da função de transporte no epitélio intestinal. A implicação do uso de culturas Caco em 3D se estende para a descoberta de terapêuticas, pois esses modelos permitem a triagem de agentes contra doenças associadas à função de transporte alterada. Embora este método forneça informações sobre a regulação do transportador de serotonina, ele também pode ser aplicado a estudos de outros transportadores de eletrólitos, como os de sódio e cloreto.

A demonstração visual dessas técnicas é fundamental, pois a remoção da camada seromuscular e o posicionamento da mucosa intestinal em câmaras de Ussing são difíceis de aprender. A demonstração dos procedimentos com células Caco-2 tridimensionais será realizada por Ishita Chatterjee, instrutora, e Anoop Kumar, pesquisador pós-doutorando do nosso grupo. A demonstração da remoção da camada seromuscular do íleo de camundongo será realizada por Sangeeta Tyagi, especialista sênior em pesquisa do meu laboratório.

Também demonstrarão o preparo da mucosa desepitelizada e sua inserção em câmaras de Ussing Shubha Priyamvada e Arivarasu Natarajan, instrutores do meu laboratório. Para começar, descongele a solução proteica gelatinosa com fatores de crescimento reduzidos durante a noite sobre gelo em um refrigerador a quatro graus Celsius. Após o descongelamento, prepare alíquotas de um mililitro ou 500 microlitros.

No dia do cultivo, preencha previamente as lâminas com câmaras sobre gelo. Em seguida, adicione 30 microlitros da solução proteica gelatinosa a cada poço da lâmina de vidro com oito poços e espalhe uniformemente. Ao semear a mistura gelatinosa na lâmina com câmara ou em placas, deve-se ter cuidado para evitar a formação de bolhas, pois as células podem se destacar.

Coloque a placa cultivada dentro de uma incubadora de cultura celular a 37 graus Celsius por 15 a 30 minutos para permitir que a solução solidifique. Em seguida, utilizando tripsina, desprenda as células Caco-2 confluentes de um frasco de cultura. Depois, conte as células em um hemocitômetro e centrifugue-as a 500 vezes g a quatro graus Celsius por cinco minutos.

Re-suspenda o pellet celular resultante em meio 3D Caco-2 para obter uma suspensão com a densidade desejada. Usando a suspensão celular preparada, semeie 4.000 células por poço em lâminas de câmara de vidro e deixe crescer por 12 a 14 dias em uma incubadora úmida com 5% de dióxido de carbono a 37 graus Celsius. Para corar as células, primeiro aspire o meio e fixe as células com 400 microlitros de PFA a 2%.

Continue o fixação das células por 20 minutos à temperatura ambiente. Após lavar as células duas vezes em PBS, permeabilize-as com solução de Triton a 0,5% em PBS por não mais de 15 minutos. Enxágue as células duas vezes em tampão de glicina em PBS e, em seguida, lave as células permeabilizadas em tampão IF por dez minutos à temperatura ambiente.

Bloqueie as células usando soro normal de cabra a 5% no tampão IF. Em seguida, incube as células com 200 microlitros de anticorpo primário diluído no tampão IF suplementado com soro de cabra a 1% por uma a duas horas à temperatura ambiente. Após a incubação, lave as células três vezes com o tampão IF.

Incube as células lavadas com 200 microlitros de anticorpo secundário diluído em tampão IF suplementado com 1% de soro de cabra por uma hora à temperatura ambiente. Lave as células com tampão IF três vezes por dez minutos. Para destacar a câmara do lâmina de vidro, coloque primeiro a lâmina no suporte do porta-lâminas, depois deslize o elevador branco através do suporte até que entre em contato com a borda dos poços.

Puxe suavemente a câmara para removê-la da lâmina. Utilize uma caixa preta coberta para proteger as lâminas da luz. Monte as lâminas com meio antidesvanecimento lento e cubra-as com lamínulas.

Após deixar as lâminas secarem por dez minutos em temperatura ambiente, sêlalas com esmalte antes da aquisição de imagens. Isole o íleo de camundongo seguindo o procedimento descrito no protocolo textual. Em seguida, usando tesoura, abra o intestino longitudinalmente.

Incube o corte tecidual resultante em tampão KBR gelado e arejado, contendo um micromolar de indometacina, durante dez minutos. Fixe um segmento intestinal de aproximadamente um centímetro de comprimento, com o lado mucoso voltado para baixo, em uma placa contendo agarose a 7% ou elastômero de silicone curado, com espessura de 0,5 centímetro. Utilizando um microscópio estereoscópico de dissecação com iluminação inferior, remova as camadas seromusculares.

Em seguida, corte a camada seromuscular com uma lâmina de bisturi em forma de pena. Use pinças finas para levantar a borda da camada ao longo do eixo longitudinal do intestino. Por fim, monte cuidadosamente a mucosa nos pinos do suporte.

Segure o tecido mucoso desepitelizado pelas bordas para evitar rasgos. Ao montar a mucosa ileal desepitelizada nos pinos do suporte, devem-se tomar precauções para evitar rasgar o tecido nas cabeças dos pinos e para minimizar danos às bordas do tecido. Antes do tratamento do tecido, prepare a solução de Krebs borbulhada com 95%oxigênio, 5%dióxido de carbono.

Em seguida, despeje a solução em uma câmara de Ussing. Adicione 10 micromolares de glicose como substrato energético ao banho seroso e 10 micromolares de manitol para manter o equilíbrio osmótico ao banho mucoso. Posteriormente, insira o suporte com a mucosa montada na câmara para expor ambos os lados apical e basolateral do tecido à solução de Krebs.

Equilibre o tecido ileal no banho por dez minutos. Em seguida, pretrate o lado apical com fluoxetina 10 micromolar por 30 minutos para a medição do fluxo da mucosa para a serosa. Por fim, trate o lado basolateral do tecido com TGF beta 1 a 10 nanogramas por mililitro por uma hora e, então, incube o lado apical com 5-HT tritiado 20 nanomolar por 30 minutos.

Para calcular as taxas de fluxo da mucosa para a serosa, colete alíquotas de 0,75 mililitro do reservatório seroso, substituindo-as por volumes idênticos do meio de banho para evitar diferenças de pressão hidrostática através da mucosa. Para quantificar a 5-HT tritiada acumulada no tecido, remova a mucosa do suporte. Lave-a uma vez com tampão KRB gelado e coloque-a em um tubo de cultura de vidro.

Incube a mucosa em 0,5 mililitros de KOH a 10% durante a noite a 37 graus Celsius para lisar o tecido. Em seguida, meça a radioatividade em alíquotas de 150 microlitros dos lisados em triplicata utilizando um contador de cintilação líquida. Utilizando o método de Bradford, meça a concentração de proteína em alíquotas de três a cinco microlitros dos lisados.

Mostram-se aqui cistos de Caco-2 cultivados em cultura 3D corados para actina e cistos 3D de Caco-2 corados simultaneamente para actina, núcleos e proteína SERT. A SERT é visível na membrana luminal e em compartimentos subapicais. Para confirmar ainda mais a vantagem das esferas 3D de Caco-2 em relação aos monocamadas 2D de Caco-2, foi realizada uma análise por western blot da expressão da proteína SERT.

Os resultados mostraram a expressão aumentada da proteína SERT em esferas tridimensionais de Caco-2 em comparação com células Caco-2 bidimensionais. Por fim, um sistema de câmara de Ussing foi utilizado para demonstrar que o TGF beta aumenta o fluxo da mucosa para a serosa, refletindo a captação aumentada de 5-HT a partir da membrana luminal e o acúmulo aumentado de 5-HT observado na mucosa ileal. Essas descobertas são apoiadas pela sensibilidade observada da captação de 5-HT ao tratamento com fluoxetina, que corresponde à expressão de SERT na membrana luminal.

Uma vez dominada, esta técnica de dissecção e montagem da mucosa ileal pode ser concluída em 15 minutos. Ao adotar este procedimento, é importante lembrar que, após a remoção do animal, o preparo intestinal extravivo tem viabilidade limitada e pode durar até três horas. Cistos tridimensionais de Caco-2 podem ser utilizados em diversos estudos, como eventos de tráfego de membrana, expressão gênica ou interação proteína-proteína de transportadores epiteliais.

Após seu desenvolvimento, a técnica 3D de Caco-2 abre caminho para pesquisadores na área de transporte intestinal explorarem o movimento de fluidos e estudarem a fisiopatologia de doenças intestinais. Não se esqueça de que trabalhar com radioatividade pode ser extremamente perigoso, e precauções, como o uso de EPIs e procedimentos adequados de descontaminação, devem sempre ser tomadas. Após assistir a este vídeo, você será capaz de cultivar células Caco-2 em culturas 3D e utilizar essas culturas para investigar a expressão de transportadores epiteliais.

Você também poderá utilizar a câmara de Ussing para estudar a função de transporte de serotonina no intestino nativo do camundongo.