Métodos de estudo epitelial Transporte função das proteínas e Expressão em Native Intestino e Caco-2 células cultivadas em 3D

O objetivo geral deste protocolo é cultivar células Caco-2 intestinais em três dimensões e demonstrar o uso da câmara de Ussing em estudos sobre a regulação do transportador de serotonina. Os métodos mostrados aqui podem responder a questões-chave no campo do transporte epitelial, como a forma como o transportador intestinal de serotonina, SERT, é regulado. A principal vantagem do 3D Caco-2 é que eles refletem as interações célula a célula e célula a matriz extracelular com mais precisão do que as monocamadas.

E a técnica da câmara de Ussing permite medições precisas da função de transporte no epitélio intestinal. A implicação das culturas 3D, Caco, se estende à descoberta de terapias porque esses modelos permitem a triagem de agentes contra doenças associadas à função de transporte alterada. Embora esse método forneça informações sobre a regulação do transportador de serotonina, ele também pode ser aplicado a estudos de outros transportadores de eletrólitos, como sódio e cloreto.

A demonstração visual dessas técnicas é fundamental, pois a remoção da camada soromuscular e a montagem da mucosa intestinal nas câmaras de Ussing são difíceis de aprender. Demonstrando os procedimentos da célula 3D Caco-2 estarão Ishita Chatterjee, instrutor, e Anoop Kumar, um pós-doutorado do nosso grupo. Demonstrando a remoção da camada soromuscular do íleo do camundongo estará Sangeeta Tyagi, especialista sênior em pesquisa do meu laboratório.

Também demonstrando a montagem de mucosa removida e inserindo-a nas câmaras de Ussing estarão Shubha Priyamvada e Arivarasu Natarajan, instrutores do meu laboratório. Para começar, descongele a solução de proteína gelatinosa reduzida pelo fator de crescimento durante a noite no gelo em uma geladeira de quatro graus Celsius. Depois de descongelado, prepare um mililitro ou alíquotas de 500 microlitros.

No dia da cultura, pré-resfrie as lâminas com câmara no gelo. Em seguida, adicione 30 microlitros da solução de proteína gelatinosa a cada poço da lâmina de vidro com câmara de oito poços e espalhe-a uniformemente. Ao revestir a mistura gelatinosa na lâmina da câmara ou nas placas, deve-se tomar cuidado para evitar a formação de bolhas, pois as células podem se desprender.

Coloque a placa cultivada dentro de uma incubadora de cultura de células a 37 graus Celsius por 15 a 30 minutos para permitir que a solução solidifique. Em seguida, usando tripsina, retire as células Caco-2 confluentes de um frasco de cultura. Em seguida, conte as células em um hemocitômetro e centrifugue-as a 500 vezes g a quatro graus Celsius por cinco minutos.

Ressuspenda o pellet celular resultante em meio 3D Caco-2 para obter a suspensão da densidade desejada. Usando a suspensão celular preparada, semeie 4.000 células por poço nas lâminas da câmara de vidro e deixe-as crescer por 12 a 14 dias em uma incubadora umidificada com 5% de dióxido de carbono a 37 graus Celsius. Para corar as células, primeiro aspire o meio e fixe as células com 400 microlitros de 2% de PFA.

Continue fixando as células por 20 minutos em temperatura ambiente. Depois de lavar as células duas vezes em PBS, permeabilize-as com solução de Triton a 0,5% em PBS por no máximo 15 minutos. Enxágue as células duas vezes em tampão de glicina PBS e, em seguida, lave as células permeabilizadas em tampão IF por dez minutos em temperatura ambiente.

Bloqueie as células usando 5% de soro de cabra normal em tampão IF. Em seguida, incube as células com 200 microlitros de anticorpo primário diluído em tampão IF suplementado com soro de cabra a 1% por uma a duas horas em temperatura ambiente. Após a incubação, lave as células três vezes com tampão IF.

Incubar células lavadas com 200 microlitros de anticorpo secundário diluído em tampão IF suplementado com soro de cabra a 1% por uma hora em temperatura ambiente. Lave as células com tampão IF três vezes por dez minutos. Para soltar a câmara da lâmina de vidro, primeiro coloque a lâmina no suporte da base da lâmina e, em seguida, deslize o elevador branco pelo suporte até entrar em contato com a borda dos poços.

Puxe suavemente a câmara para removê-la da lâmina. Use uma caixa preta coberta para proteger os slides da luz. Monte os slides com meio anti-desbotamento lento e cubra-os com lamínulas.

Depois de deixar as lâminas secarem por dez minutos em temperatura ambiente, sele-as com esmalte antes da imagem. Isole o íleo do camundongo seguindo o procedimento descrito no protocolo de texto. Em seguida, usando uma tesoura, abra o intestino longitudinalmente.

Incube a seção de tecido resultante em tampão KBR de gaseificação gelada contendo uma indometacina micromolar por dez minutos. Prenda uma seção intestinal de aproximadamente um centímetro de comprimento, com a mucosa voltada para baixo, a uma placa contendo 0,5 centímetro de espessura 7% agarose ou elastômero de silicone curado. Usando um microscópio estéreo de dissecção com iluminação inferior, retire as camadas seromusculares.

Em seguida, corte a camada seromuscular com uma lâmina de bisturi de penas. Use uma pinça fina para levantar a borda da camada ao longo do eixo longitudinal do intestino. Por fim, monte a mucosa com cuidado nos pinos do controle deslizante.

Segure o tecido mucoso descascado pelas bordas para evitar rasgos. Ao montar a mucosa ilial descascada nos pinos do controle deslizante, devem ser tomadas precauções para evitar rasgar o tecido nas cabeças dos pinos e minimizar os danos às bordas do tecido. Antes do tratamento do tecido, prepare a solução de Krebs gaseificada com 95% de oxigênio e 5% de dióxido de carbono.

Em seguida, despeje a solução em uma câmara de Ussing. Adicione 10 micromolares de glicose como substrato energético ao banho seroso e 10 micromolares de manitol para manter o equilíbrio osmótico do banho mucoso. Em seguida, insira o controle deslizante com a mucosa montada na câmara para expor os lados apical e basolateral do tecido à solução de Krebs.

Equilibre o tecido ileal no banho por dez minutos. Em seguida, pré-trate o lado apical com fluoxetina 10 micromolar por 30 minutos para a medição do fluxo mucoso para seroso. Por fim, trate o lado basolateral do tecido com 10 nanogramas por mililitro de TGF beta 1 por uma hora e, em seguida, incube o lado apical com 20 nanomolares tritiados 5-HT por 30 minutos.

Para calcular as taxas de fluxo mucoso para seroso, colete alíquotas de 0,75 mililitro do reservatório de serosal, substituindo-as por volumes idênticos do meio de banho para evitar diferenças de pressão hidrostática na mucosa. Para quantificar o 5-HT tritiado acumulado no tecido, remova a mucosa do controle deslizante. Lave-o uma vez com tampão KRB gelado e coloque-o em um tubo de cultura de vidro.

Incube a mucosa em 0,5 mililitros de 10% KOH durante a noite a 37 graus Celsius para lisar o tecido. Em seguida, medir a radioactividade em alíquotas de 150 microlitros dos lisados em triplicata, utilizando um contador de cintilação líquida. Usando o método de Bradford, medir a concentração de proteínas em alíquotas de três a cinco microlitros dos lisados.

Aqui são mostrados cistos Caco-2 cultivados em cultura 3D corados para actina e cistos Caco-2 3D corados simultaneamente para actina, núcleos e proteína SERT. O SERT é visível na membrana luminal e nos compartimentos subapicais. Para confirmar ainda mais a vantagem das esferas 3D de Caco-2 sobre as monocamadas de Caco-2 2D, foi realizada uma análise de western blot da expressão da proteína SERT.

Os resultados mostraram a expressão aumentada da proteína SERT nas esferas Caco-2 3D em comparação com as células Caco-2 2D. Finalmente, um sistema de câmara de Ussing foi usado para mostrar que o TGF beta aumenta o fluxo mucoso para serosal, refletindo o aumento da captação de 5-HT da membrana luminal e o aumento do acúmulo de 5-HT observado na mucosa ileal. Tais achados são apoiados pela sensibilidade observada da captação de 5-HT ao tratamento com fluoxetina que corresponde à expressão de SERT na membrana luminal.

Uma vez dominada, esta técnica de remoção e montagem da mucosa ileal pode ser concluída em 15 minutos. Ao adotar esse procedimento, é importante lembrar que, após a retirada do animal, a preparação intestinal extravio tem viabilidade limitada e pode durar até três horas. Os cistos 3D Caco-2 podem ser utilizados para vários estudos, como eventos de tráfego de membrana, expressão gênica ou interação proteína-proteína de transportadores epiteliais.

Após seu desenvolvimento, a técnica 3D Caco-2 abre caminho para pesquisadores da área de transporte intestinal explorarem o movimento de fluidos e estudarem a fisiopatologia das doenças darais. Não se esqueça de que trabalhar com radioatividade pode ser extremamente perigoso, e precauções como o uso de EPI e procedimentos adequados de descontaminação devem sempre ser tomadas. Depois de assistir a este vídeo, você poderá cultivar células Caco-2 em culturas 3D e utilizar essas culturas para investigar a expressão do transportador epitelial.

Você também poderá utilizar a câmara de Ussing para estudar a função de transporte de serotonina no intestino de camundongo nativo.