Um método de extração e análise de lipídios para caracterizar micróbios de solo em experimentos com muitas amostras

O objetivo deste vídeo é descrever um método que aumenta o rendimento enquanto equilibra esforço e precisão para a extração de lipídios de membranas celulares de microrganismos para uso na caracterização de lipídios totais e abundância relativa de lipídios indicadores para determinar a estrutura da comunidade microbiana do solo e estudos com muitas amostras. No campo, você deve levar em conta a heterogeneidade do solo, coletando amostras de solo de uma forma que represente seu local. Para preservar a comunidade microbiana no momento da amostragem, as amostras devem ser transportadas do campo no gelo.

Uma vez de volta ao laboratório, remova raízes e pedras e quebre os torrões por peneiramento grosso. Isso também serve para homogeneizar sua amostra. Prepare-se para a liofilização colocando subamostras em recipientes apropriados e liofilize o mais rápido possível.

Depois que os solos estiverem liofilizados, armazene em um recipiente lacrado com dessecante até a extração. É melhor armazenar solos secos no congelador a 80 graus C.As uma preparação para extração, remover solos liofilizados do armazenamento e moer. Os métodos de moagem incluem moinho de bolas, medidor de bolas ou almofariz e pilão.

Depois de moer o solo, novamente, homogeneize bem as amostras de solo e guarde no freezer. Todos os materiais de laboratório devem ser escrupulosamente limpos. Qualquer detergente, graxa ou sujeira residual pode afetar os resultados, aparecendo como um pico no cromatograma final do GC.

As extrações são realizadas em tubos de centrífuga de Teflon de 30 mililitros, que devem ser enxaguados com solvente. Adicione dois a três mililitros de hexano aos tubos e vórtice por alguns segundos. Transvasar o hexano para outro tubo e vórtice.

Dois a três mililitros de hexano podem ser usados para enxaguar em série seis tubos. Armazene os tubos enxaguados com hexano de cabeça para baixo na capela e descarte o hexano usado em um recipiente de lixo apropriado. Os copos podem ser abafados ou enxaguados com solvente imediatamente antes do uso.

O abafamento garante que a vidraria esteja limpa por oxidação de resíduos em alta temperatura. Embrulhe os copos em duas a três camadas de papel alumínio e coloque na mufla. Defina para 450 graus C e, quando o forno atingir o ponto de ajuste, leve ao forno por no mínimo 4 horas e meia.

Aguarde pelo menos uma hora para esfriar antes de retirar do forno. Rotule e pese os tubos de Teflon enxaguados com hexano. Adicione o solo em tubos centrifugados de Teflon e pese novamente a massa do solo.

Sempre faça pelo menos dois espaços em branco por lote e inclua um padrão de verificação, de preferência um solo que tenha sido extraído anteriormente, se quiser verificar se a extração funcionou corretamente. Extrações lipídicas. Prepare três pipetas de cinco a 10 mililitros para tampão fosfato, clorofórmio e metanol.

O clorofórmio é um líquido muito denso com baixa tensão superficial. Tenha cuidado para que a quantidade que você dispensa seja precisa e consistente. Mantenha a garrafa pelo menos meio cheia de líquido.

Na capela de exaustão, adicione os reagentes ao solo no tubo de Teflon na seguinte ordem: tampão fosfato, clorofórmio e metanol. Esta é a primeira extração física de lipídios do material da amostra. As receitas para soluções de reagentes estão incluídas no protocolo escrito.

As proporções de solvente e a ordem de adição são importantes para a separação adequada das fases orgânica e aquosa. Deixe os solos umedecirem após a adição do tampão antes de adicionar o clorofórmio. Se conveniente, os extratores podem ser combinados e adicionados como uma única alíquota para a segunda extração e quaisquer extrações subsequentes.

Tampe bem os tubos de Teflon e cubra para proteger da luz. Coloque-os no shaker horizontalmente, certificando-se de que estejam bem presos. Com uma configuração de velocidade alta, agite para quando a hora.

Enquanto os tubos estão tremendo, prepare dois tubos de vidro longos para cada amostra da seguinte maneira. Rotule o tubo, adicione o mesmo volume de clorofórmio que foi adicionado ao solo e um volume igual de tampão fosfato. Depois de remover os tubos de Teflon do agitador a 25 graus C, centrifugue os tubos por 10 minutos a 2.500 RPM.

Em seguida, na hotte com as luzes apagadas, decantar o sobrenadante do tubo de teflon para um dos tubos longos. A separação de fases deve ser visível no tubo de vidro. A camada inferior contém o solvente orgânico, principalmente clorofórmio, e os lipídios.

Esta extração é repetida. Despeje o sobrenadante no segundo tubo preparado anteriormente. Agora você extraiu fisicamente os lipídios do solo duas vezes.

Para a maioria dos solos, isso é adequado. Tampe com segurança todos os tubos de classe longa com tampas revestidas de Teflon e inverta 10 vezes para misturar. Separe as fases por gravidade durante a noite.

Deixe as amostras repousarem sem perturbações durante a noite para completar a separação das duas fases. Para fazer isso, mantenha as amostras em um armário escuro ou coberto com papel alumínio em temperatura ambiente. Não há problema em permitir que os extratos se separem no fim de semana.

Segundo dia, isolamento de lipídios. No segundo dia, a camada aquosa é aspirada e os lipídios concentrados removendo o solvente em um sistema de evaporação a vácuo. As amostras também podem ser secas colocando-as em banho-maria ou em banho de areia e aplicando um fluxo suave de nitrogênio.

O líquido nos tubos deve agora estar bem separado e em grande parte claro. Caso contrário, ou se a interface entre as duas camadas for especialmente espessa, permita que a separação continue por mais um dia. Configure um aspirador de vácuo no capô.

Este é um frasco de braço lateral conectado a uma bomba de vácuo com um tubo Tygon de folha e uma pipeta de pastagem. Com a bomba em funcionamento, utilizar a pipeta para retirar a fase aquosa para o balão. Aspire a camada superior e a interface.

Isso será aproximadamente 2/3 do caminho para baixo. Faça isso com os dois a três conjuntos de tubos de vidro. A camada superior pode conter algumas partículas de solo.

Remova-os, se possível. Combinar o extracto do segundo e/ou terceiro conjunto de tubos com o dos dois primeiros, decantando cuidadosamente. Tente excluir do vazamento qualquer material sólido e enxágue as paredes do tubo girando.

Use uma pipeta limpa para cada amostra e repita esse processo para as amostras restantes. Depois que os extratos de clorofórmio forem combinados e estiverem parados por alguns minutos, inspecione a superfície do líquido. Freqüentemente, uma fina camada de água residual se forma.

Se isso estiver presente, aspire antes de prosseguir. A água residual pode atacar as ligações duplas de ácidos graxos, mas uma quantidade muito pequena deve coevaporar com os solventes à medida que as amostras são secas. Seque todas as amostras com o aparelho de evaporação a vácuo.

Tampe bem os tubos e guarde no freezer a 80 graus C.Dia três, saponificação e metilação. Primeiro, ligue os banhos-maria. Verifique o nível da água e ajuste o banho um para 95 graus C e o banho dois para 80 graus C. Usando uma pipeta novamente, adicione um mililitro do reagente de saponificação, Reagente 1, aos lipídios secos.

Tampe bem, vortex brevemente e coloque em uma prateleira. Uma vez nesta etapa, coloque o rack de tubos no banho-maria a 95 graus C e aguarde cinco minutos. Remova o rack de tubos do banho e verifique se há vazamentos nos tubos.

Isso será indicado por bolhas subindo no tubo como uma espuma. Reaperte ou substitua as tampas dos tubos com vazamento. Continue aquecendo os tubos no banho-maria por mais 10 minutos.

Reduza a temperatura do banho-maria para 80 graus C e continue a incubação por mais 15 minutos. Remova os tubos e deixe esfriar colocando a grade em uma panela com água da torneira. Não use água gelada.

Depois que as amostras esfriarem, adicione dois mililitros do reagente de metilação, Reagente 2, a cada amostra. Novamente, tampe bem e vortex por cinco a 10 segundos. Os sais granulares podem se tornar visíveis como um precipitante na solução, o que acontece às vezes devido ao excesso de reagentes.

Coloque o rack no banho-maria a 80 graus C e incube por 10 minutos. Remova a prateleira de tubos do banho-maria e coloque-a em uma panela com água da torneira para esfriar. Agite o rack para acelerar o processo de resfriamento.

Usando uma pipeta novamente, adicione 1,25 mililitros de hexano e éter metil terciário butílico, Reagente 3, a cada tubo para extrair a fase. Feche bem as tampas e coloque os tubos em uma coqueteleira por 10 minutos. Depois de agitar, deixe o rack de tubos descansar por 10 minutos para que as fases se separem.

Transfira a fase orgânica, que agora é a camada superior, para um tubo de vidro curto usando uma pipeta de pastagem. É melhor recuperar a maior parte do líquido. Quantidades muito pequenas da fase aquosa não comprometem a extração.

Repita a extração da fase aquosa adicionando o Reagente 3, agitando, permitindo que as fases se separem e transferindo a fase superior. Dependendo da condição da fase inferior, você pode repetir esta mais uma vez para um total de três transferências. Adicione 3 mililitros da lavagem de base, Reagente 4, que é uma solução diluída de hidróxido de sódio, aos extratos nos tubos curtos.

Tampe bem os tubos de ensaio e vortex por 20 a 30 segundos e depois centrifugue por três minutos a 2.000 RPM. Depois de centrifugado, aspirar a fase orgânica superior com uma pipeta de pastagem limpa e transferir para um frasco âmbar de quatro mililitros. Tenha muito cuidado para não aspirar nenhuma fase aquosa.

O próximo passo é evaporar o solvente até a secura em um aparelho de evaporação a vácuo. Dia quatro, preparando os extratos para análise de GC. Usando o pipetador, adicione 100 microlitros de Reagente 3 a cada um dos frascos de 4 mililitros contendo a fase seca.

Vortex a amostra e deixe-a repousar por 10 minutos. Usando o segundo pipetador, transfira cuidadosamente os FAMEs suspensos para um frasco de GC. Adicionar uma outra alíquota do solvente ao frasco para injetáveis de quatro mililitros e vórtice brevemente.

Role o frasco para injetáveis para garantir que os FAMEs residuais nas paredes do frasco para injetáveis são dissolvidos. Usando o segundo pipetador novamente, transfira o solvente para o frasco para GC. Complete a transferência adicionando uma terceira alíquota de solvente ao frasco, vórtice e transferindo para o frasco para GC.

Tampe o frasco para injetáveis de GC e guarde no congelador. Armazene os frascos de GC selados no freezer antes da análise. Análise de GC.

Para utilizar este sistema, a análise deve ser realizada utilizando uma coluna GC específica. O cromatógrafo de fase gasosa está equipado com uma entrada dividida sem divisórias equipada com um revestimento de entrada de vidro de quatro milímetros de diâmetro interno com um tampão de lã de vidro desactivado. A entrada é ajustada para 250 graus C e é operada em modo de pressão constante.

O gás transportador é o hidrogênio. Nitrogênio e ar são necessários como gases de suporte do detector. Uma coluna Agilent Ultra 2 é usada.

A coluna tem 25 metros de comprimento com um diâmetro interno de 2 milímetros e uma espessura de filme de fase estacionária de 33 micrômetros. A fase estacionária nesta coluna é 5% fenil, 95% metilpolissiloxano, também conhecida como coluna do tipo DB-5. Para analisar os extratos lipídicos, uma alíquota de dois microlitros é injetada em uma proporção de divisão de 100: 1 com a temperatura do forno a 170 graus C.Post injeção, o forno é programado para aumentar a cinco graus por minuto até 300 graus C e depois manter por 12 minutos.

Uma série de injeções do padrão MIDI são feitas e os resultados são usados para fazer ajustes de acordo com as instruções do manual MIDI. Uma vez calibrado dessa maneira, o sistema pode precisar de pequenos ajustes ocasionalmente, mas geralmente deve obter bons resultados usando esses parâmetros. O sistema MIDI produz um relatório para cada amostra contendo uma tabela com uma linha por pico realizado.

O software relata o tempo de retenção de pico, a área de pico, a identificação de pico, juntamente com ECL ou comprimento estimado da cadeia, um parâmetro usado para identificação de pico, e um fator de resposta, um parâmetro usado para normalizar as variações e a resposta do detector em relação ao tempo de retenção. O ECL expressa onde, entre uma série de FAMEs de cadeia reta, cada FAME desconhecido elui. Assim, por exemplo, se o tempo de retenção de uma incógnita elui a meio caminho entre os de uma cadeia de 12 e 13 carbonos, o ECL é relatado como uma cadeia de 12,5 carbonos.

O software compara o ECL de cada pico com os dos FAMEs em um banco de dados e, onde ocorrem correspondências, atribui o nome correspondente ao desconhecido. Para casos em que dois FAMEs no banco de dados têm ECLs muito próximos, o software relata os dois nomes listando o mais próximo primeiro. As tabelas de dados dos relatórios podem ser agrupadas em uma planilha ou banco de dados.

Após o ajuste para o fator de resposta, as áreas de pico podem ser comparadas com a área de pico de um padrão externo ou interno para chegar a uma concentração do extrato. Dividindo-se pela massa de solo extraído, os dados podem ser expressos como massa de FAME por grama de solo ou, usando também o peso molecular de cada FAME, como nanomoles por grama de solo. Os FAMEs de biomarcadores podem então ser somados para produzir biomassa de guildas microbianas, e essas guildas podem ser analisadas posteriormente.

Por exemplo, aqui vemos pradarias não fertilizadas com mais biomassa FAME do que pradarias fertilizadas. Ambos têm mais biomassa do que os campos de milho próximos. Além disso, os FAMEs estão associados a grupos funcionais específicos, como fungos ou bactérias.

Essas associações são específicas do ecossistema, por isso é importante não generalizá-las demais. Esse tipo de análise mostra se certos grupos são mais abundantes em determinados ambientes. Aqui, os fungos são mais abundantes na pradaria não fertilizada do que no campo de milho.

E, finalmente, outra maneira de olhar para a composição geral da comunidade microbiana é comparar observando a abundância relativa de todos os FAMEs de uma só vez usando métodos de ordenação como escala multidimensional não métrica, NMDS ou análise de componentes principais, PCA. Em uma ordenação, as comunidades microbianas mais semelhantes estarão mais próximas. Portanto, a partir de nossos dados de exemplo, o milho e a pradaria não fertilizada estão muito distantes, enquanto algumas amostras de pradaria fertilizadas têm comunidades microbianas que se assemelham às do milho e outras se assemelham à pradaria não fertilizada.

As comunidades microbianas costumam ser altamente variáveis, mesmo dentro de um ambiente, portanto, nem sempre se separam perfeitamente. Depois de assistir a este vídeo, deve-se ter uma boa compreensão do processo pelo qual os biomarcadores lipídicos das membranas celulares dos microrganismos são extraídos do solo. A extração de ácidos graxos fosfolipídicos é uma maneira eficaz, rápida e barata de avaliar as guildas microbianas e a biomassa microbiana total por meio da identificação de biomarcadores microbianos exclusivos.