Um método de extração e análise de lipídios para caracterizar micróbios de solo em experimentos com muitas amostras

O objetivo deste vídeo é descrever um método que aumenta a produtividade, equilibrando esforço e precisão, para a extração de lipídios das membranas celulares de microrganismos, com o uso na caracterização dos lipídios totais e da abundância relativa de lipídios indicadores para determinar a estrutura da comunidade microbiana do solo e em estudos com muitas amostras. No campo, você deve considerar a heterogeneidade do solo ao coletar amostras de maneira que represente seu local. Para preservar a comunidade microbiana no momento da coleta, as amostras devem ser transportadas do campo em gelo.

De volta ao laboratório, remova as raízes e pedras e desagregue os torrões por meio de peneiramento grosso. Isso também serve para homogeneizar sua amostra. Prepare para liofilização colocando subamostras em recipientes apropriados e liofilize o mais rápido possível.

Uma vez que os solos estejam liofilizados, armazene-os em um recipiente fechado com dessecante até a extração. O ideal é armazenar os solos liofilizados a 80 graus C. Como preparação para a extração, retire os solos liofilizados do armazenamento e triture-os. Os métodos de trituração incluem moinho de bolas, medidor de bolas ou almofariz e pistilo.

Após moer novamente o solo, homogeneíze bem as amostras de solo e armazene-as no congelador. Todo o material de laboratório deve estar impecavelmente limpo. Qualquer resíduo de detergente, graxa ou sujeira pode afetar os resultados, aparecendo como um pico no cromatograma final de GC.

As extrações são realizadas em tubos de centrífuga de teflon de 30 mililitros, que devem ser lavados com solvente. Adicione dois a três mililitros de hexano aos tubos e vortex por alguns segundos. Decante o hexano para outro tubo e vortex.

De dois a três mililitros de hexano podem ser usados para lavar em série seis tubos. Armazene os tubos lavados com hexano de cabeça para baixo na cabine de exaustão e descarte o hexano usado em um recipiente apropriado para resíduos. O material de vidro pode ser aquecido em mufla ou lavado com solvente imediatamente antes do uso.

O encharcamento garante a limpeza da vidraria por meio da oxidação de resíduos em alta temperatura. Envolva a vidraria em duas a três camadas de papel alumínio e coloque-a no forno de mufla. Ajuste para 450 graus C; uma vez que o forno atinja o ponto desejado, mantenha-a aquecida por no mínimo 4 1/2 horas.

Deixe esfriar por pelo menos uma hora antes de retirar do forno. Rotule e pese os tubos de teflon lavados com hexano. Adicione o solo nos tubos de centrífuga de teflon e pese novamente para determinar a massa do solo.

Prepare sempre pelo menos dois brancos por lote e inclua um padrão de verificação, preferencialmente um solo que já tenha sido extraído anteriormente, caso deseje verificar se a extração funcionou corretamente. Extrações de lipídios. Prepare três pipetas de reutilização de cinco a 10 mililitros para tampão fosfato, clorofórmio e metanol.

O clorofórmio é um líquido muito denso com baixa tensão superficial. Tenha cuidado para que a quantidade dispensada seja precisa e consistente. Mantenha o frasco com pelo menos metade do volume preenchido com líquido.

No capuz de exaustão, adicione os reagentes ao solo no tubo de teflon na seguinte ordem: tampão fosfato, clorofórmio e metanol. Esta é a primeira extração física de lipídios a partir do seu material amostral. As receitas para as soluções de reagentes estão incluídas no protocolo escrito.

As proporções dos solventes e a ordem de adição são importantes para a separação adequada das fases orgânica e aquosa. Deixe o solo hidratar-se por algum tempo após a adição do tampão antes de adicionar o clorofórmio. Se for conveniente, os extratores podem ser combinados e adicionados como uma única alíquota para a segunda e quaisquer extrações subsequentes.

Tampe bem os tubos de teflon e cubra-os para proteger da luz. Coloque-os no agitador na posição horizontal, certificando-se de que estejam bem fixados. Agite na velocidade alta durante uma hora.

Enquanto os tubos estiverem em agitação, prepare dois tubos de vidro longos para cada amostra da seguinte forma. Rotule o tubo, adicione o mesmo volume de clorofórmio que foi adicionado ao solo e um volume igual de tampão fosfato. Após remover os tubos de teflon do agitador, centrifugue os tubos a 25 °C por 10 minutos a 2.500 RPM.

Em seguida, na capela com as luzes apagadas, decante o sobrenadante do tubo de teflon para um dos tubos longos. A separação de fases deve ser visível no tubo de vidro. A camada inferior contém o solvente orgânico, principalmente clorofórmio, e os lipídios.

Essa extração é repetida. Despeje o sobrenadante no segundo tubo preparado anteriormente. Agora você extraiu fisicamente os lipídios do solo duas vezes.

Para a maioria dos solos, isso é adequado. Tampe firmemente todos os tubos longos com tampas revestidas de teflon e inverta 10 vezes para misturar. Separe as fases por gravidade durante a noite.

Deixe as amostras em repouso, sem perturbação, durante a noite para completar a separação das duas fases. Para isso, mantenha as amostras em um armário escuro ou cobertas com papel alumínio à temperatura ambiente. É aceitável deixar os extratos separando durante o fim de semana.

Dia dois, isolamento de lipídios. No dia dois, a camada aquosa é aspirada e os lipídios são concentrados pela remoção do solvente em um sistema de evaporação a vácuo. As amostras também podem ser secas colocando-as em banho-maria ou em banho de areia e aplicando um fluxo suave de nitrogênio.

O líquido nos tubos agora deve estar bem separado e em grande parte claro. Caso contrário, ou se a interface entre as duas camadas for especialmente espessa, permita que a separação continue por mais um dia. Monte um aspirador a vácuo na capela.

Este é um frasco com braço lateral conectado a uma bomba de vácuo com uma tubulação de Tygon em forma de folha e uma pipeta de Pasteur. Com a bomba em funcionamento, utilize a pipeta para retirar a fase aquosa para dentro do frasco. Aspire a camada superior e a interface.

Isso será aproximadamente a dois terços do caminho para baixo. Faça isso com os dois ou três conjuntos de tubos de vidro. A camada superior pode conter algumas partículas de solo.

Remova-os, se possível. Combine o extrato do segundo e/ou terceiro conjunto de tubos com o dos dois primeiros, decantando cuidadosamente. Tente evitar derramar qualquer material sólido e enxágue as paredes do tubo girando-o.

Utilize uma pipeta limpa para cada amostra e repita este processo para as amostras restantes. Depois que os extratos de clorofórmio tiverem sido combinados e permanecido em repouso por alguns minutos, examine a superfície do líquido. Frequentemente, forma-se uma fina camada de água residual.

Se isso estiver presente, aspire antes de prosseguir. A água residual pode atacar as ligações duplas dos ácidos graxos, mas uma quantidade muito pequena deve coevaporar com os solventes durante a secagem das amostras. Seque todas as amostras utilizando o aparelho de evaporação a vácuo.

Tampe bem os tubos e armazene-os em um congelador a 80 graus C. Dia três, saponificação e metilação. Primeiro, ligue os banhos de água. Verifique o nível da água e ajuste o banho um para 95 graus C e o banho dois para 80 graus C. Usando uma repipeta, adicione um mililitro do reagente de saponificação, Reagente 1, aos lipídios secos.

Feche bem, vortexe brevemente e coloque em um suporte. Após concluir esta etapa, coloque o suporte com os tubos no banho-maria a 95 graus C e aguarde cinco minutos. Retire o suporte com os tubos do banho e verifique os tubos quanto a vazamentos.

Isso será indicado por bolhas subindo no tubo, como uma espuma. Aperte novamente ou substitua as tampas dos tubos com vazamento. Continue aquecendo os tubos no banho-maria por mais 10 minutos.

Reduza a temperatura do banho-maria para 80 graus C e continue a incubação por mais 15 minutos. Remova os tubos e resfrie colocando a grade em uma bandeja com água da torneira. Não use água com gelo.

Após o resfriamento das amostras, adicione dois mililitros do reagente de metilação, Reagent 2, a cada amostra. Novamente, tampe bem e vortexie por cinco a 10 segundos. Pode haver formação de sais granulares visíveis como precipitado na solução, o que ocorre às vezes devido ao excesso de reagentes.

Coloque o suporte no banho-maria a 80 graus C e incube por 10 minutos. Retire o suporte com os tubos do banho-maria e coloque-o em uma bandeja com água da torneira para resfriar. Agite o suporte para acelerar o processo de resfriamento.

Usando uma pipeta repetidora, adicione 1,25 mililitros de hexano e éter metil-terc-butílico, Reagente 3, a cada tubo para extrair a fase. Feche bem as tampas e coloque os tubos em um agitador durante 10 minutos. Após a agitação, deixe o suporte com os tubos em repouso por 10 minutos para que as fases se separem.

Transfira a fase orgânica, que agora é a camada superior, para um tubo de vidro curto utilizando uma pipeta Pasteur. O ideal é recuperar a maior parte do líquido. Pequenas quantidades da fase aquosa não comprometerão a extração.

Repita a extração da fase aquosa adicionando o Reagente 3, agitando, deixando as fases separarem e transferindo a fase superior. Dependendo da condição da fase inferior, você pode repetir este passo mais uma vez, totalizando três transferências. Adicione 3 mililitros da lavagem alcalina, Reagente 4, que é uma solução diluída de hidróxido de sódio, aos extratos nos tubos curtos.

Tampe os tubos de ensaio firmemente e vortex por 20 a 30 segundos e, em seguida, centrifugue por três minutos a 2.000 RPM. Após a centrifugação, utilizando uma pipeta Pasteur limpa, aspire a fase orgânica superior e transfira para um frasco âmbar de quatro mililitros. Tenha muito cuidado para não aspirar nenhuma parte da fase aquosa.

O próximo passo é evaporar o solvente até secagem em um aparelho de evaporação a vácuo. Dia quatro, preparando os extratos para análise em CG. Usando a pipeta, adicione 100 microlitros do Reagente 3 a cada um dos frascos de 4 mililitros contendo a fase seca.

Vortex o amostra e, em seguida, deixe-a em repouso por 10 minutos. Usando o segundo pipetador, transfira cuidadosamente os FAMEs em suspensão para um frasco de GC. Adicione outra alíquota do solvente ao frasco de quatro mililitros e vortex brevemente.

Rolando o frasco para garantir que os FAMEs residuais nas paredes do frasco sejam dissolvidos. Usando o segundo pipetador novamente, transfira o solvente para o frasco de CG. Complete a transferência adicionando uma terceira alíquota de solvente ao frasco, vortexando e transferindo para o frasco de CG.

Tampe o vial de CG e armazene no congelador. Armazene os viais de CG vedados no congelador antes da análise. Análise de CG.

Para utilizar este sistema, a análise deve ser realizada usando uma coluna CG específica. O cromatógrafo a gás é equipado com uma entrada split/splitless munida de um revestimento de vidro com diâmetro interno de quatro milímetros e um tampão de lã de vidro desativada. A entrada é ajustada para 250 graus C e opera em modo de pressão constante.

O gás de arraste é o hidrogênio. São necessários nitrogênio e ar como gases auxiliares para o detector. Utiliza-se uma coluna Agilent Ultra 2.

A coluna tem 25 metros de comprimento, diâmetro interno de 2 milímetros e espessura da fase estacionária de 33 micrômetros. A fase estacionária nesta coluna é 5% fenil, 95% metilpolissiloxano, também conhecida como coluna do tipo DB-5. Para analisar os extratos lipídicos, uma alíquota de dois microlitros é injetada em uma razão de divisão de 100:1 com a temperatura do forno em 170 graus C. Após a injeção, programa-se o forno para aumentar cinco graus por minuto até 300 graus C e, em seguida, manter por 12 minutos.

Uma série de injeções do padrão MIDI é realizada e os resultados são utilizados para efetuar ajustes de acordo com as instruções no manual MIDI. Uma vez calibrado dessa forma, o sistema pode necessitar de pequenos ajustes ocasionalmente, mas geralmente deve alcançar bons resultados utilizando esses parâmetros. O sistema MIDI produz um relatório para cada amostra contendo uma tabela com uma linha por pico detectado.

O software relata o tempo de retenção do pico, a área do pico, a identificação do pico, juntamente com o ECL ou comprimento de cadeia estimado, um parâmetro usado para identificação dos picos, e um fator de resposta, um parâmetro utilizado para normalizar variações e a resposta do detector em relação ao tempo de retenção. O ECL expressa onde, entre uma série de ésteres metílicos de ácidos graxos de cadeia reta, cada éster metílico desconhecido elui. Por exemplo, se o tempo de retenção de um composto desconhecido corresponder à metade do intervalo entre os tempos de uma cadeia de 12 e 13 carbonos, o ECL será informado como uma cadeia de 12,5 carbonos.

O software compara o ECL de cada pico com os de FAMEs em uma base de dados e, quando há correspondência, atribui o nome correspondente à substância desconhecida. Nos casos em que dois FAMEs na base de dados possuem ECLs muito próximos, o software informa ambos os nomes, listando primeiro o mais próximo. As tabelas de dados dos relatórios podem ser reunidas em uma planilha ou base de dados.

Após a correção do fator de resposta, as áreas dos picos podem então ser comparadas com a área do pico de um padrão externo ou interno para determinar a concentração do extrato. Ao dividir pela massa de solo extraída, os dados podem ser expressos como massa de FAME por grama de solo ou, utilizando também o peso molecular de cada FAME, como nanomols por grama de solo. Os FAMEs marcadores podem então ser somados para fornecer a biomassa de guildas microbianas, e essas guildas podem ser analisadas mais detalhadamente.

Por exemplo, aqui observamos pradarias não fertilizadas com maior biomassa de FAME do que pradarias fertilizadas. Ambas apresentam mais biomassa do que campos de milho próximos. Além disso, os FAMEs estão associados a grupos funcionais específicos, como fungos ou bactérias.

Essas associações são específicas do ecossistema, portanto, é importante não generalizá-las excessivamente. Esse tipo de análise mostra se certos grupos são mais abundantes em determinados ambientes. Aqui, os fungos são mais abundantes na pradaria não fertilizada do que no campo de milho.

E, finalmente, outra maneira de analisar a composição geral da comunidade microbiana é comparar a abundância relativa de todos os FAMEs simultaneamente, utilizando métodos de ordenação como escalonamento multidimensional não métrico (NMDS) ou análise de componentes principais (PCA). Em uma ordenação, comunidades microbianas mais semelhantes estarão mais próximas entre si. Assim, com base em nossos dados de exemplo, o milho e a pradaria não fertilizada estão muito distantes, enquanto algumas amostras de pradaria fertilizada apresentam comunidades microbianas que se assemelham às do milho e outras se assemelham à pradaria não fertilizada.

As comunidades microbianas são frequentemente altamente variáveis, mesmo dentro de um mesmo ambiente, de modo que nem sempre se separam de forma nítida. Após assistir a este vídeo, espera-se que o espectador tenha uma boa compreensão do processo pelo qual biomarcadores lipídicos das membranas celulares de microrganismos são extraídos do solo. A extração de ácidos graxos fosfolipídicos é uma maneira eficaz, rápida e econômica de avaliar guildas microbianas e a biomassa microbiana total por meio da identificação de biomarcadores microbianos únicos.